Accutase 消化传代对人胚胎纹状体来源神经干细胞凋亡的影响

目的：观察人类胚胎纹状体来源神经干细胞(neural stem cells,NSCs)经消化酶accutase消化传代后是否 发生了大量细胞凋亡。方法：提取人13~18周自然流产胚胎脑组织纹状体的NSCs,体外形成神经球并培养至3~5 代。经消化酶accutase消化后传代,运用活性caspase-3染色、TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)染色等方 法对多聚甲醛固定的NSCs进行凋亡检测,同时采用Annexin V和Hoechst33342/PI等联合染色方法对活细胞进行凋亡 鉴定,以确定NSCs在体外传代后的凋亡情况。结果：在传代后检测的3个时间点(1,24,72 h)中TUNEL染色和活 性caspase-3染色均高度重合。传代后1 h,TUNEL和活性caspase-3染色所检测到的凋亡率为20%~25%,传代后24 h增 高为75%~80%(P<0.01),而传代后72 h,由于存活下来的细胞开始增殖,所以整体凋亡率降为60%~70%,明显低于 24 h(P<0.01)。结论：由人类纹状体来源NSCs形成的神经球,经accutase消化传代后24 h内即发生大量细胞凋亡。对于 体外培养的NSCs,抑制其凋亡可能是促使其自我更新和增殖,最终起到提高细胞扩增能力的有效手段。     

一种新的将神经球分散为单细胞悬液的方法

目的比较3种将神经球打散成单细胞悬液的方法对神经干细胞活性的影响。方法将16~20周人胚胎神经干细胞体外培养扩增形成神经球,分别用胰蛋白酶消化法、巴斯德管吹打法和消化振荡法,将神经球打散成单细胞悬液,通过台盼蓝染色测定细胞活性及接种后增生情况,观察3种方法对神经干细胞活性的影响。结果消化振荡法打散神经球,细胞存活率(96.20%)和再次成球率(19.24%)都较其他2种方法高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论消化振荡法对人胚胎神经干细胞的活性影响较小,是一种有效、安全的将神经球打散成单细胞悬液的实验方法。     

传代对大鼠胚胎神经干细胞增生、凋亡和分化影响

目的探索传代对胚胎神经干细胞的增生、分化和凋亡等生物学性状的影响。方法原代培养后(P0)和经过两次传代后(P2)的神经干细胞用BrdU细胞增生检测试剂盒检测增生能力;用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测早期凋亡率;诱导分化7天后,分别进行MAP2和GFAP免疫荧光标记和Hoechst 33342核染色,计算MAP2 细胞和GFAP 细胞占Hoechst 细胞的各自比例。结果P0神经干细胞的OD值是:1.1899±0.0485(n=13),P2为0.3526±0.1053(n=11,P=0.000);P0的早期凋亡率为40.91%±12.74%(n=8),P2为24.31%±13.01%(n=9,P=0.018);P0和P2的神经元细胞比例分别为:58.81%±9.69%(n=10)和27.84%±5.70%(n=10,P=0.000),星形胶质细胞比例分别为22.85%±4.36%(n=10)和49.32%±6.95%(n=10,P=0.000)。结论传代后的神经干细胞的增生能力和早期凋亡率都会变弱,分化为神经元细胞的比例会降低,而星形胶质细胞的比例增大。     

胚胎小鼠神经干细胞的培养和诱导分化

目的 探索体外培养和诱导分化胚胎小鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法 .方法分离12.5 d ICR小鼠胚胎的大脑皮质,通过Accutase酶消化法和机械消化法,将组织消化成单个细胞,置于完全培养基中培养,3d后神经干细胞增殖成神经球;将传代的神经球消化,通过诱导培养基诱导其分化;采用细胞免疫荧光染色和qRT-PCR技术检测巢蛋白(Nestin)、中间微管相关蛋白2(Map2)和胶质纤维酸性蛋白(Gfap)的表达,鉴定NSCs、分化形成的神经元和星形胶质细胞.结果 NSCs能被Nestin特异性标记,诱导分化后的细胞可被Map2和Gfap抗体特异识别;qRT-PCR结果显示,诱导后Nestin的表达水平降低,而Map2和Gfap的表达水平升高.结论 通过Accutase酶消化法联合机械消化法分离小鼠胚胎脑皮质,进行体外培养,可获得具有自我更新能力和多向分化潜能的NSCs.     

