siRNA磁性纳米颗粒协同外磁场对膀胱癌细胞存活素基因表达和凋亡的影响

目的观察葡聚糖磁性纳米颗粒（DMN）在外磁场协同作用下转染存活素（survivin）小干扰RNA（siRNA）重组质粒对膀胱癌细胞survivin基因表达和凋亡的影响。方法利用化学共沉淀法制备DMN并作为基因载体,通过多聚赖氨酸静电吸附siRNA-survivin重组质粒,并在外磁场的协同作用下体外转染人膀胱癌BIU-87细胞,分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术法、逆转录聚合酶链反应和Western Blotting检测BIU-87细胞的生长抑制率（IR）、凋亡指数（AI）、survivin mRNA及其蛋白的相对表达水平。结果构建的siRNA-DMN直径、有效粒径、比饱和磁化强度分别为10-12nm、94．8nm、0．19emu／g。DMN在外磁场的作用下转染siRNA-survivin入BIU-87细胞后的IR（39．60％）、AI（28．72％）均分别显著高于对照组和无磁场作用的DMN组（1．99％、3．75％和20．96％、16．71％）（P〈0．05）,survivin mRNA及其蛋白相对表达水平均显著低于后两组。结论DMN在外磁场的协同作用下转染siRNA-survivin质粒入BIU-87细胞后可有效抑制survivin基因表达并诱导细胞凋亡。     

胰腺癌细胞survivin表达RNAi抑制载体的构建及其抑制作用的研究

目的构建胰腺癌细胞生存蛋白（survivin）表达的RNA干扰（RNAi）抑制载体，并研究其对survivin表达的抑制作用。方法用免疫荧光技术和RT-PCR检测胰腺癌细胞PANC-1中survivin及其mRNA的表达，并把survivin基因克隆到T载体进行测序；构建针对survivin缺失碱基基因和survivin基因的RNAi载体si-svv-1和si—SVV-2，用脂质体转染胰腺癌细胞PANC-1后，用RT—PCR、DNA梯状电泳及流式细胞术分析比较2种干扰载体对survivin mRNA表达的抑制情况和检测细胞凋亡。结果survivin在胰腺癌细胞PANC-1中高表达；si—svv-2对survivin mRNA的表达抑制率达（72．43±8．04）％，而si—svv-1为0；si—svv-2能诱导胰腺癌细胞PANC-1的凋亡，72h细胞凋亡率达（12．36±1．44）％。结论本研究成功建立胰腺癌细胞survivin表达RNAi抑制载体，该载体可特异有效地抑制胰腺癌细胞PANC-1survivin的表达并诱导胰腺癌细胞PANC-1凋亡。     

siRNA端粒酶催化亚单位诱导人膀胱癌BIU-87细胞凋亡的研究

目的：研究siRNA（small interference RNA）对人膀胱癌BIU-87细胞凋亡和端粒酶催化亚单位（hTERT）基因表达的影响。方法：设计并体外转录合成针对hTERT基因的3个特异性siRNA,通过脂质体将siRNA转入BIU-87细胞,分别采用MTT和DNA原位末端标记（TUNEL）法检测siRNA对BIU-87细胞生长抑制率（IR％）和凋亡指数（A100）的影响,半定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western Blotting检测siRNA对hTERT mRNA及其蛋白表达的影响。结果：转染后的siRNA 1～3组的B1U-87细胞的IR（34．62％、62．19％、57．43％）和AI（30．62％、54．26％、51．50％）均分别显著高于正常对照组（3．46％和5．03％）（均P〈0．05）,hTERT mRNA及其蛋白表达水平均显著低于对照组;其中siRNA2～3对BIU-87细胞的IR、AI和hTERT表达的抑制作用均显著高于siRNA1。结论：体外转录合成的siRNA可抑制BIU-87细胞hTERT的表达,诱导BIU-87细胞凋亡,从而抑制BIU-87细胞生长,为siRNA介导的膀胱肿瘤基因沉默提供实验依据。     

