金纳米链及抗表皮生长因子受体抗体/金纳米链共轭物近红外热疗可启动 细胞凋亡通路*☆

背景：金纳米颗粒在近红外激光照射下对肿瘤细胞具有杀伤效应。 目的：评价金纳米链及抗表皮生长因子受体抗体/金纳米链共轭物近红外热疗对人喉癌Hep-2细胞的热杀伤作用并探讨其凋亡通路。 方法：取生长良好的人喉鳞癌Hep-2细胞,分别应用金纳米链或抗表皮生长因子受体抗体/金纳米链共轭物溶液进行干预,在此基础上应用8 W/cm2近红外激光(808 nm)照射6 min,以单独应用1640培养液培养及单独给予近红外激光照射的细胞作对照。 结果与结论：透射电镜观察发现,金纳米链热疗后Hep-2细胞有明显的损伤,抗表皮生长因子受体抗体/金纳米链热疗后细胞的损伤程度最重。Western blot检测显示,金纳米链热疗和抗表皮生长因子受体抗体/金纳米链热疗后细胞热休克蛋白70和促凋亡蛋白Bax表达明显增高,而抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低。说明金纳米链及抗表皮生长因子受体抗体/金纳米链共轭物近红外热疗可通过启动细胞凋亡通路杀伤人喉癌Hep-2细胞。关键词：金纳米链;抗表皮生长因子受体抗体;Hep-2细胞;热疗;凋亡;生物材料;纳米技术 缩略语注释：EGFR：epidermal growth factor receptor,表皮生长因子受体;Hsp70：heat shock protein 70,热休克蛋白70 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.16.006     

近红外照射下金纳米链及Anti-EGFR/Au共轭物对人喉癌Hep-2细胞的抑制*☆

背景：金纳米颗粒在近红外激光照射下对肿瘤细胞具有杀伤效应。 目的：评价金纳米链及anti-EGFR/Au共轭物近红外照射对人喉癌Hep-2细胞的生长抑制和热杀伤作用。 方法：取对数生长期的Hep-2细胞,随机分为空白对照组、单纯照射组、金纳米链照射组和anti-EGFR/Au照射组,加入不同培养液后,各照射组进行近红外激光照射。观察照射后细胞凋亡情况和凋亡程度。 结果与结论：倒置显微镜下观察显示空白对照组和单纯照射组Hep-2细胞仍具有活性,金纳米链照射组有明显的损伤,但anti-EGFR/Au照射组损伤程度更重。流式细胞分析显示金纳米链照射组及anti-EGFR/Au靶向照射组均有不同程度的Hep-2细胞凋亡,且照射时间越长,凋亡细胞越多。说明金纳米链近红外照射可以杀伤人喉鳞癌Hep-2细胞,anti-EGFR/Au靶向照射比金纳米链照射效果更好,并呈现一定照射时间的依赖性。 关键词：金纳米链;Hep-2细胞;流式细胞分析;照射;生物材料与纳米技术 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.12.013     

小檗碱对喉癌Hep-2细胞增殖与凋亡的影响及可能机制

目的探讨小檗碱对喉癌Hep-2细胞增殖与凋亡的影响及可能机制。方法免疫组织化学方法与Western blot方法检测喉癌组织及癌旁正常组织中环氧合酶-2(COX-2)与细胞周期调节蛋白CyclinB1的表达。MTT方法检测不同质量浓度小檗碱(0,5,10,20mg/L)对喉癌Hep-2细胞增殖的影响;流式细胞仪检测小檗碱(0,20 mg/L)对喉癌Hep-2细胞凋亡的影响。Western blot方法检测小檗碱(0,20 mg/L)作用喉癌Hep-2细胞24h后COX-2与CyclinB1的表达变化。结果 COX-2与CyclinB1在喉癌组织的阳性表达率及平均光密度值显著高于癌旁正常组织(P0.01)。小檗碱抑制喉癌Hep-2细胞增殖,并呈时间浓度依赖性;给予20 mg/L小檗碱作用后,喉癌Hep-2细胞凋亡率明显增加,喉癌Hep-2细胞中的COX-2与CyclinB1表达水平明显低于未加药组(P0.01)。结论小檗碱抑制喉癌Hep-2细胞的增殖并促进凋亡,下调COX-2与CyclinB1的表达可能是其作用机制之一。     

