干扰维生素D3上调蛋白1通过调控Shh影响高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡

目的:探讨维生素D3上调蛋白1(VDUP-1)对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡的影响及机制。方法:人近端肾小管上皮HK-2细胞用高糖处理后,real-time PCR和Western blot检测细胞中VDUP-1的水平。HK-2细胞转染VDUP-1小干扰RNA,real-time PCR和Western blot检测抑制效果。高糖条件培养VDUP-1表达下调的HK-2细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量,Western blot检测细胞中音猬因子(Shh)信号通路关键蛋白Patched 1 (Ptch1)、Smoothened (Smo)、锌指蛋白Gli2和Shh的水平。用外源性Shh处理HK-2细胞,Western blot检测Ptch1、Smo和Gli2的水平。用外源性Shh处理VDUP-1表达下调的HK-2细胞,高糖处理后,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中caspase-3和caspase-9的活性,ELISA法测定培养液上清中TNF-α含量。结果:高糖处理后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平升高(P 0. 05)。转染VDUP-1小干扰RNA后,HK-2细胞中VDUP-1的mRNA和蛋白水平下降(P 0. 05)。与正常培养的细胞相比,高糖处理后HK-2细胞凋亡率显著升高,细胞中caspase-3和caspase-9活性明显升高,TNF-α含量亦明显升高(P 0. 05);下调VDUP-1表达后的HK-2细胞经高糖处理后细胞凋亡率显著降低,细胞中caspase-3和caspase-9活性也明显降低(P 0. 05)。高糖培养后细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh的蛋白水平下降,而下调VDUP-1表达部分拮抗高糖对HK-2细胞中Ptch1、Smo、Gli2和Shh表达的影响。外源性Shh可以促进细胞中Ptch1、Smo和Gli2的表达,抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡和分泌TNF-α,与下调VDUP-1共同抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。结论:干扰VDUP-1表达可能通过激活Shh信号通路抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和分泌TNF-α。     

PKM2对鼻咽癌细胞增殖凋亡糖酵解及ROS水平影响

目的探讨PKM2对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、糖酵解及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的影响。方法检测鼻咽上皮细胞(NP69)和鼻咽癌细胞(CNE-1、5-8F、HONE-1)中PKM2的表达水平。HONE-1细胞转染PKM2 siRNA1、PKM2siRNA2,采用RT-qPCR和Western blot检测干扰效果。细胞增殖、凋亡及细胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平,同时检测细胞ROS水平、HK活性、ATP含量和培养液上清中乳酸含量。结果鼻咽癌细胞中PKM2表达水平高于NP69细胞,且HONE-1细胞中PKM2 mRNA和蛋白水平最高,选用HONE-1细胞继续研究。转染PKM2 siRNA1、PKM2 siRNA2后均能够下调HONE-1细胞中PKM2水平,且PKM2 siRNA2下调效果较好。转染PKM2 siRNA2后的细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3水平、Cleaved Caspase-9水平、ROS水平明显升高,而细胞增殖活性、HK活性、ATP含量和上清液中乳酸含量明显降低(P 0. 05)。结论下调鼻咽癌细胞中PKM2表达可以抑制鼻咽癌细胞糖酵解和增殖,诱导鼻咽癌细胞凋亡。     