Livin基因和Survivin基因联合靶向siRNA诱导结肠癌细胞凋亡的作用

目的探讨Livin基因和Survivin基因联合靶向小干扰（si）RNA对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响。方法构建Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体并转染结肠癌细胞．通过RT—PCR和蛋白质印迹方法分别检测Livin和Survivin的表达．通过MTT法检测siRNA对细胞增殖的抑制作用．利用流式细胞仪检测处理后细胞的凋亡效应。结果经酶切鉴定和测序分析证实Livin和Survivin联合靶向的siRNA重组表达载体构建成功。这种联合靶向SiRNA对Livin mRNA及蛋白表达的抑制率分别为27．9％和22．3％．对Survivin mRNA及蛋白表达的抑制率分别为32．2％和40．9％。与对照组相比,联合靶向siRNA可降低肿瘤细胞增殖率．增加细胞凋亡率,但其细胞生长抑制作用和促细胞凋亡作用均弱于单独干扰Livin或Survivin基因．结论Livin和Survivin基因联合靶向siRNA能降低结肠癌细胞中Livin和survivin基因的表达．抑制结肠癌细胞的增殖．并诱导结肠癌细胞的凋亡．但此协同抑制作用较单独干扰Livin或survivin基因为弱。     

hTERT启动子调控的CXCR4-shRNA逆转录病毒抑制膀胱癌细胞侵袭、增殖的体外研究

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的趋化因子受体4（CXCR4）的短发夹RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并研究其对hTERT阳性膀胱癌细胞中CXCR4表达的抑制效应及对细胞侵袭、增殖的影响。方法用PCR扩增特异CXCR4-shRNA的DNA片段,以hTERT启动子代替U6启动子,将重组基因片段导入到逆转录病毒载体,收获病毒后分别感染膀胱癌细胞BIU87及人胚肺成纤维细胞MRC5和人乳腺癌细胞MCF7,RT-PCR、Western blot检测CXCR4 mRNA及蛋白的表达。MTT法检测细胞增殖变化。Transwell小室实验检测细胞体外侵袭能力的变化。结果hTERTpro—CXCR4-shRNA能显著抑制MCF7、BIU87细胞CXCR4 mRNA及蛋白的表达,48h mRNA抑制率分别为（87．09±7．60）％、（91．02±11．32）％,48h蛋白抑制率分别为（89.01±4．87）％、（90．42±9．64）％,其对MRC5细胞不抑制。感染重组病毒的膀胱癌细胞体外侵袭、增殖能力均显著下降。结论重组病毒中hTERT启动子调控的下游RNA干扰序列可靶向表达于hTERT阳性膀胱癌细胞、乳腺癌细胞,不表达于hTERT阴性MRC5细胞。     

联合RNAi膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性及其增殖影响的机制

目的 观察基因芯片分析联合小型干扰(siRNA)人端粒酶RNA(hTR)及人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的影响.方法 根据siRNA设计原则和TERT、TR基因mRNA编码序列,分别设计合成3对不同的且能干扰TR和TERT基因表达的siRNA序列并筛选出最高效抑制序列(pRNAT-TERT-Ⅲ:GTACAGGTTTCACGCATGT基因的第3229位、pRNAT-TR-Ⅲ:CGAAGGTGCCTTGGAATAT基因的第306位).构建以hTR、hTERT基因为靶点的联合RNA干扰(RNAi)装置pRNAT-TR-Ⅲ+pRNAT-TERT-Ⅲ(脂质体法)并将其转染膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)分析hTR和hTERT mRNA表达(以目的基因与GAPDH拷贝数比值进行相对定量分析),端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA)检测端粒酶活性(测其A值),噻唑蓝(MTT)比色法检测BIU-87细胞的生长抑制(按MTT法检测转染细胞的存活率),并对联合RNAi前后进行基因芯片分析,采用RNA抽提、RNA质量检测、cRNA标记与合成、芯片杂交、化学发光检测、图像采集和数据分析,并进一步采用逆转录(RT)-PCR验证部分差异表达基因.结果 联合RNA干扰hTR及hTERT基因后,pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-Ⅲ的联合RNAi可以特异性抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株中TERT和TR表达(pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-ⅢTERT:0.300±0.033,P＜0.05;TR:0.430±0.028,P＜0.05).且联合RNAi后膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长和端粒酶活性均明显受到抑制(pRNAT-TERT-Ⅲ+pRNAT-TR-Ⅲ:1.250±0.012,P＜0.05).联合siRNA前后进行基因芯片分析发现21个基因下调(ATM、BAX、BCL2、BCL2L1、BIRC5、CD44、CTNNB1、E2F1、JUN、MCAM、MTA1、MYC、NFKB1、NFKBIA、NME4、PNN、PRKDC、SERPINE1、THBS1、TNFRSF1A、UCC1).结论 联合RNA干扰hTERT及hTR基因能明显抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长;联合siRNA抑制膀胱移行细胞癌BIU-87细胞株的生长的原因为21个基因下调所致.     