芹菜素对喉癌Hep-2细胞增殖、迁移与侵袭的影响

目的探讨芹菜素对喉癌Hep-2细胞增殖、迁移与侵袭的影响及可能机制。方法 MTT法检测不同浓度的芹菜素(0、20、40、80μmol/L)对喉癌Hep-2细胞增殖的影响。40μmol/L芹菜素处理Hep-2细胞48h后,Transwell实验检测Hep-2细胞体外迁移和侵袭能力变化;实时PCR和Western blot检测Hep-2细胞Wnt1、β-catenin、环氧合酶2(COX2)与基质金属蛋白酶2(MMP-2)的蛋白与mRNA的表达水平。结果芹菜素抑制喉癌Hep-2细胞增殖,并呈时间浓度依赖性;40μmol/L芹菜素处理Hep-2细胞48h能够有效抑制Hep-2细胞的迁移和侵袭能力,降低Wnt1、β-catenin、COX2与MMP-2 mRNA相对表达量和蛋白表达水平。结论芹菜素抑制喉癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力与抑制喉癌Hep-2细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关。     

沉默Slug对喉癌Hep-2细胞增殖和细胞侵袭的影响

目的探讨沉默喉癌细胞株Hep-2中Slug基因对细胞增殖和细胞侵袭的影响。方法将靶向Slug基因si RNA转染至喉癌Hep-2细胞,Real time PCR和Western blot方法分别检测转染后Slug m RNA和蛋白表达变化,通过CCK-8法测定Hep-2细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测细胞周期及transwell法检测细胞侵袭力。结果转染Slug-si RNA的实验组Hep-2细胞内slug m RNA和蛋白表达水平与对照组相比明显降低(0.05),Hep-2细胞增殖能力和侵袭能力显著降低(0.05)。结论沉默Slug基因可以抑制喉癌Hep-2细胞的增殖和侵袭能力,提示Slug基因可能参与喉癌发生发展。     

铁碳纳米粒介导顺铂对喉癌细胞敏感性的研究*

背景：应用纳米技术对化疗药物进行靶向性改进是增加肿瘤对化疗药物敏感性的有效手段之一。 目的：观察铁碳纳米粒搭载顺铂对喉癌Hep-2细胞的抑制作用及对细胞Caspase 3,Survivin mRNA表达的影响。 方法：分别应用铁碳纳米粒和(或)顺铂的生理盐水分散液干预喉癌Hep-2细胞,以生理盐水干预的细胞作为对照。 结果与结论：MTT检测结果显示,顺铂可明显抑制Hep-2细胞的生长,与铁碳纳米粒联合应用对Hep-2细胞的抑制作用更强;表现为细胞生长不贴壁,增殖缓慢,出现凋亡征象。RT-PCR结果显示,共培养5 d,铁碳纳米粒和顺铂联合及顺铂单独处理的Hep-2细胞Caspase 3 mRNA水平明显增高,而Survivin mRNA水平明显降低,以铁碳纳米粒和顺铂联合作用效果更明显,而单独应用铁碳纳米粒对Hep-2细胞无影响。提示铁碳纳米粒搭载顺铂能够增加喉癌Hep-2细胞对顺铂的敏感性,提高药物化疗效果。 关键词：铁碳纳米粒;顺铂;喉癌;Hep-2细胞;化疗;敏感性;Caspase3;Survivin doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.12.010     