HIPK2基因对缺氧复氧诱导的NRK-52E肾小管上皮细胞活力和凋亡及JAK2/STAT3信号通路的影响

目的:探讨同源结构域相互作用蛋白激酶2(HIPK2)对缺氧复氧(H/R)诱导的NRK-52E肾小管上皮细胞活力和凋亡及JAK2/STAT3信号通路的影响。方法:通过Lipofectamine~(TM)2000将靶向HIPK2基因的小干扰RNA(siRNA)转染NRK-52E细胞,并设置正常对照组(control组)和阴性对照组(HIPK2-NC组),Western blot法检测转染48 h的效率;细胞经H/R处理后,通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率和Ca~(2+)荧光强度;Western blot法检测Ki67、cleaved caspase-3、caspase-12、Bcl-2、Bax、p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平。结果:靶向HIPK2的siRNA转染NRK-52E细胞后,HIPK2的蛋白表达显著低于control组(P0.05)。与control组比较,H/R组的细胞活力及Ki67和Bcl-2的蛋白表达均显著降低,细胞凋亡率、Ca~(2+)荧光强度值及cleaved caspase-3、caspase-12、Bax、p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平均显著升高(P0.05);与H/R组比较,HIPK2-siRNA+H/R组的细胞活力及Ki67和Bcl-2的蛋白表达均显著升高,细胞凋亡率、Ca~(2+)荧光强度值及cleaved caspase-3、caspase-12、Bax、p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平均显著降低(P0.05)。结论:抑制HIPK2基因表达可促进H/R诱导的NRK-52E肾小管上皮细胞生长,降低凋亡率,其机制可能与下调JAK2/STAT3信号通路相关蛋白水平有关。     

Snail1/IGF-1信号通路介导高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT

目的:观察高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E中锌指转录因子Snail1和胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)的表达变化,并初步探讨Snail1与IGF-1在糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程中的关系。方法:高糖培养大鼠近端肾小管上皮细胞系NRK-52E 72 h后,给予Snail1 siRNA和IGF-1 siRNA处理,分为高糖组、non-targeting(NT)siRNA组、Snail1 RNAi组和IGF-1 RNAi组,并设置对照组。于转染后48和72 h两个时点收获细胞。分别用实时荧光定量PCR检测细胞Snail1、IGF-1、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的mRNA表达,用免疫荧光方法检测各蛋白的表达。结果:高糖诱导NRK-52E细胞E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01),FN的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01);同时,Snail1和IGF-1的mRNA和蛋白表达也明显升高(P0.01)。Snail1 RNAi组与高糖组比较,细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01),FN、Snail1和IGF-1的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01),Snail1的mRNA表达减少62.8%。与高糖组比较,IGF-1 RNAi组细胞IGF-1的mRNA表达减少61.1%,E-cadherin的mRNA和蛋白表达明显升高(P0.01),FN的mRNA和蛋白表达明显降低(P0.01)。NT组E-cadherin、FN、Snail1及IGF-1的mRNA和蛋白表达与高糖组比较差异无统计学显著性。Pearson相关性分析显示,NRK-52E细胞中Snail1与IGF-1蛋白的表达呈显著正相关(r=0.852,P0.01)。结论:Snail1及IGF-1的mRNA和蛋白在高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT过程中表达升高,且沉默Snail1基因,IGF-1表达随之减少,提示Snail1/IGF-1可能促进DKD时肾小管上皮细胞EMT。     

敲低Txnip抑制高糖诱导的人肾小管细胞系凋亡

目的观察敲低Txnip对高糖诱导人肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法将体外培养人肾小管上皮细胞分为正常糖组、高糖组、高糖+质粒载体对照组及高糖+shRNA组。采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞ROS水平;Western blot检测caspase-3、cleaved caspase-3、BAX、BCL-2、P38 MAPK、P-P38 MAPK及细胞色素c的表达。结果与正常糖组相比,高糖组肾小管上皮细胞ROS产生和细胞凋亡明显增加(P0.01),cleaved caspase-3和P-P38 MAPK表达增高,BAX/BCL-2比率明显升高以及细胞色素c易位(P0.05)。敲低Txnip能够显著抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和ROS产生,下调cleaved caspase-3、和P-P38MAPK的表达,减少BAX/BCL-2比率和细胞色素c易位(P0.05)。结论敲低Txnip能够抑制高糖诱导的人肾小管上皮细胞凋亡可能是通过减少ROS产生,保护线粒体功能,抑制P38MAPK信号通路激活而实现的。     

下调lncRNA NEAT1通过NF-κB信号传导途径抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放北大核心CSCD