胰酶消化法收集脊髓神经干细胞最佳消化时间的选择

目的:探索低浓度胰酶消化分离脊髓源性神经干细胞的最佳作用时间。方法:选用新生24h内大鼠的脊髓,取材后分别以0.125%胰蛋白酶37℃振荡消化15,30,45,60min和4℃消化过夜,以获取细胞。培养1周后分别计数和比较各组成活神经球数。nestin荧光染色及诱导神经球分化鉴定神经干细胞。结果:4℃过夜组培养失败,其余各组均培养出nestin表达阳性的神经球。15~60min各组培养1周后获得的神经球数为(2.8±0.81),(4.1±0.71),(7.5±1.44),(6.4±1.95)个/视野。消化45min组和60min组1周后成活神经球数最多(P<0.05)。结论:0.125%胰蛋白酶37℃振荡消化45、60min可以最有效的分离大鼠脊髓来源神经干细胞。     

胎鼠神经干细胞原代培养及传代条件优化

目的：探讨胎鼠神经干细胞(NSCs)原代培养方法和活性评价体系,确定NSCs的最佳传代条件。方法：选取孕11～14 d SD大鼠,提取胎鼠原代NSCs,采用巢蛋白免疫荧光染色鉴定NSCs。将NSCs以1.0×10⁴、2.0×10⁴、6.0×10⁴、1.0×10⁵、1.6×10⁵和2.0×10⁵ m L^-1的细胞密度进行传代培养48 h后观察神经球的形态表现,测定神经球直径。活死细胞染色法检测不同直径神经球中NSCs存活率。结果：NSCs呈巢蛋白阳性,培养的细胞为神经干细胞。NSCs呈聚集生长和牢固细胞间黏附聚集模式,形成神经球,平均直径为(152.72±47.52)μm,球与球之间少有单独的细胞散在。与2.0×10⁴ m L^-1传代密度比较,6.0×10⁴ m L^-1和1.0×10⁵ m L^-1传代密度的...     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响

目的探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型。将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,Western-blotting分析VEGF蛋白的表达,并用流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体。结果转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98±0.55)%,而转染pAdCMVVEGF165后的细胞凋亡率为(10.38±0.48)%(P<0.01),转染pAdCMVVEGF165 VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07±0.64)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论腺病毒介导的VEGF165基因能高效表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存。     

冬凌草甲素诱导胰腺癌PANC-1细胞凋亡及对G2/M细胞周期的阻滞作用

目的 探讨冬凌草甲素对胰腺癌PANC-1细胞生长抑制以及促进凋亡的机制.方法 采用MTT还原法检测冬凌草甲素对PANC-1细胞生长的抑制作用;碘化丙啶(PI)染色和Hoechst 33342染色法观察细胞形态学的变化;PI染色流式细胞术检测细胞周期分布;膜联蛋白V(Annexin V)/pI双标流式细胞术测定凋亡细胞比...     

神经干细胞在胚胎脑皮质发育过程中的变化

目的 比较3个不同胚胎时期神经干细胞的增生、分化和凋亡等生物学性状,了解胚胎脑皮质发育过程.方法E14、 E18和E20胎鼠前脑脑皮质来源的神经干细胞在原代培养后,用BrdU细胞增生检测试剂盒检测增生能力;诱导分化7天后,对细胞分别进行MAP2和GFAP免疫荧光标记和Hoechst 33342核染色,计算MAP2 细胞和GFAP 细胞占Hoechst 细胞的各自比例;用Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测早期凋亡率.结果 3组神经干细胞的OD值分别是:E14为1.1771±0.0422(n=22),E18为0.4127±0.0328(n=23),E20为0.2117±0.0456(n=16)(均为P<0.001);E14神经元细胞比例和星形胶质细胞比例分别为:81.96%±4.91%(n=10)和16.63%±4.05%(n=10),E18为27.56%±3.54%(n=10)和58.98%±5.91%(n=10),E20为4.75%±2.39%(n=10)和89.43%±3.40%(n=10)(均为P<0.001);早期凋亡率分别为:E14为41.12%±9.75%(n=8),E18为56.30%±9.35%(n=19),E20为5.74%±3.31%(n=9)(均为P<0.01).结论神经干细胞的增生能力随着胚胎发育变得越来越弱,而凋亡比例先小后大,最后逐渐变小.神经干细胞分化为神经元细胞的比例随着胚胎发育过程会越来越小,而星形胶质细胞的比例会越来越大.     

