脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件．比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞＋10％胎牛血清或Mesencuit^TM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用Mesencult^TM培养基＋10％胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的优化

目的探索脐血来源的间充质干细胞体外分离培养的更优方法。方法无菌条件下抽取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。50份脐血分为对照组和改良组,每组25份,分别以1.5×10^7/ml的细胞密度接种于25 cm^2培养瓶中。对照组贴壁3 d后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液;改良组贴壁0.5 h后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液。结果对照组杂细胞较多,最终成功培养出8份脐血间充质干细胞;改良组杂细胞较少,最终成功培养出18份脐血间充质干细胞。经流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,所培养出的脐血间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论采取脐血单个核细胞贴壁0.5 h弃上清更换新鲜培养液可以明显提高脐血间充质干细胞的培养成功率,其结果优于脐血单个核细胞贴壁3 d弃上清更换新鲜培养液。     

人脐血CD34^＋细胞体外诱导分化为树突状细胞及其扩增

目的采用脐血CD34^＋细胞在rhGM—CSF、rhTNF—α诱导下体外分化扩增为成熟树突状细胞。方法应用CD34^＋干细胞分选试剂盒以及免疫磁珠法从脐血中分离CD34^＋细胞,用rhGM—CSF、rhTNF—α联合诱导分化发育14d,成为成熟DC,观察细胞形态及检测CD83分子表达。结果50ml脐带血可分离出CD34^＋细胞约1．1×10^6,在rhGM—CSF、rhTNF-α诱导下CD34^＋干细胞培养2周,约扩增10～20倍。CD34^＋干细胞培养第3d开始出现集落,第8～9天集落最大,CD34^＋千细胞分化发育为有树突状突起的成熟DC,表面分子CD83阳性率为81．7％。结论体外联合运用rhGM—CSF、rhTNF—α,能够成功诱导脐血CD34^＋细胞分化为大量成熟的DCs。     

诱导分化骨髓干细胞（MSCs）构建膀胱的实验研究

目的分离提起大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,体外培养扩增SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,通过组织工程技术．构建组织构建膀胱,为进一步临床应用奠定基础。方法将sD大鼠骨髓间充质干细胞进行体外培养扩增后,以生长状态良好的骨髓问充质干细胞接种于制备好的聚乳酸一聚乙醇酸支架上,进行体外联合培养,构建组织工程皮肤。观察细胞生长情况及组织工程构建膀胱。结果体外培养的SD大鼠骨髓间充质干细胞生长良好,传代扩增容易,骨髓间充质干细胞在聚乳酸一聚乙醇酸基质中生长良好,可体外构建组织工程膀胱。结论通过利用体外扩增培养的骨髓问充质干细胞制备的上皮细胞可以体外聚乳酸一聚乙醇酸支架构建组织工程膀胱。     

重组人白细胞介素11对两种血小板减少症患儿骨髓巨核系祖细胞的作用

目的研究重组人白细胞介素11（recombinant human interleukin 11，rhIL-11）对慢性特发性血小板减少性紫癜（chronic idiopathic thrombocytopenic purpura，CITP）与再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）患儿骨髓巨核系祖细胞（megakaryocyte progenitor）体外生长的影响。方法收集17例CITP患儿及14例AA患儿骨髓，对照组为骨髓检查三系造血功能正常、排除血液系统疾病儿童10例。无血清培养各组骨髓单个核细胞（mononuclear cells，MNC），培养体系中包含血小板生成素（TPO）、可溶性补体结合（SCF），IL-3，rhIL-11，或TPO，SCF，IL-3。培养第14天，用流式细胞仪测定CD41^＋细胞率，CD41结合的碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase—anti—alkaline phosphatase，APAAP）桥联酶标技术鉴定半固体培养的巨核细胞集落形成单位（megakaryocyte colony forming unit，CFU—MK）和巨核细胞爆式集落形成单位（megakaryocyte burst forming unit，BFU—MK）。结果rhIL-11联合TPO等细胞因子，可促进对照组、CITP组CFU—MK和BFU—MK生成（P〈0．01），提高CD41^＋细胞率（P〈0．01）；但对AA组，CFU—MK和CD41^＋细胞率无明显的作用（P〉0．05）。结论rhIL-11联合TPO等细胞因子，可促进CITP患儿骨髓巨核系祖细胞在体外无血清培养条件下的增殖，提示rhIL-11具有治疗CITP的潜在价值，但对AA患儿的骨髓巨核系祖细胞生成并无明显的效果。     