目的:探究下调lncRNA NEAT1对TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放的影响。方法:将肺泡上皮细胞A549分成Control组、TNF-α组(TNF-α处理)、sh-NC组(转染shRNA control,TNF-α处理)、sh-NEAT1组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α处理)、sh-NEAT1+PMA组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α和NF-κB信号激活剂PMA处理)。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中SOD活性,CellROX Green法检测细胞中ROS水平,ELISA检测IL-6、IL-8、IL-1β水平,Western blot检测Cleaved caspase-3、p65蛋白表达。结果:与Control组相比,TNF-α组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,MDA含量、ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β增多,细胞中p65蛋白表达水平升高。与sh-NC组相比,sh-NEAT1组肺泡上皮细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,MDA含量、ROS水平降低,SOD活性升高,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β减少,细胞中p65蛋白表达水平降低。与sh-NEAT1组相比,sh-NEAT1+PMA组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3、p65蛋白表达增多,MDA含量和ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β增多。结论:下调NEAT1通过降低NF-κB信号通路激活水平抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤和炎症因子释放。     

nmhaFGF对过氧化氢诱导的NRK52E细胞凋亡的拮抗作用

目的：研究过氧化氢诱导NRK52E细胞凋亡模型的制作方法，探讨非促分裂型人酸性成纤维细胞生长因子（non-mitogenic human acidic fibroblast growth factor，nmhaFGF）对过氧化氢诱导的大鼠肾小管上皮细胞（NRK52E细胞）凋亡是否具有拮抗作用。方法： 用MTT、Hoechst33342染色以及流式细胞仪检测确定诱导细胞凋亡的过氧化氢的浓度，制作NRK52E细胞凋亡模型，以不同浓度的nmhaFGF作用于凋亡细胞，并以haFGF作为对照，观察nmhaFGF对NRK52E细胞凋亡的影响。结果： 0.4 mmol/L过氧化氢作用NRK52E细胞18 h是诱导NRK52E细胞凋亡的最佳条件。nmhaFGF 0.01、0.03、0.10、0.30、1.00 mg/L剂量范围，随着nmhaFGF浓度升高，细胞凋亡率明显降低，而相同浓度haFGF各剂量组细胞凋亡率呈现不同程度的降低，但haFGF剂量组量效关系不明显。结论： 切除促分裂序列的haFGF可以发挥对NRK52E细胞凋亡的保护作用，该保护作用可能是通过其非促分裂活性实现的。     

沉默Smo基因对人宫颈癌HeLa细胞活力及凋亡的影响

目的:使用RNA干扰技术沉默Smoothened(Smo)基因,探讨其对宫颈癌He La细胞活力和凋亡的影响。方法:采用Smo shRNA转染宫颈癌He La细胞;采用RT-PCR和Western blot技术检测各组He La细胞Smo和转录因子Gli1的mRNA和蛋白表达;采用MTT比色法测定沉默Smo后细胞生长的情况;流式细胞术检测Smo shRNA对细胞周期和凋亡的影响。结果:与对照组比较,Smo shRNA转染细胞72 h后,Smo和Gli1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P0.05)。Smo基因沉默后,He La细胞的活力明显降低,细胞明显阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高。结论:沉默Smo基因可有效抑制人宫颈癌He La细胞生长,并诱导其凋亡。     

小檗碱对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化及TGF-β/Smad通路的影响

目的研究小檗碱(BBr)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞(NRK-52E)转分化(EMT)及TGF-β/Smad通路的影响。方法常规培养肾小管上皮细胞、传代、分组:1正常对照组;2TGF-β1组(10ng/ml TGF-β1作用48h);3小檗碱作用组(30μM小檗碱作用24h后加10ng/ml TGF-β1作用48h)。采用相差显微镜观察各组细胞表型改变,免疫荧光及Western Blot方法检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)、Smad2、Smad3、磷酸化的Smad2、3(P-Smad2、3)蛋白表达;应用流式细胞术,采用活性氧自由基(ROS)检测试剂盒检测各组别的ROS蛋白表达情况。结果 TGF-β1处理可导致NRK-52E细胞的α-SMA蛋白表达明显升高,E-cadherin蛋白表达降低。而小檗碱处理能够减少肾小管上皮细胞α-SMA的高表达,提高E-cadherin蛋白的表达;同时,小檗碱可有效降低由TGF-β1引起的NRK-52E细胞中ROS的过多产生。此外,小檗碱可有效抑制Smad2/3的活化。结论小檗碱可逆转TGF-β1所致的肾小管上皮细胞的EMT,其作用机制可能是通过抑制氧化应激及TGF-β/Smad信号通路而发挥作用。     

