星形胶质细胞对氨引起培养胚鼠大脑神经元形态改变的影响

研究氨对培养神经元形态的影响及星形胶质细胞与神经元形态改变的关系。应用胚鼠神经元纯培养、神经元与星形胶质细胞的混合培养及联合培养技术，结合ＨＥ和免疫组化染色，观察神经元的形态改变。应用定量分析比较不同培养条件下神经元的存活率。结果：①氨可引起神经细胞的肿胀，空泡变和颗粒变及坏死脱落；②神经元的病变与星形胶质细胞的病变严重程度呈正相关，７０．８％的形态正常神经元分布在病变较轻的星形胶质细胞领近；③混合组中神经元的存活率明显高于神经元纯培养组（Ｐ＜０．０１），而联合培养组细胞的变性坏死最轻。结论：氨对培养的神经细胞具有直接毒性作用，而星形胶质细胞对神经元有部分保护作用，成熟的星形胶质细胞的保护效应更强。     

原代培养神经细胞的乙酰胆碱脂酶染色技术

原代培养神经细胞的乙酰胆碱脂酶染色技术包峰，高杰，李永明（脑研究所神经解剖研究室）关键词原代培养，神经元，乙酰胆硷脂酶类，染色体外培养神经细胞是神经学研究的重要手段之一。培养神经细胞的乙酰胆碱脂酶（Ａｃｅｔｙｌ－ｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ，ＡｃｈＥ...     

谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋毒作用的研究

为更清楚地了解药物对神经元的损伤和保护作用，在体外对新生大鼠（０～１ｄ）海马神经细胞进行原代培养，建立了谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋性神经毒损伤模型。通过检测神经细胞乳酸脱氢酶泄漏率和在相差显微镜下对神经细胞形态变化的观察，发现只有发育成熟的神经元对谷氨酸兴奋毒损伤最敏感，神经元的兴奋毒损伤对谷氨酸在一定范围内有剂量依赖性或接触时间依赖性关系，提示谷氨酸通过与其受体结合造成神经元兴奋毒损伤。     

谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋毒作用的研究

为更清楚地了解药物对神经元的损伤和保护作用，在体外对新生大鼠（０－１ｄ）海马神经细胞进行原代培养，建立了谷氨酸对原代培养海马神经细胞兴奋性神经毒损伤模型。通过检测神经细胞乳酸脱氢酶泄漏率和相关显微镜下对神经细胞形态变化的观察，发现只有发育成熟的神经元对谷氨酸兴奋毒损伤最敏感，神经元的兴奋毒损伤对谷氨酸在一定范围内有剂量信赖性或接触时间依赖性关系，提示谷氨酸通过与其受体结合造成神经元兴奋毒损伤。     

重组Leptin干预对新生鼠下丘脑中STAT3磷酸化蛋白表达的影响

目的：观察重组Leptin干预对原代培养的新生大鼠下丘脑神经元STAT3磷酸化蛋白的表达的影响。探讨Leptin干预及STAT3的磷酸化在肥胖发生中的可能作用，以期更加深入的研究肥胖症发生的中枢信号转导机制。方法：取新生5～7天SD大鼠下丘脑神经元，分散培养，观察下丘脑神经元的形态和NSE免疫染色鉴定活性；培养7天后。Leptin（100ng／ml培养液）干预24h，免疫细胞化学染色检测下丘脑神经元STAT3和磷酸化STAT3蛋白的表达情况。结果：新生大鼠下丘脑培养神经细胞接种时为圆形，逐渐贴壁、伸出突起；培养7～10天，神经细胞生长良好，细胞胞体逐渐增大。胞核和核仁清晰可见。神经元多数为突起多极细胞。神经细胞NSE染色呈阳性。胞浆和突起被染成棕色；而非神经细胞呈阴性反应。无Leptin干预时．下丘脑神经元胞浆和胞核内STAT3蛋白表达呈阳性，而磷酸化STAT3蛋白呈阴性表达。Leptin干预24h后，培养下丘脑神经元的胞核和胞浆内均有磷酸化STAT3蛋白的表达，呈棕黄色。STAT3蛋白表达仍为阳性。结论：重组Leptin干预可以影响培养的下丘脑神经元中STAT3磷酸化蛋白的表达，并增强其活性。     

原代培养脊髓神经元神经丝蛋白NF-H表达与免疫电镜观察

目的：研究原代培养脊髓神经元NF—H表达及免疫电镜的分布，为神经丝结构异常所致的神经疾病奠定实验基础。方法：采用神经细胞培养技术、免疫组织化学与免疫电镜技术，进行原代培养脊髓神经元的神经丝蛋白NF—H的表达，并用图像分析仪对NF—H表达进行了定量分析测定。结果：原代培养脊髓神经元中，神经丝蛋白的NF—H的表达，随细胞发育的逐渐成熟呈日趋上升趋势。免疫电镜观察可见神经丝蛋白呈电子密度高的丝絮状沉淀，均匀分布在细胞质中，在突起中呈束状排列。结论：神经丝蛋白的NF—H表达的增加，伴随着神经元的发育初期到成熟的形态结构变化，与培养时间成正相关。     