脐血的临床应用前景

自90年代以来。我国亦开展了脐血系列研究。其中报道较多的内容之一为脐血中造血干／祖细胞数量与类别研究。研究结果验证了脐血单个核细胞（MNC）可形成粒、巨噬细胞集落形成单位（CFU—GM）。爆增型红细胞集落形成单位（BFU—E）、巨核细胞集落形成单位（CFU—Meg）和混合型集落形成单位（CFU—MIX）。但各家实验结果不尽相同，可能与分离细胞的方法、细胞培养条件及培养时间不同有关。可以肯定：（1）脐血含有丰富的多潜能和各系干／祖细胞。（2）脐血干／祖细胞远远超过成人外周血，有的组分超过成人骨髓。（3）脐血是造血干／…     

脐血与脐带间充质干细胞的分离、扩增、分化比较

目的比较人脐血、脐带组织间充质干细胞体外分离、扩增与成骨、成脂肪细胞分化的方法与条件,比较相应实验的难易度。方法脐血采用沉降红细胞后密度梯度法及CD34+免疫磁珠负选法分离单个核细胞+10%胎牛血清或MesencultTM培养基培养传代,集落生长细胞向成骨、脂肪细胞定向诱导分化;脐带沿血管灌入胶原酶悬液,获取细胞培养、扩增,细胞呈集落生长后传代,定向成骨、成脂肪细胞分化。结果脐血经沉降红细胞后分离的MNCs,使用MesencultTM培养基+10%胎牛血清培养成功率高,集落细胞能向成骨、成脂肪细胞定向诱导分化。脐带去除血管后灌注可获得贴壁生长的细胞,能扩增形成集落,并向成骨、成脂肪细胞定向分化。结论脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增及分化,但难度较大。脐带组织存在间充质干细胞,并可在体外进行培养扩增形成集落细胞传代,集落细胞能够向成骨、成脂肪细胞分化,方法较脐血容易。     

TRAIL净化自体造血干细胞移植物中白血病细胞的实验研究

目的探讨TRAIL作为自体造血干细胞移植物体外净化剂的可行性。方法常规分离骨髓单个核细胞，分别以PE—DcR1、PE—DcR2荧光染色，荧光显微镜观察观察TRAIL诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓单个核细胞的表达及定位。200ng／ml的TRAIL作用骨髓单个核细胞、白血病Jurkat细胞系18h，FITC-Annexin V／PI标记流式细胞仪定量凋亡率，并将经上述处理的骨髓单个核细胞行成纤维细胞集落（CFU—F）培养。将绿色荧光蛋白标记的Jurkat细胞和骨髓单个核细胞混合经200ng／ml TRAIL作用24h，在GM—CSF和EPO作用下行集落培养，第7天计数Jurkat细胞所形成的荧光集落及骨髓单个核细胞所形成的非荧光集落数CFU—GM和BFU—E。结果TRAIL诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓单个核细胞均有表达，且主要定位于胞浆和胞膜。200ng／mlTRAIL作用18h，骨髓单个核细胞、Jurkat细胞系凋亡率分别为（5．95±1．23）％、（33．42±2．28）％，2组间差异有统计学意义（P〈0.01）。TRAIL组每4×10^6个骨髓单个核细胞形成CFU—F集落数为235．67±33．56，与对照组249．33±42．72比较差异无统计学意义（P〉0．05）。200ng／mlTRAIL明显抑制Jurkat细胞所形成荧光集落，但基本不影响骨髓单个核细胞CFU—GM和BFU—E的形成。结论TRAIL能选择性地诱导Jurkat细胞凋亡，而对骨髓单个核细胞无明显毒性作用，可用于自体造血干细胞移植物体外净化。     