重组大鼠肝再生增强因子抑制庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞凋亡的机制研究

目的： 探讨重组大鼠肝再生增强因子（rrALR）在体外对庆大霉素（GM）诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E细胞）凋亡的影响及其作用机制。方法: 将NRK-52E细胞分为正常对照组、庆大霉素处理组（GM 1.6 g/L）和rrALR干预组（分别加入GM 和不同浓度的rrALR）,培养细胞24 h、48 h。吖啶橙/溴乙啶（AO/EB）染色、DNA琼脂糖凝胶电泳及Annexin V/PI双染流式细胞术检测各组细胞的凋亡状态。Western blotting和RT-PCR检测各组细胞不同时点Bcl-2和Bax蛋白、mRNA的表达。结果: (1)rrALR对庆大霉素诱导的NRK-52E细胞凋亡具有抑制作用（P＜0．05）。 (2)rrALR能够呈剂量依赖方式增加细胞Bcl-2蛋白及核酸的表达（P＜0．05）、降低细胞Bax蛋白及核酸的表达(P＜0．05),使Bcl-2/Bax比值升高（P＜0．05）。结论: rrALR可以通过调节Bcl-2家族Bax和Bcl-2蛋白及核酸的表达水平,抑制庆大霉素诱导的肾小管上皮细胞凋亡,减轻肾毒性药物对小管上皮细胞的损伤。     

环杷明对马兜铃酸诱导的肾上皮细胞表型转化及Hedgehog通路的影响

目的:探讨环杷明干预Hedgehog(HH)信号对马兜铃酸(AA)致肾小管上皮细胞表型转化和基质累积的影响。方法:根据干预措施将体外培养的大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E分为溶剂对照组、AA损伤组(分别用终浓度为1、5和10 mg/L的AA处理细胞)和环杷明干预组(10 mg/L AA基础上加入1、5和10μmol/L环杷明)。细胞培养24 h后,用real-time PCR检测HH信号关键分子Ptch1和Smo、表型转化相关分子α-SMA和E-cadherin、ZO-1、BMP-7和基质成分I型和III型胶原mRNA的表达;ELISA法检测Shh和TGF-β1的含量;细胞免疫荧光染色检测Ptch1、Smo、E-cadherin、α-SMA和III型胶原蛋白表达。结果:AA不仅增加了TGF-β1、α-SMA和III型胶原的表达,降低了E-cadherin和ZO-1的表达,而且诱导了Shh和Smo mRNA表达的升高和Ptch1 mRNA表达的下降,提示AA促进小管上皮细胞表型转化和胶原累积,同时也激活了HH信号通路。环杷明干预AA作用后,Smo mRNA或蛋白表达下调,Ptch1 mRNA表达升高,这说明环杷明抑制了AA诱导的HH信号通路的活化。此外,环杷明也降低TGF-β1、α-SMA、I型和III型胶原的表达,提高BMP-7、ZO-1和E-cadherin的表达,这提示环杷明抑制了AA所致的上皮细胞的表型转化和基质累积。结论:环杷明可抑制AA所致的肾小管上皮细胞表型转化和基质累积,可能是通过靶向抑制HH信号的活化来实现的。     

TLR4/NLRP3炎症复合体介导对比剂诱导的肾小管上皮细胞炎症和损伤

目的:探讨Toll样受体4(TLR4)/Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症复合体是否介导了对比剂(CM)引起的肾小管上皮细胞炎症和损伤。方法:本研究运用碘普罗胺作用于大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E建立损伤模型。应用CCK-8法测定细胞存活率;Western blot测定TLR4、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1和cleaved caspase-3的蛋白水平;ELISA法检测炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18的水平;Hoechst 33258核染色法检测凋亡率;JC-1染色法测定线粒体膜电位。用小干扰RNA沉默NLRP3表达。结果:CM可降低NRK-52E细胞的存活率并上调cleaved caspase-3的蛋白水平(P0.05);此外,CM可上调细胞TLR4/NLRP3炎症复合体的表达并促进炎症因子IL-1β和IL-18的分泌(P0.05)。沉默NLRP3可以对抗CM诱导的炎症因子分泌;TLR4抑制剂TAK-242及沉默NLRP3能减轻CM引起的细胞凋亡和线粒体功能损伤。结论:TLR4/NLRP3炎症复合体参与了CM致急性肾损伤的发病机制,并介导了CM诱导的肾小管上皮细胞损伤和炎症。     