氨对体外培养大鼠神经细胞毒性的研究

目的:研究氨对不同神经细胞的形态学和存活率的影响。方法:体外培养大鼠皮层神经元、星形胶质细胞、混合神经细胞。取培养成熟的细胞分组,加入含不同浓度NH4Cl的无血清DMEM,培养24h观察形态学变化。MTT法测定细胞存活率。结果:随着培养环境NH4Cl浓度升高,神经元水肿,胞浆出现黑色颗粒,细胞核不清,突起僵硬屈曲,回缩消失,可见黑色颗粒状膨大,直至大量死亡。神经胶质细胞分布密度减低,水肿,脱壁,坏死。混合神经细胞的形态学改变主要以细胞水肿为主。星形胶质细胞水肿脱壁,影响神经元生长。MTT细胞存活率测定结果说明,随着培养环境NH4Cl浓度升高,所研究神经细胞存活率均逐渐降低,且与NH4Cl终浓度呈显著负相关。结论:氨对神经细胞的形态学影响以细胞水肿为主,神经细胞的存活率均与NH4Cl终浓度呈显著负相关。星形胶质细胞对氨毒性比神经元更为敏感。     

高碘对原代培养的大鼠皮层神经元细胞凋亡影响的实验研究

目的研究高碘对原代培养的大鼠皮层神经元细胞凋亡的影响，并对其机制作初步探讨。方法采用体外新生大鼠皮层神经细胞培养法观察不同浓度的碘化钾对神经细胞凋亡及其一氧化氮（NO）含量及一氧化氮合酶（NOS）活性的影响。结果高碘可以诱发原代培养的大鼠皮层神经元细胞发生凋亡，细胞凋亡率随碘化物浓度的升高而升高，实验组细胞的NO含量及NOS活性较正常对照组增高。结论高碘可以诱导原代培养的大鼠皮层神经元细胞发生凋亡，并呈剂量依赖关系，其机制可能与NOS活性及NO含量增高有关。     

基膜粘连蛋白和IV型胶原对培养脊髓神经细胞突起生长的作用

目的：观察基膜粘连蛋白和IV型胶原在体外培养条件下对脊髓神经细胞突起生长的作用．方法：用基膜粘连蛋白和IV型胶原包被培养板，以结合了相应抗体的培养板及包被I型胶原和多聚赖氨酸的培养板为对照，将培养的脊髓细胞以相同浓度加入各组培养板内．培养5d后将各组细胞进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组化染色，利用计算机图像分析技术测定各组神经元突起的长度并进行统计学分析．结果：免疫组化染色可见各组均有较多的神经细胞及其突起生长，统计分析结果表明基膜粘连蛋白组与IV型胶原组间神经元突起生长长度无显差异，基膜粘连蛋白组神经元突起生长长度长于其它各组．IV型胶原组神经元轴突生长长度与I型胶原组间无显差异，与多聚赖氨酸组有显性差异．基膜粘连蛋白组和IV型胶原组神经元轴突生长情况优于相应的抗体组．结论：基膜粘连蛋白和IV型胶原均可促进脊髓神经元突起的生长。     

体外培养胆碱能神经元的乙酰胆碱酯酶组化染色

体外培养神经细胞是神经生物学中研究神经细胞发育再生的一种重要手段。但胆碱乙酰化酶免疫组化法价格昂贵，我们采用乙酰胆碱酯酶组化方法同样能清晰显示胆碱能神经元的生长发育情况。本文对体外培养神经细胞的ＡｃｈＥ组化染色的方法要点，时间控制及其原理进行了讨论，并与鼠脑切片标本ＡｃｈＥ组化法作比较分析。     

小鼠肾组织体外培养的研究

目的通过观察胚龄12、14、16天胎鼠和生后1天的仔鼠的后肾组织体外培养的存活发育情况,与同期在体比较,建立能模拟体内生存环境稳定的肾组织培养模型。方法采用体外培养倒置显微镜观察,光镜连续切片技术结合体视学定量分析方法,观察、检测培养后肾组织的存活情况以及培养前后肾脏皮质的发育状况。结果对同一胚（日）龄小鼠后肾组织随培养时间逐渐发育,直至成熟;且随胚（日）龄的增加,肾组织块存活比率逐渐下降,肾脏皮质的发育呈下降趋势。结论小鼠后肾组织体外培养胚（日）龄越小其存活发育情况越好,E12天取材培养的肾组织与在体发育一致,利用微孔膜肾组织培养是一种简便有效的神经组织体外培养方法。     