应用血细胞分离机大容量白细胞单采术采集小儿外周血干细胞

目的总结血细胞分离机大容量白细胞单采术（large-volume leukapheresis，LVLs）采集小儿外周血干细胞（peripheral blood stem cell，PBSC）的经验，探讨采集效果及其影响因素。方法中山大学附属第二医院儿科造血干细胞移植中心自1999年1月至2007年12月采用CS3000 Plus血细胞分离机，选择儿童单个核细胞（MNC）收集程序，进行40例患儿大容量外周血干细胞采集。采取回顾性分析法分析单个核细胞采集量与采集效率及其影响因素和对外周血象与电解质的影响，以及采集不良反应发生率与机器常见报警（故障）。结果对40例个体大容量外周血干细胞采集共计76次。其中，采集1次为5例，3次为1例，其余均采集2次。每次循环3～4倍血容量，单个核细胞采集效率平均为45．2％（30．0％～112．0％），收集单个核细胞中位数为2．5（1．2～6．5）×10^8／kg，CD34^＋细胞中位数为3．5（2．7～14．9）×10^6／kg，后两者间有良好相关性（r=0．78，P〈0．05）。单个核细胞采集量与总处理血容量呈正相关（r=0．45，P〈0．05），与采集前外周血白细胞、外周血单个核细胞和外周血CD34^＋细胞数呈显著正相关（r=0．60，P〈0．05）；（r=0．68，P〈0．05）；（r=0．75，P〈0．05）。采集后，外周血血红蛋白（Hb）和血小板（PLT）下降，第2次采集后与采集前比较，差异有显著意义（P〈0．05）。采集大容量外周血干细胞前、后，个体的电解质水平变化比较，差异无显著意义（P〉0．05）。76例次大容量外周血干细胞采集过程中，发生相关不良反应14例次（18．4％，14／76），机器出现报警或故障67例次（88．2％，67／76），处理后均顺利完成采集。结论应用血细胞分离机大容量白细胞单采术采集小儿外周血干细胞的方法可靠，采集过程安全，可收集足量造血干（祖）细胞。适当增加处理血容量?     

小鼠骨髓间充质干细胞调节T细胞亚群表达趋化因子受体的研究

目的：研究小鼠T淋巴细胞亚群受骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）调控表达趋化因子受体的变化。方法：小鼠骨髓细胞悬液进行贴壁培养法分离出骨髓间充质干细胞,经培养扩增后按不同比例（10%及1%）与经过植物血凝素（PHA）刺激的小鼠淋巴细胞混合培养,流式细胞术检测趋化因子受体CXCR3,CCR5,CCR7在不同T细胞亚群中表达的变化。结果：在CD3＋CD8＋亚群中,添加了骨髓间充质干细胞的两个培养组均较对照组增高表达CXCR3及CCR7（P〈0.05）,而CCR5仅在10%MSC的高浓度组较对照组有增高表达。在CD3＋CD4＋亚群中,CXCR3的表达在10%MSC组、1%MSC组及对照组表达差异均无统计学意义（P〉0.05）;CCR5及CCR7在添加了骨髓间充质干细胞的两个培养组均较对照组增高表达,且在该两种骨髓间充质干细胞浓度梯度中呈剂量依赖性。结论：骨髓间充质干细胞在与淋巴细胞呈一定的细胞比例共培养时能不同程度上调T淋巴细胞及亚群表达趋化因子受体CXCR3、CCR5、CCR7,提示骨髓间充质干细胞可提高T淋巴细胞亚群的趋化能力。     

脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的观察脐带血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性。方法抽取骨髓穿刺液10ml,采用含10％脐带血清的DMEM／F12培养,流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系诱导BM—MSCs定向分化。结果BM—MSC—Ss高表达CD29、CD73、CD105,不表达CD34、CIM5、CD31,BM—MSCs体外能诱导为成骨细胞和脂肪细胞。结论脐带血清培养的BM—MSCs的具有较高的纯度和体外分化能力,脐带血清培养BM—MSCs适合临床应用。     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

脐带间充质细胞来源诱导性多潜能干细胞的建立和鉴定

目的建立和鉴定脐带间充质细胞（UMC）来源的诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法以逆转录病毒作为Sox2、KIf4、Oct4、c—Myc基因转移载体,将UMC细胞编程为iPS细胞。应用RT-PCR检测细胞基因表达量,鉴定外源编程基因是否整合到iPS细胞核内,分析细胞核型,对细胞进行碱性磷酸酶染色和免疫荧光染色,体内分化畸胎瘤和体外分化拟胚体实验,对建立的iPS细胞进行鉴定。结果（1）iPS细胞形态学上类似于胚胎干细胞（ES）。（2）iPS与ES细胞内源多能基因（Nanog、Oct-4、Rexl、Sox-2）表达谱相类似,外源编程基因（Sox-2、KIf4、Oct-4、c—Myc）表达发生沉默。（3）外源编程基因已被插入到iPS细胞核内。（4）iPS细胞核型正常,碱性磷酸酶活性增高,表达Es细胞特异性膜蛋白（SSEA3、SSEA4）,质蛋白（TRA-1-60、TRA-1—81）,核蛋白（Nanog）。（5）iPS细胞在体内能分化为畸胎瘤,在体外能分化为拟胚体。结论iPS细胞类似于Es细胞具有多向分化潜能。     

骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内定植研究

目的：观察骨髓间充质干细胞移植在肺气肿大鼠模型肺组织内的定植情况。方法：选择健康SD大鼠34只,按随机数字表法分为MSCs干预组（A组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注MSC 1×106个/mL）,肺气肿模型组（B组,10只,慢阻肺大鼠,尾静脉输注等体积PBS）及MSC对照组（C组,10只,正常大鼠,尾静脉输注MSCs 1×106个/mL）,正常对照组（D组,4只,正常大鼠,尾静脉输注等体积PBS）,采用烟熏法复制大鼠肺气肿模型。全骨髓培养法体外培养扩增雄性SD大鼠来源的MSCs,经GFP标记细胞后将其经尾静脉注入肺气肿模型SD大鼠体内,24 h内处死大鼠,取肺组织迅速冰冻切片,共聚焦激光显微镜下观察观察转染GPF的间充质干细胞在大鼠肺内定植情况。结果：成功培养具有分化潜能的骨髓间充质干细胞,MSCs传至第4代时有99.5%表达CD44、99.6%表达CD29等间充质干细胞表面标志,仅有0.4%表达CD34、1.0%表达CD45单核细胞以及造血干细胞表型;成功复制大鼠肺气肿模型,香烟烟雾暴露组（A、B组）平均肺泡间隔为（119.0±26.2）μm,高于对照组（C、D组）的（89.8±17.3）μm,差异有统计学意义（P〈0.05）;平均肺泡数为（173.9±68.3）个/mm2低于对照组的（280.3±104.0）个/mm2,差异有统计学意义（P〈0.05）;显微共聚焦发现MSCs经尾静脉注入大鼠体内24 h后可见A组大鼠肺组织内转染绿色荧光蛋白质粒的MSCs,而B组、C组及D组均未见转染荧光。结论：骨髓间充质干细胞经尾静脉输注入后可在肺气肿模型大鼠肺内定植,为MSCs治疗慢阻肺可能提供理论依据。     

Effects of a 2-step culture with cytokine combinations on megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis from carbon-ion beam-irradiated human hematopoietic stem/progenitor cells