小干扰RNA对胃癌细胞葡萄糖调节蛋白94表达的抑制作用

目的构建Grp94靶向RNA干扰质粒载体，观察其对人类胃癌细胞株SGC-7901 Grp94基因表达的抑制作用。方法从GenBank中选取人类Grp94基因序列，采用siRNA Target Designer-Version 1．51设计软件设计1对Grp94基因发卡寡核苷酸，序列符合siRNA表达载体siSTRIKE^TM U6的要求并与psiSTRIKE^TM质粒载体连接，构建受控于人RNA聚合酶Ⅲ启动子U6的真核表达载体。采用Lipofectamne^TM 2000转染试剂进行转染，将重组质粒导入人类胃癌细胞株SGC-7901内，分别在转染前、转染后24、48和72h通过逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot及免疫荧光技术检测Grp94 mRNA及蛋白水平的表达情况。结果成功构建RNA干扰质粒载体，靶向Grp94干扰质粒载体命名为psiSTRIKE^TM／Grp94，将上述质粒转染到人类胃癌细胞株后，观察到psiSTRIKE^TM／Grp94能够明显下调Grp94 mRNA及蛋白水平的表达，并随着时间推移稳定存在。结论构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKE^TM／Grp94能明显抑制Grp94 mRNA及蛋白的表达，提示通过降低胃癌细胞中Grp94的表达，可能抑制或辅助抑制胃癌细胞的生长的作用。     

RNAi沉默PLCε基因对膀胱癌BIU-87细胞株的增殖调控作用

目的 探讨RNA干扰技术沉默PLCε基因表达对膀胱癌BIU-87细胞株增殖的抑制作用.方法 构建靶向PLCε基因特异性shRNA重组质粒pGenesil-PLCE,经脂质体介导转染BIU-87细胞株,蛋白质印迹法、RT-PCR方法检测PLCε在癌细胞蛋白及mRNA水平的表达,噻唑盐法观察重组质粒对BIU-87细胞增殖的抑制作用,免疫细胞化学染色分析增殖细胞核抗原(PCNA)含量改变,流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 构建的重组质粒pGenesil-PLCε能明显抑制PLCE基因表达,且能明显抑制BIU-87细胞增殖;转染重组质粒0、24、48和72 h后细胞增殖抑制率分别为2.01%、32.85%、39.78%、37.19%,重组质粒组与对照组、阴性质粒组比较,差异有统计学意义(P<0.01).细胞内PCNA表达下调了33.08%;G0/G1期细胞(71.50±4.48)%与空白对照组(40.75±2.30)%、阴性质粒组(40.00±1.76)%比较明显增多,G2/M期细胞(8.16±0.51)%与空白对照组(31.20±1.76)%、阴性质粒组(35.94±1.58)%相比减少.差异均有统计学意义(P<0.01),细胞阻滞于G0/G1期,细胞增殖状态受到明显抑制.结论 PLCε基因在促进膀胱癌细胞增殖中发挥莺要作用,可能成为膀胱癌生物学治疗潜在的分子靶点.     

应用RNA干扰技术抑制PDE5A3基因在人阴茎海绵体平滑肌细胞表达

目的应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达,探讨应用该技术治疗勃起功能障碍(ED)的可行性.方法构建6个靶向人PDE5A3基因的短发夹RNA(shRNA)重组质粒,转染人阴茎海绵体平滑肌细胞48 h后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测PDE5A3基因的表达抑制效果.结果抑制率最高的1、2、4号重组质粒使PDE5A3基因表达在mRNA水平分别抑制(66.26±4.02)%,(54.90±3.06)%,(23.83±3.61)%;在蛋白质水平分别抑制(64.14±3.32)%,(49.21±2.96)%,(29.85±4.91)%.结论RNAi能明显抑制人阴茎海绵体平滑肌细胞PDE5A3基因的表达,且抑制率具有序列相关性,是潜在的ED基因治疗新方法.     

利用RNA干扰阻抑膀胱癌细胞Survivin基因表达和诱导凋亡

目的 探讨RNA干扰下调Survivin基因表达后膀胱癌细胞生物学行为变化及Survivin基因抗凋亡机制。方法设计、合成一对Survivin编码基因序列特异的小分子干扰RNA（siRNA），用脂质体包裹转染T24膀胱癌细胞，分不同的浓度组（50～200nmol／L）。噻唑蓝（MTT）法检测细胞生长情况，流式细胞仪测定细胞凋亡率，实时定量聚合酶链反应（PCR）检测Survivin基因和Caspase-3基因mRNA表达。结果 Survivin编码基因序列特异性siRNA能有效下调Survivin基因表达水平，并呈剂量和时间依赖性，最大效应浓度为100nmol／L，此时与对照比较Survivin表达水平下调75．91％，并显著的抑制了细胞生长，抑制率达55．29％，差异有统计学意义（P＜0．05）。同时，Caspase-3 mRNA表达水平明显上升达239．80％，细胞凋亡率亦增加至45．70％，与对照相比差异有统计学意义（P＜0．05）。结论RNA干扰显著下调Survivin基因表达后，能明显促进T24膀胱癌细胞凋亡并抑制其增殖；Survivin基因可能是通过下调Caspase-3表达来抑制凋亡。     