大鼠胚胎脊髓神经细胞的原代培养及其神经营养素受体表达的初步研究

目的：建立哺乳动物胚胎脊髓神经细胞体外培养的细胞模型，提高培养用脊髓神经细胞的产率以及活性，使实验的细胞模型有良好的一致性和可比性。方法：18d的大鼠胚胎的脊髓经取材、分离、消化后作原代细胞培养，从细胞形态学及细胞计数角度观察细胞生长与分化过程。应用免疫细胞化学技术，观察了神经营养素受体TrKA、TrKB、TrKC在脊髓神经细胞的表达。结果：大鼠胚胎的脊髓神经细胞在体外条件下，可良好存活并有正常的表型分化，TrKA、TrKB、TrKC在细胞膜上呈阳性反应。其细胞数量(集落数)与形态以及存活周期可满足体外实验的基本要求。结论：这种分离培养方法简便、成功率高、稳定性强、细胞产量高且质量好，有助于离体研究的开展。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

组织工程—体外重建人体组织

全部或部分重建皮肤、肝、骨髓、神经等组织一直是基础研究、临床医学和生物工程领域的科学家们所追求的目标，动物细胞与组织体外培养技术的发展使之成为可能。本文主要综述组织工程的研究现状，应用及存在的问题。     

哺乳动物睾丸生精细胞的体外培养

哺乳动物精子发生是一个十分复杂的过程,影响因素众多,体外培养生精细胞一般有组织培养和细胞培养两类方法,目前,已有生精细胞成功地在体外从细线期精母细胞经2次减数分裂分化为精子细胞的报道,但 精原细胞的分化和精子细胞的成熟仍是两个难点,建立生精细胞体外培养模型有助于研究精子发生的调控机制,可用于辅助生育技术,治疗精子发生阻滞的患者,对精子发生机制的进一步阐明,也会促进生精细胞体外培养研究的发展。     

人胚胎脊髓背根雪旺氏细胞的培养

目的探索人胚胎雪旺氏细胞的分离、培养和纯化的方法,为将来雪旺氏细胞移植奠定基础。方法从胎儿脊髓背根中分离培养雪旺氏细胞,利用雪旺氏细胞与纤维母细胞的不同贴壁特性,综合利用酶消化、时间差和阿糖胞苷抑制等方法,达到分离和纯化人雪旺氏细胞的目的。结果雪旺氏细胞大部份呈梭形,两端有突起,少数呈多角形。免疫组化示这些细胞呈S-100抗原阳性,细胞纯度达99%。结论本方法分离、培养的人雪旺氏细胞纯度高,是一种有效的培养方法。     

改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞

目的应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞。方法15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型。结果α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。结论结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞。     

施万细胞培养与纯化研究进展

施万细胞是组织工程修复损伤神经的种子细胞,获得大量且高纯度的施万细胞对组织工程学至关重要。施万细胞的培养纯化技术日趋完善,近年来出现了三维培养,纯化方法为免疫选择法、抗有丝分裂法、神经刺激因子法等,最近比较新的提纯方法有磁性活细胞纯化法、条件培养基纯化法、层粘连蛋白纯化法等。施万细胞的培养和提纯方法已取得初步进展,目前尚有许多问题有待解决,如周期长、细胞活性低、在传代培养中细胞生物学特性不稳定等。     

5-氮胞苷对贵州小型猪淋巴细胞DNA损伤及修复的影响

应用组织块静置培养法建立成年水牛晶状体上皮细胞的离体培养方法,通过细胞计数法、MTT法和透射电镜法观察,对晶状体上皮细胞的离体培养和冻存复苏的可行性进行研究,结果显示离体培养和冻存复苏后的晶状体上皮细胞生长良好且二者无显著差异(P>0.05),并保持了原有上皮细胞的特性及细胞结构。提示组织块静置培养法是适宜的晶状体上皮细胞培养方法,液氮冷冻可有效地保存晶状体上皮细胞。     

应用旋转灌注式生物反应系统体外构建组织工程神经的研究

目的：模拟微重力建立体外构建组织工程神经的方法,评价微重力环境对支持细胞生长的影响。方法：将皮肤前体细胞诱导分化的施万细胞作为支持细胞,联合壳聚糖神经导管、聚乳酸乙醇酸共聚物纤维支架,利用旋转灌注式生物反应系统体外培养,对照组为传统的静止培养。培养不同时间点取样,利用结晶紫染色,免疫荧光细胞化学染色,CCK-8细胞活力检测,扫描电子显微镜等方法观察支持细胞的生长状况。结果：体外培养7天后CCK-8细胞活力检测提示贴附在导管和纤维支架表面的细胞数量最多、活力最好,应用旋转灌注式生物反应系统体外培养较对照组高出约2倍,随后在14天、21天时略有下降;结晶紫染色及扫描电子显微镜观察显示7天时,与对照组相比,实验组支持细胞呈立体生长,分泌大量细胞外基质,生长状态更好;S100荧光免疫细胞化学染色显示微重力环境下施万细胞的标志物未发生改变。结论：模拟微重力环境较传统静止培养能更高效、优质地在体外构建组织工程神经。