H2S对鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的影响

目的探讨硫化氢(H2S)对鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡的影响。方法采用碘化丙啶(PI)染色流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率;Hoechst33258染色荧光显微镜观察PC12细胞形态和核的形态。结果PC12细胞自然凋亡率为3.23%±0.64%,1和3μmol/L鱼藤酮作用于PC12细胞24 h后,细胞凋亡率分别为26.24%±2.92%(P<0.05)和48.82%±6.66%(P<0.01)。400μmol/L NaHS不诱导细胞凋亡,但可使1和3μmol/L鱼藤酮组细胞凋亡率分别下降到11.13%±3.82%(P<0.05)和31.28%±6.85%。结论H2S可以抑制鱼藤酮诱导PC12细胞凋亡。     

胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点

目的对比人胚胎干细胞(hESC)培养过程中不同的酶消化细胞的特点,探讨适合hESC长期体外培养的消化传代方法。方法将正常生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上的hESC分别用0.05%胰酶-EDTA和Ⅳ型胶原酶消化,重新接种,了解两种酶消化后的细胞存活率、克隆形成数量、细胞产量、冻存-复苏后细胞的存活率以及长期传代后细胞核型情况。结果用0.05%胰酶-EDTA消化传代后形成的克隆大小均一,每代第3d可获得碱性磷酸酶(AP)阳性克隆数(21.2±3.5)个/10倍视野,每次传代时hES细胞产量可达(4.56±1.29)×105/cm2,传代时细胞存活率高达95.60%,经冻存-复苏后也有81.20%细胞存活率。用Ⅳ型胶原酶消化组每代仅可获得低浓度胰酶消化组AP阳性克隆数的一半,克隆大小不均,细胞产量也比低浓度胰酶消化组少,传代时细胞存活率和复苏后细胞存活率和低浓度胰酶组相似。分别用两种酶处理传代十余代,核型均无异常。结论两种酶消化均适用于hESC培养,二者作用特点不完全相同,分别适用于不同的实验需要。     

绿色荧光蛋白转基因胎鼠神经干细胞的超顺磁性氧化铁标记

目的探讨超顺磁性氧化铁（SPIO）标记对绿色荧光蛋白（GFP）转基因胎鼠神经干细胞（NSCs）的标记效果及标记后对其生物学特性的影响.方法采用多聚赖氨酸（PLL）介导SPIO的方法标记NSCs,用普鲁士蓝染色观察标记后NSCs内铁,比较标记和未标记NSCs的GFP表达、活力、增殖、凋亡及多向分化能力.结果普鲁士蓝染色示标记NSCS胞质内见大量蓝色颗粒,细胞的活力、增殖、凋亡及多向分化能力检测均显示两组细胞间无明显差别.结论用PLL介导SPIO标记NSCs是一种可行、安全、有效的细胞内标记方法.     

超顺磁性氧化铁对大鼠神经干细胞生物学活性的影响

目的 初步研究利用超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓基质细胞来源的神经干细胞及其对细胞活力、增殖等生物学活性的影响,并确定最佳标记浓度.方法 无菌条件下取大鼠股骨骨髓,梯度密度离心法分离得到骨髓基质细胞.体外培养、诱导成神经干细胞,使用不同终浓度的(6.25、12.5、25、37.5、50μg/ml)Ferumoxides(超顺磁性氧化铁)标记神经干细胞,采用普鲁士蓝染色、MTT法、流式细胞仪、透射电镜等方法鉴定Ferumoxides标记神经干细胞的效率及对细胞活力、增殖等生物学特性的影响.结果 Ferumoxides可以高效率标记神经干细胞,标记效率在90%以上.普鲁士蓝染色显示标记的神经干细胞胞质内存在细小蓝色铁颗粒,细胞呈淡蓝至深蓝色,颜色的深浅与所加Ferumoxides的剂量成正相关.电镜结果显示标记的神经干细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡,主要集中在胞体上.当Ferumoxides终浓度高于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒在细胞内聚集成团块状,量较多,在一定程度上影响了细胞超微结构的观察;低于25 μg/ml时,Ferumoxides颗粒散布于细胞胞质内,并随着浓度的降低,Ferumoxides颗粒在胞质内分布越分散,量越少.MTT及流式细胞仪结果显示Ferumoxides终浓度大于25 μg/ml时则对细胞活力、增殖、凋亡有一定影响,小于等于25 μg/ml时对细胞活力、增殖无明显影响.结论 利用Ferumoxides在体外标记神经干细胞是一种可行的实验方案,其最佳终浓度为25 μg/ml.     