槲皮素对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞细胞外基质积聚的影响

目的：观察转化生长因子（TGF）-β₁对大鼠肾小管上皮细胞MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ表达的影响，并探讨槲皮素的作用。方法:以大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）为研究对象，采用TGF-β₁(10 μg/L)刺激，部分实验中培养的细胞在刺激前用槲皮素(50 μmol/L)预处理90 min。MCP-1及COL-Ⅰ mRNA的表达采用RT-PCR检测。PAI-1mRNA和蛋白的表达分别采用RT-PCR和Western blotting 法检测。结果:NRK-52E 细胞在TGF-β₁刺激后MCP-1 mRNA显著上调，在2 h开始升高，8 h达高峰，呈时间依赖性；PAI-1 mRNA和蛋白的表达也显著增加；同时，TGF-β₁还显著上调Col-ⅠmRNA的表达，24 h为正常的2.4倍（P<0.05）。槲皮素预处理后，TGF-β₁诱导的MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的上调表达均受到明显抑制（P<0.05）。结论:槲皮素能够通过抑制MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的表达而部分逆转TGF-β₁诱导的肾小管上皮细胞细胞外基质的积聚，这可能有利于延缓肾间质纤维化的发生和发展。     

BDNF-AS/miR-145-5p轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响CSCD

目的探讨脑源性神经营养因子反义RNA(brain-derived neurotrophic factor-antisense, BDNF-AS)对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响和可能机制。方法体外培养肾小管上皮细胞HK-2, 分别转染BDNF-AS小干扰RNA、miR-145-5p模拟物或共转染BDNF-AS小干扰RNA和miR-145-5p抑制剂, 之后采用30 mmol/L葡萄糖干预转染后的细胞24 h, 用RT-qPCR法检测细胞中BDNF-AS和miR-145-5p的表达, 用CCK-8法检测细胞增殖, 流式细胞术检测细胞凋亡, Western印迹法检测细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达, 酶联免疫吸附法检测细胞培养上清中IL-1β和IL-6的水平。用双荧光素酶报告基因实验验证BDNF-AS和miR-145-5p的调控关系。结果高糖处理促进了HK-2细胞中BDNF-AS的表达(P<0.05), 而抑制了miR-145-5p的表达(P<0.05)。干扰BDNF-AS或过表达miR-145-5p降低了高糖诱导的HK-2细胞抑制率、凋亡率及Bax蛋白、IL-1β和IL-6的表达(P<0.05), 促进了Bcl-2蛋白的表达(P<0.05)。干扰miR-145-5p逆转了干扰BDNF-AS对高糖诱导的HK-2细胞增殖、凋亡及IL-1β和IL-6表达的影响。BDNF-AS可靶向结合并负调控miR-145-5p。结论干扰BDNF-AS可能通过靶向负调控miR-145-5p促进高糖诱导的肾小管上皮细胞增殖, 并抑制细胞凋亡及炎症因子表达。     

Src homology 2-containing phosphotyrosine phosphatase regulates endothelin-1-induced epidermal growth factor receptor transactivation in rat renal tubular cell NRK-52E