大鼠自体静脉移植后增生内膜中α1（Ⅰ）和α1（Ⅲ）前胶原mRNA表在的定位研究

目的 明确静脉移植后内膜增生（IH）过程中分泌细胞外基质（ECM）的间质效应细胞。方法 建立静脉移植后内膜增生动物模型,采用Desmin免疫组织化学及特殊染色明确平滑肌细胞（SMC）的位置,用原位杂交检测细胞外基质的重要成分－Ⅰ、Ⅲ 型胶原α1（Ⅰ）、α1(Ⅲ)前胶原mRNA在静脉移植术后1、2、4、6、8周的定位表达。结果 术后早期,移植静脉增生内膜的SMC中有α1（Ⅰ）、α1(Ⅲ）前胶原mRNA的表达。术后远期α1（Ⅰ）、α1(Ⅲ前胶原mRNA也在增生内膜的SMC中表达。结论 移植静脉内膜增生中的胶原是由SMC合成及分泌的,SMC是ECM堆积的间质效应细胞。     

小鼠成纤维活化蛋白真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维活化蛋白(FAP)基因的真核表达载体,并检测其在人胚肾细胞及小鼠体内的表达.方法 根据Gene Bank中mFAP基因(NM_007986)全序列设计聚合酶链反应(PCR)引物,获得其开放式阅读框(ORF).将目的基因片段克隆至真核表达载体pcDNA6/myc-His-B,转化并筛选.将重组质粒注射入小鼠尾静脉,在注射后1、3、5、7 d抽提小鼠腓肠肌组织的总RNA,检测FAP表达.结果 经过酶切鉴定、测序比对,确定所筛选的阳性克隆为pcDNA6-mFAP重组子,其可在真核细胞及小鼠体内正常表达,并产生相应蛋白质产物.在小鼠体内注射后第5天,重组子的基因(0.841±0.040)和蛋白表达量(85.380±4.425)%最高,和空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 成功构建FAP真核表达载体,为研究该基因产物的功能和进行疫苗抗肿瘤实验提供基础.     

肾脏基因表达数据库的建立与肾脏衰老相关基因表达谱研究

目的：运用基因芯片技术及公共数据库,首次建立大鼠肾脏基因表达谱数据库,比较成年及老年大鼠肾脏基因表达变化,筛选肾衰老相关基因,方法：将代表8192条基因的PCR产物中CartesianPixsys7500点样仪按微矩阵排列点样于Dako玻璃片,将等量的成年大鼠肾脏组织和衰老大鼠肾组织mRNA分别用cy-3,cy-5逆转录荧光标记,制作cDNA探针,混合后与上述表达谱芯片进行杂文,Scan Array3000扫描仪扫描杂交信号荧光强度,ImaGENE3.0软件分析扫描结果,与公共数据库比较,建立大鼠肾脏表达谱数据库,结果：在进入研究的8192条基因中,1245条基因（1．5％）在衰霉素 大鼠肾脏组织中有表达差异（1．7倍以上）,在老年大鼠肾组织中表达增加的基因有71条,其中16条（22．5％为应激反应相关或炎症相关基因,17条（23．9％）为细胞外基质代谢／细胞骨架／肿瘤相关基因,在衰老大鼠肾组织表达下降的基因有53条,其中9条（16．9％）为能量代谢相关基因,12条（22．6％）为蛋白质合成／代谢相关基因,6条（11．3％）为细胞周期／有丝分裂相关基因,4条（7．5％）为DNA／RNA损伤修复基因,3条（5．6％）为离子转运相关基因,结论：肾脏衰老的基因表达特征表现为应激与炎症反应讥进,细胞外基质代谢失调及肿瘤相关基因表达活跃,另一方面,有丝分裂调节下降,DNA／RNA修复能力,蛋白合成及肾脏离子转运能力下降,上述转录水平的变化与衰老肾脏的病理生理特征相符合。     

