JAK激酶抑制剂AG490联合5-氟尿嘧啶抑制结肠癌细胞STAT3信号转导通路的研究

目的 探讨STAT3信号转导通路在药物治疗结肠癌中的作用机制。方法 应用JAK激酶抑制剂AG490与5-氟尿嘧啶(5-Fu)处理结肠癌细胞HCTll6，Western blot检测JAK2／STAT3信号转导通路成员表达，MTT法检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。结果 AG490与5-Fu可以抑制结肠癌细胞增殖，促进结肠癌细胞凋亡，联合应用AG490与5-Fu可以起协同作用，结肠癌细胞STAT3信号转导通路成员表达与活性明显下降。结论．IAK激酶抑制剂AG490与5-Fu联合应用可能为治疗结肠癌提供了新的理论基础。     

JAK2激酶抑制剂AG490对胃癌细胞侵袭的影响

目的　观察JAK2激酶抑制剂AG4 90对胃癌细胞侵袭以及对基质金属蛋白酶类(MMPs)、组织型基质金属蛋白酶抑制物 (TIMPs)表达的影响 ,探讨STAT3信号转导通路在胃癌侵袭转移调控中的作用。方法　应用JAK2激酶抑制剂AG4 90处理胃癌BGC 82 3细胞 ,Matrigel肿瘤体外侵袭模型检测肿瘤细胞侵袭 ;Westernblot检测STAT3、MMP 2、MMP 9蛋白表达及活性 ;RT PCR检测MMPs、TIMPsmRNA的表达。结果　AG4 90可抑制JAK2 /STAT3信号转导通路活化及胃癌BGC 82 3细胞侵袭 ,在此过程中AG4 90在mRNA和蛋白水平抑制MMP 2和MMP 9表达 ,同时上调TIMP 1、TIMP 2mRNA的表达。结论　STAT3信号转导通路参与胃癌细胞侵袭调控 ,阻断STAT3通路活化可以抑制胃癌细胞侵袭 ,这一作用可能是通过抑制MMP 2和MMP 9表达以及上调TIMP 1和TIMP 2表达实现的。     

JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路对结肠癌细胞增殖迁移的影响

目的探讨JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路在结肠癌细胞增殖迁移中的作用。方法应用JAK2抑制剂AG490处理人结肠癌Lovo细胞株。采用MTT法进行细胞增殖实验：采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力;用免疫荧光染色和Western blot检测Lovo细胞中波形蛋白和磷酸化STAT3（P—STAT3）的表达水平。结果AG490处理后,Lovo细胞增殖明显受到抑制．且呈剂量依赖性和时间依赖性（P〈0．05）。细胞划痕后24h,AG490处理组（实验组）的细胞划痕宽度恢复20％,而对照组划痕宽度恢复60％（P〈0．05）。实验组Lovo细胞中P—STAT3和波形蛋白蛋白表达明显降低（P〈0．05）。结论JAK2-STAT3-波形蛋白信号通路参与调控人结肠癌细胞的增殖和迁移。     

阻断信号传导和转录活化因子3对胶质瘤细胞侵袭性特征的影响

目的 观察用AG490阻断人胶质瘤细胞株中信号传导和转录活化因子3(STAT3)信号通路对肿瘤细胞侵袭性特征的影响.方法 体外培养的人胶质瘤U251、U87细胞株,应用AG490阻断STAT3信号通路;以Western blot检测STAT3和其激活状态p-STAT3蛋白在AG490作用前后的表达情况;通过Transwell细胞侵袭实验了解肿瘤细胞体外侵袭能力的变化;用明胶酶谱法检测肿瘤细胞基质金属蛋白酶(MMP-2、MMP-9的表达;用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)了解血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的变化.结果 AC490作用后胶质瘤细胞内p-STAT3表达下降,其程度随AG490浓度升高而增强,差异有统计学意义(P<0.01).而STAT3蛋白的表达不受AG490影响,与对照组比较差异无统计意义(P>0.05),说明AG490的作用机制是通过抑制STAT3蛋白的磷酸化激活过程从而阻断STAT3信号通路.AG490作用后,U251细胞的体外侵袭力下降,差异有统计学意义(P<0.01).STAT3信号通路阻断后,胶质瘤细胞MMP-2、MMP-9的表达下调,差异有统计学意义(P<0.01).VEGF mRNA表达也相应下降(P<0.05).结论 应用AG490阻断STAT3信号通路能够抑制胶质瘤细胞的体外侵袭能力,STAT3信号通路有可能成为控制胶质瘤侵袭性生长的有效靶点.     