Epidermal growth factor (EGF) and endothelin-1 (ET-1) have been shown to be involved in proliferation and autoregeneration of renal tubular cells. This study aims to investigate the regulatory mechanism of ET-1-mediated EGF receptor (EGFR) transactivation in rat renal tubular cells (NRK-52E). Exposure of NRK-52E cells to ET-1 was found to stimulate the phosphorylation of EGFR and induce reactive oxygen species (ROS) generation. Both NAD(P)H oxidase inhibitor, diphenyliodonium (DPI) and ROS scavenger N-acetylcysteine (NAC), inhibited EGFR transactivation and extracellular signal-regulated kinase (ERK) phosphorylation caused by ET-1. In contrast, blockade of EGFR by AG1478 inhibited the phosphorylation of ERK but not ROS generation following ET-1 exposure. We found that the catalytic cysteine of Src homology 2-containing phosphotyrosine phosphatase (SHP-2) was transiently oxidized by ET-1 treatment in a modified malachite green phosphatase assay. In EGFR co-immunoprecipitation, SHP-2 was also found to interact with EGFR following ET-1 treatment. In SHP-2 knockdown NRK-52E cells, ET-1-induced EGFR transactivation was dramatically elevated and not influenced by NAC. However, GM6001 (an MMP inhibitor) and heparin binding (HB)-EGF neutralizing antibody suppressed this elevation. Our data suggest that ROS-mediated oxidation of SHP-2 is essential for HB-EGF-mediated EGFR transactivation in ET-1 signaling pathway in NRK-52E cells.     

TLR4对氧化低密度脂蛋白作用巨噬细胞后凋亡和炎症因子的影响

目的：研究Toll样受体4（TLR4）对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）作用后巨噬细胞凋亡和炎症因子的影响。方法：巨噬细胞Ana-1分为Con（不做处理）、ox-LDL（50 pg/ml ox-LDL处理）、TAK-242（50 pg/ml ox-LDL和20 μmol/L的TLR4阻断剂TAK-242处理）。流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved Caspase-3）、核因子-κBp65（NF-κBp65）、TLR4蛋白水平,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞中ROS水平,ELISA检测培养液上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平。结果：ox-LDL处理后的Ana-1细胞中TLR4表达水平升高,而TLR4阻断剂TAK-242可以部分降低细胞中TLR4水平。ox-LDL细胞凋亡率从（6.12±0.95）%升高到（45.35±2.71）%,而TAK-242作用后的凋亡率降低至（29.59±4.23）%,同时ox-LDL细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65水平和ROS水平均明显高于Con（P<0.05）,而TAK-242细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、NF-κBp65水平ROS水平均明显低于ox-LDL（P<0.05）。ox-LDL细胞培养液上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明显高于Con（P<0.05）,而TAK-242细胞培养液上清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明显低于ox-LDL（P<0.05）。结论：巨噬细胞经过ox-LDL作用后细胞中TLR4表达升高,细胞凋亡增多,细胞分泌的炎症因子水平升高,细胞中ROS水平和NF-κBp65水平均升高,而敲低TLR4能够抑制ox-LDL的上述作用。     

PTEN 在动脉粥样硬化中的表达及对血管内皮细胞增殖凋亡的影响研究

目的:探讨第10号染色体同源缺失性磷酸酶鄄张力蛋白(PTEN)在动脉粥样硬化中的表达及对血管内皮细胞(VEC)增殖凋亡的影响。方法:构建动脉粥样硬化小鼠模型,Real-time PCR和Western blot检测动脉粥样硬化组织中PTEN水平;用不同浓度的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)处理大鼠VEC,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性。VEC转染PTEN过表达载体(pSicoR-PTEN),用ox-LDL 处理细胞,Real-time PCR和Western blot检测PTEN水平,MTT检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot 检测磷酸化的STAT3(p-STAT3)、信号转导与转录因子3(STAT3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)水平。结果:动脉粥样硬化组织中的PTEN水平明显低于正常的动脉组织(P<0.05)。不同浓度的ox-LDL处理后的VEC存活率明显降低,并且细胞存活率随着ox-LDL浓度的升高而降低。Ox-LDL作用后的VEC中PTEN表达水平下降,而转染pSicoR-PTEN后可以提高VEC中PTEN表达水平。Ox-LDL处理后的VEC凋亡率增加,细胞中Cleaved Caspase-3水平升高,p-STAT3 水平下降,与正常培养的VEC相比差异具有统计学意义(P<0.05)。转染pSicoR-PTEN后VEC 经过ox-LDL处理后细胞存活率、p-STAT3 水平明显升高,而细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3水平明显降低,与单纯ox-LDL处理后的细胞相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:PTEN 在动脉粥样硬化组织中表达下调,PTEN 可以逆转ox-LDL对VEC增殖抑制和凋亡促进作用,作用机制可能与STAT3 信号通路的激活有关。