人 Orail基因真核表达载体的构建及在足细胞中的表达

目的构建重组人 Orail基因真核表达载体,观察其在小鼠肾小球足细胞株（MPC5）中的表达。方法根据GenBank数据库检索到的人 Orail基因序列,人工合成法合成Orail基因编码区（coding sequence,CDS）全长序列,克隆至质粒表达载体PG-CMV-IRES-EGFP,构建重组质粒载体PC-CMV-Orail,通过PCR、双酶切及基因测序等方法进行鉴定;以脂质体转染法将重组质粒转染至MPC5细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光检测转染效率,RT-PCR、Western blot法分别检测Orail基因的转录与翻译。结果PCR扩增的片段长度为906bp,双酶切出现两条带,其中约906bp处可见目的条带。核酸测序结果与GenBank中所报道的人 Orail基因的CDS序列完全一致。转染后48h置荧光显微镜下观察,85％以上的足细胞中可见绿色荧光。RT-PCR及Western blot实验结果分别显示转染后的MPC5细胞在mRNA与蛋白水平表达Orail均有所增强。结论成功构建了重组人 Orail基因真核表达载体PG-CMV-Orail,并建立了过表达Orail基因的肾小球足细胞模型,为深入研究钙库操纵的Ca2’通道与足细胞病之间的关系奠定了良好的实验基础。     

人源化绿色荧光蛋白基因真核表达载体的构建与表达检测

目的: 构建人源化绿色荧光蛋白(humanized greenfluorescent protein,hGFP)基因的真核表达栽体pcDNA3GFP,并观察其在MDCK细胞中的表达情况. 方法: 以Not I切取GFP后插入真核表达载体pcDNA3,以BamH I为鉴定方向,以Lipofect AMINE PLUSTM将pcDNA3GFP转染至培养的MDCK,经G418筛选GFP阳性克隆,于荧光显微镜下观察. 结果: 成功构建了含hGFP cDNA的真核表达载体 pcDNA3GFP,并成功转染MDCK细胞,在荧光显微镜下阳性克隆呈绿色. 结论: GFP基因可在MDCK细胞中成功表达,并发出绿色荧光,是一良好的报告基因和筛选标记.     

Tip30真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的：探讨人Tip30全长基因的真核表达载体pAAV-TIP30的构建,并观察其转染肝癌细胞株HepG2后的表达。方法：以正常人肝组织mRNA为模板,用RT-PCR方法扩增Tip30,利用限制性内切酶BamH I和Xba I,将Tip30基因克隆到真核表达载体pAAV-MCS中,并经酶切和测序鉴定。重组质粒转染HepG2细胞,运用Western blot法检测Tip30蛋白表达。结果：RT-PCR方法正确地扩增出全长Tip30基因。限制性内切酶酶切和测序结果证实Tip30基因克隆完全正确。重组质粒转染肝癌细胞系HepG2后,Western blot证实Tip30蛋白表达增高。结论：成功构建了真核表达重组质粒pAAV-TIP30并转染HepG2细胞,为进一步研究Tip30基因对肝癌的影响及其机制打下了基础。     

Cardiospecific expression of AAV vectors

Adenoviral vectors have been set for cardiomyocyte gene therapy with considerable transfection rates. However, due to adenoviral immunogenicity, adenoviral transfected cells are frequently subject to specific cellular immune reactions leading to loss of cells and transgene expression. Non‐pathogenic adeno associated vectors lacking immunogenicity have been utilized alternately. Tropism of the most common AAV serotype 2, favoring liver of muscle transfection, has been altered by use of serotypes 1, 6 and 9. We used a model of chronic (4 weeks) regional myocardial transfection of the pig to investigate transfection efficacy of AAV vectors, which were applied to the target region by retroinfusion. Cardiac restriction was ensured by utilization of an MLC‐2v promoter‐CMV‐enhancer construct, fused to a luciferase reporter gene, the activity of which was analyzed. Compared to the wildtype (WT) AAV 2 vector, which barely exceeded background luciferase activity, a vector lacking the heparin binding site of the envelope (AAV2 ΔHep) improved expression only slightly. Substantial increase to 40 000 RLU/mg tissue) was achieved by the addition of VEGF‐A, which enhances vascular permeability. A further 15‐fold increase of luciferase activity was achieved by applying an equal amount of AAV6 virus particles to a pig heart, with a further 5–10 fold increase achieved by utilization of AAV serotype 9. Functionally relevant gene transfer was ensured by applying AAV9 hVEGF/PDGF (0.2/0.4 × 10¹³ virus particles, respectively). 4 weeks after retroinfusion into pig hearts suffering from chronic total LAD‐occlusion (induced by a reduction stent), we found a significant increase of blood flow and regional myocardial function. We conclude that AAV9 is a more efficient AAV vector when compared to WT‐ or ΔHep‐AAV2 or AAV6. Functionally relevant gene expression, as performed by VEGF‐A/PDGF transfection, opens the door for utilization of this vector system for xenotransplant organ priming.