To evaluate whether the continuous treatment of two cytokine combinations is effective in megakaryocytopoiesis and thrombopoiesis in hematopoietic stem/progenitor cells exposed to heavy ion beams, the effects of a 2-step culture by a combination of recombinant human interleukin-3 (IL-3) + stem cell factor (SCF) + thrombopoietin (TPO), which just slightly protected against carbon-ion beam-induced damages, and a combination of IL-3 + TPO, which selectively stimulated the differentiation of the hematopoietic stem/progenitor cells to megakaryocytes and platelets, were examined. CD34(+)-hematopoietic stem/progenitor cells isolated from the human placental and umbilical cord blood were exposed to carbon-ion beams (LET = 50 keV/microm) at 2 Gy. These cells were cultured under three cytokine conditions. The number of megakaryocytes, platelets and hematopoietic progenitors were assessed using a flow cytometer and a clonogenic assay at 14 and 21 days after irradiation, respectively. However, the efficacy of each 2-step culture was equal or lower than that of using the IL-3 + SCF + TPO combination alone and the 2-step culture could not induce megakaryocytes and platelets from hematopoietic stem/progenitor cells exposed to high LET-radiation such as carbon-ion beams. Therefore, additional cytokines and/or hematopoietic promoting compounds might be required to overcome damage to hematopoietic cells by high LET radiation.     

Long-term hematopoietic stem cell damage in a murine model of the hematopoietic syndrome of the acute radiation syndrome

ABSTRACT: Residual bone marrow damage (RBMD) persists for years following exposure to radiation and is believed to be due to decreased self-renewal potential of radiation-damaged hematopoietic stem cells (HSC). Current literature has examined primarily sublethal doses of radiation and time points within a few months of exposure. In this study, the authors examined RBMD in mice surviving lethal doses of total body ionizing irradiation (TBI) in a murine model of the Hematopoietic Syndrome of the Acute Radiation Syndrome (H-ARS). Survivors were analyzed at various time points up to 19 mo post-TBI for hematopoietic function. The competitive bone marrow (BM) repopulating potential of 150 purified c-Kit+ Sca-1+ lineage- CD150+ cells (KSLCD150+) remained severely deficient throughout the study compared to KSLCD150+ cells from non-TBI age-matched controls. The minimal engraftment from these TBI HSCs is predominantly myeloid, with minimal production of lymphocytes both in vitro and in vivo. All classes of blood cells as well as BM cellularity were significantly decreased in TBI mice, especially at later time points as mice aged. Primitive BM hematopoietic cells (KSLCD150+) displayed significantly increased cell cycling in TBI mice at all time points, which may be a physiological attempt to maintain HSC numbers in the post-irradiation state. Taken together, these data suggest that the increased cycling among primitive hematopoietic cells in survivors of lethal radiation may contribute to long-term HSC exhaustion and subsequent RBMD, exacerbated by the added insult of aging at later time points.     

革皮氏海参皂苷对环磷酰胺所致骨髓损伤模型小鼠造血作用的研究

目的研究革皮氏海参(Pearsonothuria graeffeii)皂苷对环磷酰胺所致骨髓损伤模型小鼠造血的调节作用。方法用不同剂量的革皮氏海参皂苷分别灌胃环磷酰胺所致骨髓损伤模型小鼠,采用实验血液学技术和造血祖细胞体外培养方法,检测小鼠外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血小板(PLT)、血红蛋白(Hb)和网织红细胞(RET)数,骨髓有核细胞(BMNC),骨髓造血干细胞,粒单系祖细胞(CFU-GM),红系祖细胞(CFU-E)和巨核系祖细胞(CFU-Meg)数。结果革皮氏海参皂苷能提高小鼠外周血像中WBC、RBC、PLT、Hb和RET的数量,提高骨髓有核细胞数,促进造血干细胞的增殖和分化,增加骨髓中CFU-GM、CFU-E/CFU-E和CFU-Meg的集落生成。结论革皮氏海参皂苷对骨髓损伤模型小鼠有促进造血的作用。其作用途径可能通过调节机体的免疫功能,诱导机体产生多种造血细胞因子,促进造血干细胞的增殖,并诱导向粒单系、红系和巨核系祖细胞分化,恢复小鼠的造血功能。