miR-137对喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭与凋亡的影响及可能机制

目的探讨miR-137对喉癌Hep-2细胞增殖及迁移能力的影响及可能机制。方法采用miR-137模拟物转染喉癌Hep-2细胞,实验分为空白对照组组(未进行转染)、miR-137阴性对照组(转染无关序列)、miR-137模拟物转染组(进行miR-137模拟物转染)。real-time PCR法验证转染效率,采用CCK8法检测miR-137对喉癌Hep-2细胞增殖的影响,采用Transwell实验检测转染后Hep-2细胞的侵袭能力变化,采用流式细胞术检测miR-137对Hep-2细胞凋亡的影响;Western blot检测转染后Hep-2细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3以及侵袭相关蛋白T细胞因子-4(TCF-4)蛋白表达的变化。结果与空白对照组或阴性对照组相比,miR-137模拟物转染组Hep-2细胞miR-137的表达水平显著高于对照组(P0.01),喉癌Hep-2细胞的增殖与侵袭能力显著降低,细胞凋亡率明显升高,凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平降低,而Bax与caspase-3蛋白表达升高,侵袭相关蛋白TCF-4表达降低。结论过表达miR-137抑制Hep-2细胞增殖与侵袭、诱导细胞凋亡,与上调Bax、caspase-3蛋白表达和下调Bcl-2、TCF-4表达相关。     

臭灵丹中黄酮类化合物对人喉癌细胞Hep-2凋亡的影响及机制

目的:探讨中药臭灵丹中黄酮类化合物诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡的机制。方法:MTT法检测分离自臭灵丹的黄酮类化合物3,5-二羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮(HTMF)对2种正常细胞的毒性和对3种肿瘤细胞株的增殖抑制作用;采用流式细胞仪检测化合物对Hep-2细胞凋亡率的影响;Western blotting法检测凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的变化。结果:HTMF显著抑制Hep-2细胞的增殖并呈浓度、时间双重依赖性关系,但对正常细胞Vero和EVC304的毒性较小,对A549和HepG2细胞抑制作用小。流式细胞仪检测结果显示HTMF对Hep-2细胞有促凋亡作用并呈明显的量效、时效关系。Western blotting结果显示HTMF可诱导Hep-2细胞中caspase-3和caspase-9蛋白的活化,并呈时间依赖性关系。结论:HTMF对人喉癌细胞Hep-2的生长有显著的抑制作用,其机制可能通过激活caspase-9进而活化caspase-3诱导Hep-2细胞凋亡。     

HSV-tk/GCV自杀基因系统对喉癌细胞杀伤作用的体外研究

目的 研究逆转录病毒介导的HSV－tk/GCV系统对人喉癌细胞的体外杀伤胜任。方法 构建携带HSV－tk基因的逆转录病毒载体，并以该重组逆转录病毒感染人喉癌细胞Hep-2。以G418筛选的抗性克隆（命名为Hep-2/tk)，用MTT比色法观察GCV在体外对Hep-2/tk细胞的杀伤作用。结果 Hep-2/tk细胞与未转染tk基因的Hep-2/0,Hep-2细胞相比较，三者的生长速度无明显差别。Hep-2/tk细胞对GCV高度敏感，即低浓度GCV（0－1mg/L）处理Hep-2/tk细胞7d，可将其大部分细胞杀死，增加GCV的浓度（＞1mg/L)不能显著增强其对Hep-2/tk细胞的杀伤作用。结论 人喉癌细胞Hep-2对HSV－tk/GCV系统高度敏感，可望为喉癌的治疗提供一种有效的途径。     

人PFP、GrB共表达诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的研究

目的 探讨人穿孔素(PFP)、颗粒酶B(GrB)共表达是否可以诱导人的喉癌细胞系Hep-2的凋亡及其作用的机理.方法 利用脂质体2000将PFP、GrB共表达载体pVAX1-PIG(即pVAX1-PFP-IRES-GrB)转染人喉癌Hep-2细胞,采用荧光染料Hoechst33342法、流式细胞仪(FCM)检测、透射电镜观察Hep-2细胞的凋亡情况.以激光共聚焦显微镜检测重组载体转染后的Hep-2细胞内[Ca2+];浓度的变化,并探讨其作用机理.结果 pVAX1-PIG转染组的Hep-2细胞大量凋亡且其凋亡率显著高于对照组(P＜0.05),透射电镜研究显示单个Hep-2细胞内亦出现凋亡的特征.Hep-2细胞内[Ca2+];的浓度发生了变化,且由FI值增大可知细胞胞浆内[Ca2+];的浓度升高.结论 PFP、GrB共表达能够诱导人Hep-2细胞的凋亡,且凋亡的发生与细胞胞浆内[Ca2+];的浓度升高有关.     

