MTERF1基因真核表达载体的构建及其在C-33A细胞中的表达研究

采用PCR技术从pGEM-MTERF1重组克隆载体中扩增出人MTERF1基因cDNA的开放阅读框序列,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后,以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1;通过PCR、双酶切和DNA测序方法对重组子进行鉴定;将重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1转染C-33A细胞,利用免疫印迹法检测MTERF1蛋白的表达。结果显示,重组质粒pcDNA3.1(+)-MTERF1经双酶切鉴定和菌落PCR鉴定均获得大小为1 200 bp的目的条带,DNA测序结果表明该序列与GenBank中人MTERF1基因序列完全相同,插入基因的大小和方向正确;免疫印迹结果表明,MTERF1蛋白的表达水平在转染pcDNA3.1(+)-MTERF1的C-33A细胞中表达高于转染pcDNA3.1(+)的C-33A细胞。通过对人MTERF1基因的真核表达载体的构建,为进一步研究人MTERF1基因的功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及真核表达质粒pIRES-Ag85B的构建

目的:克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,为进一步研究其在开发新型的结核病疫苗和结核病免疫诊断试剂奠定了基础。方法:采聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因,然后用双内切酶消化PCR产物和pIRES质粒,用T4 DNA连接酶连接后,转化入感受态E.coli DH5a,产物铺AmpR抗性的平板,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定并进入blast网页比对测序的序列。结果:酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序比对后结果与目的基因完全一致,证实符合表达框架。结论:成功地克隆并构建Ag85B基因的真核重组表达质粒pIRES-Ag85B。     

大鼠csrp2基因真核表达质粒的构建及表达

获得大鼠csrp2,基因片段并构建真核表达载体.RT-PCR法从大鼠心脏组织中提取总 DNA,并扩增出相应大小的csrp2 DNA片段,测序正确后克隆入真核表达载体pcDNA 3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染Cos-7细胞,分别以RT-PCR 方法检测mRN-表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果构建了重组质粒pcDNA 3.1(-)-csrp2,RTPCR结果证明csrp2,可在cos-7细胞中转录,用间接免疫荧光检测,表达有CRP2蛋白的细胞着染.成功构建了大鼠csrp2基因的真核表达载体pcDNA 3.1(-)-csrp2,csrp2,基因可以在Cos-7细胞中表达.     

SV40T/pcDNA3.1重组质粒的构建及在肝细胞中的表达

构建重组质粒SV40T/pcDNA3.1,为建立永生化肝细胞系奠定基础。pcD2质粒经BamH Ⅰ单酶切获得SV40T基因片段,并将其捕入pcDNA3.1载体,经酶切鉴定证实,SV40T基因片段已成功插入载体中,采用常规方法分离培养肝细胞,用SV40T单克隆抗体进行间接免疫荧光检测,验证其在肝细胞中的表达。     

人乳头瘤病毒11型E7 DNA疫苗质粒的构建和鉴定

目的 构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7 DNA疫苗质粒．方法 从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板，采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV11-E7基因，将E7基因经双酶切后定向克隆到pcDNA3．1( )中，测序鉴定．结果从病变组织中扩增出了全长HPV11-E7基因，并正向插入载体pcDNA3．1( )中，经酶切和测序鉴定无误．结论 HPV11-E7 DNA疫苗质粒构建成功，为今后进行防治尖锐湿疣的动物实验和临床实验奠定了基础．     

汉坦病毒G1S0.7嵌合基因真核载体的构建及表达

构建含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的真核重组质粒,并在真核细胞中有效表达.从本室前期构建并经测序的重组质粒pShuttle-G1S0.7上双酶切回收得到片段G1S0.7后,克隆入真核表达载体pVAX,并将其通过脂质体介导转染HEK293细胞,表达产物用ELISA和Western-blot进行鉴定.酶切鉴定结果表明,成功构建了含汉坦病毒嵌合基因G1S0.7的重组质粒pVAX-G1S0.7; ELISA检测结果和Western-blot结果显示,汉坦病毒G1S0.7嵌合基因在HEK293细胞中得到了表达,所表达的融合蛋白分子量约90kD,与预期大小一致,并且表达产物可与抗汉坦病毒NP mAb特异性结合.说明所构建的表达载体可在真核细胞中表达出与汉坦病毒抗体有特异性结合活性的融合蛋白,为下一步基因免疫及进一步筛选HFRS基因疫苗候选组分提供实验依据.     

