源于Bacillus megaterium STB10的直链麦芽五糖生成酶酶学性质及其产物合成规律

构建来源于巨大芽孢杆菌STB10直链麦芽五糖生成酶（Bacillus megaterium maltopentaose-forming amylase,BmMFA）的食品级枯草芽孢杆菌表达系统,实现了该酶的分泌表达,分析了其酶学性质,并对其产物合成规律进行了探究。结果显示,BmMFA具有较强的催化活力,枯草芽孢杆菌发酵后上清液中酶活力可达196.57 U/mL;该酶的最适反应温度为50 ℃,最适反应pH值为7.0,且具有相对较宽的pH值应用范围;BmMFA倾向于内切酶作用机制,且具有较好的产物特异性,水解麦芽糊精24 h后产物中直链麦芽五糖质量分数42%以上,当以支链淀粉为底物时,其转化率及主产物直链麦芽五糖比例均优于直链淀粉。本研究为直链麦芽五糖的酶法制备提供了一定的理论依据。     

淀粉脱支酶的制备和应用

正根据对底物作用方式的不同,淀粉脱支酶主要分为普鲁兰酶和异淀粉酶。它们可以专一、高效地水解支链淀粉中的分支键,在工业中的应用非常广泛。在淀粉酶解过程中添加普鲁兰酶或异淀粉酶可以加快淀粉酶解反应的速度,缩短酶解时间,提高产品的转化率,降低其它酶制剂的使用量。目前,普鲁兰酶和异淀粉酶已经被广泛用于葡萄糖、麦芽糖、果糖、低聚糖、麦芽糊精等产品的生产。研究者尝试采用重组技术来提高淀粉脱支酶的产量和性能。中国专利CN201610306855.6提供一种     

麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及其酶学性质研究

首先构建了来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)STB04的麦芽低聚糖生成酶(MFA酶)的枯草芽孢杆菌分泌表达系统,并对含表达载体的枯草芽孢杆菌WB600产重组酶的发酵条件进行了优化,发现以TB为发酵培养基、发酵温度为30℃时,有利于重组酶的分泌表达。其次,通过疏水和强阴离子交换色谱对重组酶进行了分离纯化,得到了电泳纯的酶。最后,对重组酶的酶学性质和产物合成进行了分析,结果显示:它在溶液中为单聚体,最适反应温度为45℃,且在该温度下半衰期为30 min;最适反应p H为6.5,且具有很好的p H稳定性;酶活力对金属离子存在一定依赖性并受Fe3+和Sn2+等重金属离子的显著抑制;重组MFA酶的动力学性质可以用米氏方程进行很好的描述,对麦芽糊精的水解速率最高;重组酶作用不同来源原淀粉及麦芽糊精的主要产物均为麦芽三糖、麦芽四糖和麦芽五糖,且以麦芽五糖为最高。     

耐热异淀粉酶的高效表达及其在麦芽糖浆制备中的作用

淀粉酶法制备高麦芽糖浆工艺中,淀粉液化酶、脱支酶以及β-淀粉酶不可或缺,其中脱支酶是决定淀粉转化为麦芽糖的转化率高低的关键因素。在工业上常用的两种脱支酶中,异淀粉酶比普鲁兰酶能更好地协助β-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖。首先通过PCR扩增获得异淀粉酶的编码基因iso并克隆入表达载体p HY-WZX,在枯草芽胞杆菌1A717中获得重组质粒p HY-ISO,将构建好的重组质粒电转化入地衣芽孢杆菌D402中,其摇瓶发酵酶活力达330 U/m L,实现了异淀粉酶的异源高效表达。基本酶学特征分析表明:该重组酶适宜反应条件为50~55℃,p H 6.5~9.0;K+、Ca2+、Mg2+对酶活有促进作用,其他离子或化合物强烈抑制酶活。HPLC分析表明,该重组异淀粉酶与普鲁兰酶相比,更有助于极高麦芽糖浆的制备。最后通过在线软件对该酶进行同源结构模拟和分析,进一步确定其为异淀粉酶,为后续对其进行分子改造奠定了基础。     

Thermobifida fusca麦芽三糖淀粉酶的重组表达及其在麦芽三糖制备中的应用

麦芽三糖淀粉酶以淀粉或麦芽糊精为原料,可生产麦芽三糖,在食品、饮料等行业具有广泛的应用前景。实验将Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌WS11中进行重组表达,并进行酶学性质分析,重组酶的最适温度和pH分别是55℃和6.0。在此基础上探究了重组酶作用于麦芽糊精生产麦芽三糖的最佳条件。结果表明,以15%浓度的麦芽糊精(DE 5-7)作为底物时,酶转化的最佳条件是温度55℃、pH 5.5、加酶量60 U/g(底物)、普鲁兰酶加酶量32 U/g(底物)、反应时间11 h,此时得到麦芽三糖转化率44.4%。该研究为工业制备麦芽三糖提供了理论依据。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

枯草芽胞杆菌重组表达的Pantoea dispersa UQ68J蔗糖异构酶制备异麦芽酮糖的研究

异麦芽酮糖是蔗糖的同分异构体,具有多种优秀的生理功能,广泛应用于食品行业。蔗糖异构酶可以将蔗糖异构为异麦芽酮糖,与其他微生物来源的蔗糖异构酶相比,Pantoea dispersa UQ68J来源的蔗糖异构酶转化蔗糖时异麦芽酮糖产率高,副产物少。为了更好地将异麦芽酮糖应用于食品领域,该研究将P.dispersa来源的蔗糖异构酶在食品安全微生物枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中重组表达,研究重组蔗糖异构酶的酶学性质并优化其制备异麦芽酮糖的反应条件。结果表明,重组酶的最适pH值为6.0,最适温度为30℃,在pH 5.0～8.0稳定性良好,在45℃下的半衰期为68 min。用该重组酶制备异麦芽酮糖,当蔗糖质量浓度为400 g/L,加酶量为20 U/g,在30℃、pH 6.0条件下转化10 h时,异麦芽酮糖产率可达90.61%,当蔗糖质量浓度提高到700 g/L,异麦芽酮糖产率仍可达89.20%。该研究提高了蔗糖异构酶的安全特性,实现了异麦芽酮糖的高产率,为工业生产异麦芽酮糖奠定了基础。     

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

重组Bacillus subtilis产麦芽四糖淀粉酶的发酵优化及麦芽四糖制备

麦芽四糖淀粉酶可水解淀粉或麦芽糊精生成麦芽四糖,在食品领域有着广泛应用。为降低生产成本,对前期构建的生产麦芽四糖淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌进行发酵优化。通过对培养基的氮源和碳源进行优化,以5%的接种量,在33℃、200 r/min条件下发酵48 h,发现以25 g/L豆粕粉和25 g/L工业蛋白胨为氮源,5 g/L甘油为碳源时,重组酶酶活力最高可达236 U/m L。利用发酵所得重组麦芽四糖淀粉酶制备麦芽四糖并进行酶反应条件优化,使用高效液相色谱检测产物含量。发现当酶转化反应温度为50℃,反应p H为7. 0,加酶量为30U/g底物,底物麦芽糊精的质量浓度为250 g/L时,反应12 h,麦芽四糖转化率可达73. 2%,为降低生产成本和工业制备麦芽四糖提供了理论依据。     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。