喉癌原代培养细胞及Hep-2细胞系染色体畸变研究

目的探索原发性喉鳞状细胞癌及喉癌Hep-2细胞系的特征性染色体异常，认识喉癌的细胞遗传学改变与其发病机理的相关性。方法对喉癌手术新鲜标本进行改良的原代细胞培养，G显带后核型分析；应用高分辨染色体分析法对喉癌Hep-2细胞系进行核型分析；应用6号染色体涂染探针对原发性喉癌及喉癌细胞系进行分子细胞遗传学研究。结果4例原发性喉癌原代培养细胞中，1例是四倍体范围，3例是三倍体范围。Hep-2细胞系染色体众数为68～75条，出现15条可识别的标记染色体。原发性喉癌及喉癌细胞系中染色体结构异常多为末端缺失、等臂染色体和不平衡易位，而且均存在复杂的6号染色体畸变。结论6q-，i（5p），17p-，5q-可能是人类喉鳞状细胞癌特征性染色体改变；荧光原位杂交法（fluorescence in situ hybridization，FISH）可以探求常规显带方法难以确认的复杂易位和标记染色体来源，为进一步确定喉癌特征性染色体畸变提供有价值的依据。     

基于光学成像的HeLa细胞摄取二氧化硅包覆的金纳米棒及细胞内定位

金纳米棒具有独特的光学特性和较高的光热转换效率,被广泛应用于生物医学成像和治疗等方面的研究中。金纳米棒用于临床治疗时,其与细胞的相互作用是研究的关键问题。研究二氧化硅包覆的金纳米棒的HeLa细胞毒性,采用双光子成像技术,观察二氧化硅包覆的金纳米棒与HeLa细胞共孵育不同时间(4、8、12、24h)时,HeLa细胞对二氧化硅包覆的金纳米棒摄取量,以及二氧化硅包覆的金纳米棒进入细胞后在细胞内的分布。研究发现,二氧化硅包覆的金纳米棒的HeLa细胞毒性具有时间和浓度依赖性,且培养液中的血清可降低二氧化硅包覆的金纳米棒的细胞毒性。二氧化硅包覆的金纳米棒与HeLa细胞共孵育12h,除了二氧化硅包覆的金纳米棒浓度高达1250μg/mL时无血清培养的二氧化硅包覆的金纳米棒的细胞成活率才降至85%左右,其他条件下的细胞存活率都接近100%;二氧化硅包覆的金纳米棒与HeLa细胞共孵育24h、二氧化硅包覆的金纳米棒浓度为50μg/mL时,有无血清培养的细胞成活率分别为99.0%和85.1%,而当二氧化硅包覆的金纳米棒浓度升高至1250μg/mL时,有无血清培养的细胞成活率分别降至58.3%和31.2%。培养液中的血清会抑制HeLa细胞对二氧化硅包覆的金纳米棒的摄取,且细胞摄取二氧化硅包覆的金纳米棒的量存在时间依赖性。二氧化硅包覆的金纳米棒与HeLa细胞共孵育12和24h后观察,发现二氧化硅包覆的金纳米棒进入到HeLa细胞后主要聚集在溶酶体,并没有进入线粒体。该研究将为今后金纳米棒用于子宫颈癌的成像和治疗提供参考。     