大鼠骨髓源神经干细胞的Sinerem体外标记及磁共振成像研究

目的 应用超小超顺磁性氧化铁(USPIO)Sinerem和转染试剂多聚赖氨酸(PLL)复合物标记大鼠骨髓源神经干细胞,初步评价磁共振成像活体示踪Sinerem标记干细胞的可行性.方法 分离SD大鼠骨髓基质干细胞,体外培养诱导成骨髓源神经干细胞.将制备的Sinerem-PLL复合物以浓度Sinerem 200μg/ml和干细胞共孵育培养过夜.采用普鲁士蓝染色和透射电镜确定细胞内铁的摄取、定位情况;并对细胞增殖、凋亡检测评价.体内外以SE序列T2WI与T2*WI行4.7T磁共振干细胞成像.结果 该方法标记干细胞效率为95%以上,普鲁士蓝染色显示铁颗粒存在胞质中,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;该浓度时Sinerem对细胞的活性影响与未标记细胞相比差异无统计学意义(P＞0.05).标记后细胞体内外的T2WI与T2*WI信号强度明显降低.结论 利用Sinerem对比剂经PLL介导标记骨髓源神经干细胞高效易行,磁共振可用于活体示踪神经干细胞.     

胎鼠脊髓神经干细胞分离培养及诱导分化

目的 探讨机械分离法与酶消化法在脊髓源性神经干细胞（NSCs）体外培养的优劣,并观察脊髓源性NSCs体外培养时增殖和分化的特点.方法 取妊娠第15天（E15 d）的胎鼠神经管组织,分别采用酶消化法和机械吹打分离法离散细胞,进行无血清培养,并以上述两种方法传代培养.借助免疫细胞化学法对NSCs及分化结果进行鉴定,细胞球计数法检测成球率,测量神经球直径分析细胞增殖能力,MTT法监测细胞生长情况.结果 ①培养的细胞具有增殖成球生长的特性并且抗巢蛋白免疫荧光阳性、血清可诱导分化出胶质细胞酸性蛋白（GFAP）、神经元特异性希醇化酶（NSE）阳性表达的细胞.②细胞直径：酶消化组（137.74±11.62）μm,机械分离组（143.69±12.20） μm（P ＞0.05）.③生长曲线结果显示酶消化组NSCs综合生长增殖能力较高,OD值：酶消化组（0.39 ±0.15）,机械分离组为（0.36±0.13）.结论 胎鼠脊髓组织中存在具有自我增殖和多分化潜能的NSCs,原代无血清成球培养时采用酶消化法更有利于获得较多NSCs.     

体外诱导人胚胎干细胞定向分化为神经干细胞

目的:探讨体外定向诱导人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)生成高纯度神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法.方法:模拟体内神经细胞分化发育的不同阶段及微环境,分三阶段诱导hESCs定向生成NSCs.形态学观察结合免疫荧光细胞化学、流式细胞术和RT-PCR检测胚胎干细胞标志和神经干细胞标志;NSCs分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测.结果:体外培养的hESCs在胚胎成纤维细胞饲养层上连续传代培养50代,仍保持SSEA-4,TRA-1-81阳性,表达Nanog基因,流式细胞术检测SSEA-4阳性表达率为83.44%;经三步法最终可诱导形成纯度高达90%以上的nestin阳性细胞,表达nestin基因,流式细胞术检测nestin阳性表达率为89.38%;诱导生成的细胞反复传代,仍表现为nestin阳性,并可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞.结论:模拟体内神经分化过程的三步诱导法,可诱导hESCs生成较高纯度的NSCs,并能较好维持其干细胞特性和具有进一步分化的能力.     

胞嘧啶脱氨酶基因修饰神经干细胞及其表达的离体实验研究

目的 探讨胞嘧啶脱氨酶(cytimidine deaminase，CD)基因修饰神经干细胞及其基因表达。方法 通过构建真核表达质粒pCMVCD，限制性内切酶消化鉴定后，采用Lipofectamine 2000脂质体介导法转染新生大鼠室管膜下区神经干细胞(Neural stem cells，NSCs)，G418筛选阳性克隆，加入不同浓度的5-氟胞嘧啶(5-Flourocytosine，5-FC)，MTT比色法测定NSCs的生存率。结果 本实验成功地培养并鉴定了神经干细胞，并将CD基因成功地转染了神经干细胞，G418阳性NSCs对低浓度5-FC高度敏感。结论 CD基因修饰神经干细胞的离体实验研究为干细胞治疗研究提供依据。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较理想的新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法。方法:新生大鼠大脑皮层通过胰酶消化获取单细胞悬液,用台盼蓝染色鉴定活性后种板培养;培养第3~4天加入阿糖胞苷纯化神经元;最后用甲苯胺蓝染色检测尼氏体进行鉴定。结果:实验获取细胞存活率高;在体外培养条件下细胞生长旺盛,培养第6~7天,细胞胞体较大,突起粗,分支多,突起交织成网,并能形成典型的神经细胞网络;培养第10~14天,检查有尼氏体细胞占90%以上。结论:该培养技术是大鼠皮层神经元体外培养的一种较理想的方法。