谷子乙酰辅酶A羧化酶BC功能域的克隆及原核表达载体的构建

根据已知的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)序列设计合成了1对引物,对ACCase基因的BC功能域进行扩增,所得产物与预期片段大小一致,约1.8kb。该片段与克隆载体PGEM TEase连接,转入感受态大肠杆菌DH5а中增殖。提取质粒进行PCR鉴定,将阳性克隆与原核表达载体PQE30分别用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后回收目的片段进行连接,并转入感受态大肠杆菌M15中,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。     

胰岛自身抗原GAD65片段和胰岛素B链基因共表达DNA疫苗的构建与表达

构建两种胰岛自身抗原谷氨酸脱羧酶（ glutamic acid decarboxylase, GAD） 65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗,并检测其在体外COS-7细胞中的表达。PCR方法从GAD65质粒中扩增出GAD190-385和GAD490-570两个片段的cDNA,overlap法再分别与信号肽基因进行拼接,将拼接后的融合基因SGAD190-515和SGAD490-570分别与胰岛素B链基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCFA．1中。重组质粒经酶切和测序鉴定后,脂质体体外转染COS-7细胞,Western blot方法检测目的基因在该细胞中的表达。结果表明核酸序列测定克隆的融合基因和胰岛素B链基因序列与报告序列一致,开放阅读框正确,Western blot显示转染了DNA疫苗的COS-7细胞中均可检测两个目的基因的表达。两种GAD65片段与胰岛素B链基因共表达DNA疫苗均成功构建,为自身免疫糖尿病的免疫干预研究奠定了实验基础。     

一种新细胞因子基因真核表达载体的构建和鉴定

采用PCR方法,以人胎盘cDNA文库为模板,扩增出人B淋巴细胞刺激因子（hBLys）,经克隆测序及纯化后,再以此PCR产物为模板,用Nest-PCR方法进一步扩增得到B淋巴细胞刺激因子的胞膜外功能区域（hsBLyS）的DNA片段,纯化、克隆测定鉴定后,扩增并纯化粒,经酶切、纯化后克隆到真核表达质粒pcDNA3.1（＋）中,构成真核表达载体pcDNA3．1（＋）／hsBLyS。结果表明：用此方法制备得到的hsBLyS的DNA片段经测序鉴定与文献报道相符,构建的真核表达载体经鉴定也达到了预计的结果。     

全长人lrp基因及其截短和定点突变体真核表达载体的构建

为了对脂多糖应答基因（lrp）的功能进行深入的研究,实验用PCR及双PCR法扩增出lrp基因的截短体（lrp△C）和突变体（lrpm）序列,测序正确后将正常lrp基因及其截短体和突变体序列均连入真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-lrp、pcDNA3．1（＋）-lrp△C和pcDNA3．1（＋）-lrpm。DNA测序结果显示,PCR反应成功得到了lrp基因的截短体和突变体序列;重组质粒酶切鉴定结果显示：人lrp基因及其截短体、突变体成功连入了真核表达载体pcDNA3．1（＋）。     

鹅源腺病毒全基因组DNA酶切片段的克隆

利用1株鹅源腺病Y81G4株,经鹅胚增殖后收获尿囊液,用差速离心法纯化病毒子并提取病毒基因组DNA,病毒DNA经Hind Ⅲ酶切后共产生10个片段,分别回收各酶切片段,与经Hind Ⅲ单酶切的pUC18连续,获得8个不同的重组质粒。对于未克隆到的两末端片段,经碱处理去除末端蛋白后,以平端和HindⅢ粘端与经SmaⅠ和 HindⅢ双酶切的pUC18连接,获得了重组质粒pGAHC和pGAHI。克隆的各酶切片段,通过酶切电泳和Southern blotting结果鉴定,证明已分别克隆到该病毒基因组DNA HindⅢ酶切片段,且各酶切片段大小之和约为32．9kb.     

拟南芥抗旱相关基因的表达载体构建及转基因植株鉴定

文章以拟南芥Col-0植株的基因组DNA和cDNA为模板扩增出LWT2基因全长和CDS片段,用pEASY-Blunt Zero Cloning Kit试剂盒连接至中间载体,转化到Trans1-T1感受态细胞内,通过单克隆挑选、菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)鉴定及质粒测序验证获得DNA阳性克隆。利用限制性内切酶双酶切获得含有黏性末端的目的片段和载体片段,进行DNA连接反应可得最终的互补和过表达构建。提取质粒DNA测序确认后将2个构建分别转化至农杆菌菌株GV3101,菌落PCR鉴定后通过浸花转化法转化拟南芥lwt2-1突变体植株,最后通过转基因筛选与遗传鉴定获得相应构建的转基因阳性植株。     