吲哚美辛对人喉癌Hep-2细胞系侵袭力的影响

目的: 通过体外实验的方法探讨非甾体类抗炎药吲哚美辛对人喉癌Hep-2细胞系侵袭能力的影响。方法:Hep-2细胞经吲哚美辛作用后,撤药培养,绘制生长曲线,并用软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞非锚着生长能力,琼脂糖滴法检测肿瘤细胞移动能力,单层细胞侵袭实验计算肿瘤侵袭指数。结果:吲哚美辛作用后的Hep-2细胞软琼脂集落形成数目减少,细胞移动能力下降,单层细胞侵袭指数降低。结论:吲哚美辛能抑制人喉癌Hep-2细胞系的侵袭性。     

PFP、GrB的共表达杀伤人喉癌Hep-2细胞的体外研究

为探讨穿孔素(PFP)、颗粒酶B(GrB)共表达对人喉癌(Hep-2)细胞生长的抑制及其诱导该细胞的凋亡作用,采用RT-PCR的方法从人的喉癌组织浸润淋巴细胞中扩增全长PFP、GrB的cDNA片段,构建共表达重组体pVAX1-PIG,并将其转染入人的Hep-2细胞株中。收集转染后的Hep-2细胞,采用软琼脂集落形成实验、MTT法、原位末端标记法(TUNEL)、流式细胞仪(FCM)检测分析各组人Hep-2细胞的生长抑制及其凋亡情况。结果显示pVAX1-PIG转染组的集落形成数目比空白对照组与pVAX1转染组明显减少(P<0.05),MTT检测结果显示对照组细胞生长速度比pVAX1-PIG转染组要快。TUNEL染色、FCM法检测均显示pVAX1-PIG转染组的Hep-2细胞大量凋亡且其凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。因此,PFP、GrB的共表达能够抑制人Hep-2细胞的生长并且可以诱导该细胞的凋亡。     

羟基磷灰石纳米粒子细胞毒性和血液相容性的评价

目的研究羟基磷灰石纳米粒子细胞毒性和血液相容性。方法将羟基磷灰石纳米粒子以不同分散剂、不同终浓度作用于L929细胞,用MTT比色法观察其细胞毒性;用溶血试验检测其血液相容性。结果 MTT实验表明,不同浓度羟基磷灰石纳米粒子作用细胞后,细胞生长受到不同程度的抑制,这一抑制作用随羟基磷灰石纳米粒子浓度的升高而增强,同一样品各个浓度之间存在显著性差异。对于同一浓度,三种纳米粒子细胞毒性大小依次为：HAP3〉HAP2〉HAP1,而三种分散剂对细胞增殖的影响没有显著性差异。溶血试验表明,溶剂肝素钠、聚丙烯酸纳和三种不同浓度的HAP1纳米粒子均无溶血现象,而三种不同浓度的HAP2和HAP3均有溶血现象,HAP2对浓度存在依赖性,HAP3纳米粒子的三种浓度之间无显著性差异。结论羟基磷灰石纳米粒子对L929细胞增殖有抑制作用,血液相容性与不同的分散剂和纳米粒子浓度有关。     

锐钛矿型纳米二氧化钛颗粒对人肺腺癌A549细胞的毒性效应

目的:探讨锐钛矿型纳米二氧化钛颗粒(TiO2)对人肺腺癌A549细胞的毒性效应.方法:将不同浓度的锐钛矿型纳米TiO2颗粒悬液与A549细胞共孵育4h后,收集细胞.CCK-8法检测锐钛矿型纳米TiO2颗粒对细胞存活率的影响;采用激光扫描共聚焦显微镜观察锐钛矿型纳米TiO2颗粒进入细胞后活性氧(ROS)的产生状况;采用透射电镜观察锐钛矿型纳米TiO2颗粒引起细胞超微结构的变化.结果:纳米TiO2颗粒对细胞的生长具有抑制作用,且存在剂量-效应关系;染毒后细胞内产生ROS,随着TiO2浓度的增高,ROS的产生增多;透射电镜观察显示纳米TiO2颗粒成簇状存在于细胞中,并对细胞超微结构产生较大损伤.结论:锐钛矿型纳米TiO2颗粒能够诱导细胞产生活性氧,产生细胞毒性,从而损伤细胞超微结构,抑制细胞生长.     