白细胞介素6促胆囊癌细胞增殖、侵袭与JAK/STAT3信号通路的关系

目的:探讨炎症因子白细胞介素6(IL-6)对胆囊癌细胞生物学行为的影响及其与JAK/STAT3信号通路的关系.方法:将胆囊癌细胞株GBC-SD用IL-6或IL-6+AG490(JAK/STAT3通路抑制剂)作用后,分别用MTT法检测增殖情况;Transwell法检测侵袭能力;明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶9(MMP-9)活性;Western blot法检测磷酸化STAT3(p-STAT3)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达.结果:IL-6(10,50,100 ng/mL)作用后,GBC-SD细胞增殖呈浓度依赖性增加(均P＜0.05),AG490能取消IL-6对细胞增殖的促进作用.IL-6作用GBC-SD细胞后,细胞侵袭能力及MMP-9的分泌明显增加(均P＜0.05),细胞p-STAT3和VEGF的表达明显上调,加入AG490后,以上作用均被取消.结论:IL-6能促进胆囊癌细胞的增殖通和侵袭,其作用可能与其活化JAK/STAT3信号通路,从而上调下游的MMP-9和VEGF的表达有关.     

信号传导阻滞剂AG490抑制膀胱癌细胞生长的研究

目的:观察信号传导阻滞剂AG490对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨通过药物阻断STAT3信号转导通路在治疗膀胱癌中的作用。方法:应用不同剂量AG490处理膀胱癌细胞系BIU87,台盼蓝排斥试验检测细胞活力,MTT法检测细胞增殖,克隆形成试验检测膀胱癌干细胞对药物的敏感性,Hoechst33258/PI荧光双染检测细胞凋亡特征,流式细胞仪检测细胞周期和早期凋亡,Westernblot检测pJAK2、STAT3、pSTAT3、CyclinD1、BclxL蛋白表达水平。结果:AG490明显抑制膀胱癌细胞增殖和干细胞克隆形成,使细胞周期阻滞,促进膀胱癌细胞凋亡;并可使pJAK2、STAT3、pSTAT3、CyclinD1、BclxL蛋白表达水平明显下降。结论:信号传导阻滞剂AG490通过阻断JAK/STAT3信号转导通路,抑制膀胱癌细胞的增殖,促进其凋亡,为膀胱癌治疗提供新的方法。     

JAK/STAT通路在金属蛋白酶1组织抑制剂抑制肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的 探讨金属蛋白酶1组织抑制剂（TIMP-1）抑制大鼠肾小球系膜细胞（RMC）凋亡与Janus激酶/信号转导和转录激活子（JAK/STAT）通路的关系。 方法 用无血清培养基体外培养pcDNA3空载体、人正义、反义TIMP-1基因重组真核表达载体转染RMC。根据是否加JAK2特异性抑制剂AG490刺激24 h,将细胞分为未转染组、未转染＋AG490组、空载体组、空载体＋AG490组、正义组、正义＋AG490组、反义组和反义＋AG490组。另外设正常培养条件下的RMC作为正常对照组。应用流式细胞技术检测各组RMC的凋亡率。RT-PCR检测TIMP-1、bcl-xl、cyclin D1、p27kip1和JAK2 mRNA的表达。Western印迹检测胞质中JAK2、STAT3、STAT5及其相应磷酸化蛋白(p-JAK2、p-STAT3、p-STAT5)的表达。 结果 未转染组、正义组及反义组RMC凋亡率分别为（10.59±0.96）％、（7.08±0.43）％和（21.91±0.25）％，各组间差异有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。在未加AG490的各组RMC中,bcl-xl和cyclin D1 mRNA在正义组中表达最高，反义组中最低，p27kip1 mRNA在反义组中表达最高。加入AG490后，各组细胞的凋亡率均显著增加（P < 0.01）；TIMP-1、bcl-xl和cyclin D1 mRNA表达均减少；p27kip1 mRNA表达均增加。在未加AG490的各组细胞中，p-JAK2、p-STAT3和p-STAT5在正义组中表达最高，反义组中最低。加入AG490后上述蛋白表达均减少，且正义＋AG490组最高，反义＋AG490组最低。 结论 TIMP-1表达受JAK/STAT信号通路调控，后者可通过上调前者的表达抑制RMC凋亡；TIMP-1通过JAK/STAT信号通路抑制RMC凋亡。 bcl-xl、cyclin D1和p27kip1参与了上述过程。     

STAT3信号通路对大肠癌细胞VEGF表达的影响

目的观察STAT3信号通路对大肠癌HT-29细胞生长及VEGF表达的影响。方法 pRNAT-shSTAT3重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Westernblot检测STAT3的表达情况,MTT检测细胞的生长情况,实时定量PCR、ELISA检测VEGF的表达。结果 pRNAT-shSTAT3重组质粒转染大肠癌细胞后,STAT3表达明显降低,细胞生长能力明显减弱,VEGF表达明显降低,与对照组相比差异显著(P<0.01)。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长及VEGF的表达。     