重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因及其重组质粒构建

目的:利用重叠PCR-酶切连接法人工合成风疹病毒E1基因的全长序列.方法:对风疹E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠PCR法分别合成该基因的3个片段,测序鉴定后以酶切连接法将各段拼接成全长为1 443 bp的RV rE1,将E1基因的全长序列克隆导入原核表达载体pET32a.结果:分别进行8轮、5轮和6轮的重叠PCR扩增,合成风疹基因3个片段;以酶切连接法将3个片段拼接成全长rE1基因并克隆入pET32a构建成载体pET32-RV rE1,PCR、酶切和测序鉴定结果表明,合成的E1基因大小、序列与预期相符;构建获得重组质粒pET32-RV rE1.结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因并构建其重组质粒pET32-RV rE1.     

小鼠白细胞介素-18的克隆及真核表达质粒的构建

克隆小鼠白细胞介素-18（mIL-18）,并与真核表达质粒pcDNA3.1/HisB重组,构建真核表达重组质粒.采用RT-PCR,从小鼠肝细胞中扩增IL-18的全长cDNA.经Hind Ⅲ,EcoR Ⅰ双酶切,将该cDNA片断插入表达载体pcDNA3.1/HisB.通过酶切、PCR及测序对重组体进行鉴定.经鉴定,重组质粒构建正确,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/mIL-18,为下一步进行IL-18的功能研究奠定了基础.     

Egr-1基因反义干扰表达载体的构建与鉴定

为构建可在人肝癌细胞中稳定表达Egr-1基因短发夹RNA(shRNA)的表达载体,设计合成Egr-1基因shRNA片段,连接到经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pGreenPuro~(TM)shRNA真核表达载体中,连接产物转化大肠杆菌后挑取阳性菌落扩大培养,经菌液PCR法初步鉴定为pGreenPuro-Egr-1shRNA重组子的重组子DNA,用测序法进一步鉴定,结果显示成功构建了Egr-1基因shRNA的反义干扰表达载体pGreenPuro-Egr-1shRNA.     

人类8型疱疹病毒K1基因真核表达载体的构建

为构建人类8型疱疹病毒(Human herpesvirus 8,HHV-8)K1基因的真核表达载体,采集卡波氏肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS)患者血清,采用柱式病毒DNA抽提试剂盒抽提血清中的病毒DNA,采用套式PCR技术检测HHV-8的特异性片断KS330233以判断是否得到了HHV-8 DNA,采用PCR技术扩增HHV8 K1基因并纯化回收,酶切、连接入真核表达载体pcDNA3.1,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆pcDNA3.1/HHV8-K1扩增后,提取质粒,进行双酶切和DNA测序鉴定.结果显示采集了经典型KS血清3例,提取了血清HHV-8DNA,扩增了特异性片断KS330233,测序结果正确提示我们得到了HHV8 DNA,扩增了HHV8 K1基因,构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性.由此可知:成功构建了pcDNA3.1/HHV8-K1真核表达载体,为进一步研究该基因的功能奠定良好的实验基础.     

极端嗜热厌氧纤维素分解菌基因文库的构建及其内切葡聚糖酶基因片段的克隆

以从云南邦拿掌温泉中分离、纯化的高温厌氧纤维素分解菌邦2菌(Cadicellulosiruptor)为材料,制备其总DNA,经限制性核酸内切酶EcoRⅠ部分酶切后,在T4DNA连接酶的作用下与经EcoRⅠ完全酶切、去磷酸化的质粒载体pUC18连接,然后转化E.coliJM109,建立了邦2的基因文库,经筛选鉴定得到6.3×103个重组子;重组子经刚果红平板验证:约有23.5%菌落呈现透明圈;重组子经EcoRⅠ酶切验证显示:重组质粒均含有外源DNA插入片段.结果表明已克隆到邦2菌纤维素酶系中的内切葡聚糖酶基因(ED基因)片段.     

禽类多瘤病毒APV-1的cDNA病毒突变体构建

为进一步研究禽类多瘤病毒晚期基因多顺反子翻译调控的分子机制,设计和构建了与野生型病毒APV-1相同的在AUG位点有agno-1a突变区和7个插入氨基酸的新型重组病毒.用碱裂解法提取了APV-1 cDNA克隆pHL1003,全长线性目的片段由Acc I部分酶切后回收,再用T4连接酶将合成的agno插入片段磷酸化后与目的片段连接得到了重组质粒,最后转化至E.coli DH10b感受态细胞中筛选阳性克隆.经PCR,PAGE和DNA测序验证获得了APV-1突变cDNA克隆.