p62在喉癌Hep-2细胞化疗耐药中的作用

目的:探讨p62在喉癌细胞Hep-2化疗耐药中的作用及潜在的作用机制。方法:实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-q PCR)及Western blot法检测喉癌耐药细胞Hep-2/5-FU及其亲本细胞Hep-2中p62的表达水平。在Hep-2/5-FU细胞中转染p62 siRNA敲减p62的表达,采用CCK-8法和流式细胞术检测细胞生存率及细胞凋亡状态;检测细胞中丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性来反映细胞氧化应激水平。Western blot检测细胞凋亡相关调控因子Bcl-2、Bax、caspase-8/cleaved caspase-8、caspase-3/cleaved caspase-3的蛋白水平及抗氧化通路Keap1/Nrf2的活性。结果:耐药细胞株Hep-2/5-FU中p62的mRNA及蛋白表达水平均明显高于亲本细胞株Hep-2;并且在亲本细胞株Hep-2中,p62和Nrf2的蛋白表达水平随着顺铂的浓度增加不断升高。沉默p62可抑制喉癌耐药细胞Hep-2/5-FU的生存,促进其凋亡,上调MDA的含量,降低SOD和GSH-Px的活性,同时上调Bax、cleaved caspase-8、cleaved caspase-3和Keap1的蛋白水平,下调Bcl-2、Nrf2及HO-1的蛋白表达。结论:喉癌耐药细胞Hep-2/5-FU中沉默p62可恢复细胞对5-FU的敏感性,其机制可能与抑制Keap1/Nrf2信号通路的活化、调控细胞内氧化应激反应及细胞凋亡有关。     

白术多糖通过调控线粒体凋亡途径诱导人子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡

目的：探讨白术多糖（PAM）对人子宫内膜癌RL95-2细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：预实验选取梯度浓度（0、7.5、15、30、60、120、240 mg/ml）的PAM作用于RL95-2细胞，MTT比色法检测细胞增殖活性，Bliss法计算24 h、48 h和72 h的半数抑制浓度（IC50）。正式实验中将RL95-2细胞分为空白对照组和不同浓度（15、30、60 mg/ml）PAM处理组。共培养48 h后，Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡；JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位变化；Western blot检测细胞线粒体和细胞质中细胞色素C(Cyt C)蛋白水平差异；分光光度法检测细胞中半胱天冬酶9(Caspase9)活性；Western blot检测线粒体凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax和cleaved-Caspase3）表达水平。结果：PAM可降低RL95-2细胞的增殖率，与药物浓度和作用时间有关。与空白对照组相比，PAM处理组细胞凋亡率显著增加（均P<0.01）；线粒体膜电位及Cyt C蛋白表达显著降低（均P<0.05），但细胞质中Cyt C蛋白...     

miR-122a 抑制人喉癌细胞株Hep2 细胞增殖的研究

目的:研究miR-122a 对人喉癌细胞株Hep2 细胞增殖、细胞周期以及相关蛋白表达量的影响。方法:人喉癌细胞株Hep2 细胞分别转染miR-122a 寡聚核苷酸(A 组)和miR-122a inhibitor(阻遏物)(B 组),同时设立阻遏物阴性对照( inhibitor negative control,miR-NC inhibitor)(C 组)和空白对照(D 组)。用RT-PCR、MTT 法、流式细胞仪和Western blot 技术评价各组细胞增殖和细胞周期的生物学特征。结果:转染miR-122a 寡聚核苷酸后,Hep2 细胞中miR-122a 表达显著增加。同D 组相比,A 组细胞增殖水平明显受到抑制,miR-122a 寡聚核苷酸能够有效诱导Hep-2 细胞周期阻滞在G1/ G0 期,A 组细胞分裂周期蛋白42 表达水平明显下调,细胞周期调控因子蛋白CDK4 及细胞周期素D1 蛋白表达水平明显降低。结论:miR-122a 寡聚核苷酸能够显著抑制喉癌细胞Hep2 的增殖,miR-122a 是潜在的人喉癌细胞基因治疗的候选靶点。