泛素特异性肽酶22经Wnt/β-catenin通路调控结直肠癌化疗耐药的机制研究

目的探讨泛素特异性肽酶22（USP22）作用于Wnt/β-catenin信号通路参与结直肠癌的发生和化疗耐药的分子机制。 方法采用氟尿嘧啶（5-Fu）处理结直肠癌细胞株HT-29,建立耐药细胞株HT-29/5-Fu;构建USP22 siRNA稳定表达细胞株（表示为HT-29-sh USP22、HT-29/5-Fu-sh USP22）。CCK-8法检测HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性、抑制USP22表达后结直肠癌细胞对5-Fu敏感性的影响;采用Western blotting检测不同质量浓度5-Fu诱导下HT-29细胞中USP22蛋白表达,HT-29和HT-29/5-Fu细胞中USP22和β-catenin蛋白表达,以及抑制USP22表达对结直肠癌细胞USP22、β-catenin表达的影响。 结果（1）HT-29与HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的IC₅₀值分别为（1.58±0.23）mg/L和（14.58±0.94）mg/L,其中HT-29/5-Fu细胞对5-Fu的敏感性显著下降（n=6,t=8.476,P<0.01）。（2）在0.5、5.0 mg/L的5-Fu诱导后,HT-29细胞内USP22蛋白表达水平（USP22/β-actin）显著升高（0.5 mg/L vs 0 mg/L：t=7.618,P<0.05;5.0 mg/L vs 0 mg/L：t=6.992,P<0.05）。HT-29/5-Fu组中USP22蛋白表达水平为0.92±0.11,显著高于HT-29组的0.18±0.06（t=7.618,P<0.05）。（3）HT-29-sh USP22组对5-Fu的IC₅₀为（0.25±0.23）mg/L,显著低于HT-29组（t=6.662,P<0.01）。HT-29/5-Fu-sh USP22组对5-Fu的IC₅₀为（1.36±0.14）mg/L,显著低于HT-29/5-Fu组（t=7.002,P<0.01）,但与HT-29组相比,差异无统计学意义（t=1.586,P>0.05）,抑制USP22表达可增强结直肠癌细胞HT-29对5-Fu的敏感性。（4）HT-29-sh USP22组的USP22蛋白表达水平为0.07±0.01,与HT-29组相比下调（t=7.105,P<0.01）。HT-29/5-Fu-sh USP22组的USP22蛋白表达水平为0.33±0.02,与HT-29/5-Fu组相比,USP22蛋白表达水平下调（t=6.153,P<0.01）。HT-29-sh USP22、HT-29/5-Fu-sh USP22中β-catenin蛋白表达水平与相应对照组HT-29、HT-29/5-Fu相比显著下调（HT-29-sh USP22 vs HT-29：t=8.823,P<0.01;HT-29/5-Fu-sh USP22 vs HT-29/5-Fu：t=7.656,P<0.01）。 结论5-Fu可诱导结直肠癌细胞USP22表达增高。抑制USP22表达可增加结直肠癌细胞对5-Fu的药物敏感性,其机制可能是抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而有效逆转结直肠癌细胞对5-Fu的耐药。     

慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达治疗结直肠癌的体内外研究

目的 探讨慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对结直肠癌生长的影响.方法 分别用慢病毒干扰质粒pRNAT-shSTAT3、慢病毒空质粒pRNAT-GFP和慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞,获得慢病毒分别感染结直肠癌HT-29细胞,筛选培养后获得HT-29-shSTAT3、HT-29-GFP细胞株.将3种细胞株用于建立裸鼠皮下移植瘤模型,分为3组:第1组为HT-29组,第2组为HT-29-GFP组,第3组为HT-29-shSTAT3组,每组5只.MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化,取瘤组织切片行CD34免疫组织化学观察肿瘤微血管密度(MVD)的变化.应用单因素方差分析检测结果.结果 结直肠癌HT-29、HT-29-GFP细胞株生长能力明显强于HT-29-shSTAT3细胞株,3者比较,差异有统计学意义(F=632.50,P<0.05).HT-29-shSTAT3细胞株生长明显减慢,G0/G1期细胞占68.7%±2.9%,HT-29-GFP细胞株为38.5%±1.6%,HT-29细胞株为38.7%±2.3%;3者比较,差异有统计学意义(F=166.53,P<0.05).HT-29组、HT-29-GFP组和HT-29-sh STAT3组MVD分别为29±5、28±4、10±3,3组比较,差异有统计学意义(F=31.60,P<0.05).结论 慢病毒介导的shRNA沉默STAT3表达能明显抑制结直肠癌的生长.