ERK信号通路介导的EP300过表达在苯肾上腺素诱导小鼠心肌细胞肥大中的作用

目的:探讨细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路介导的E1A结合蛋白p300(EP300)过表达在苯肾上腺素(PE)诱导的小鼠心肌细胞肥大中的作用。方法:原代培养新生小鼠心肌细胞,按照随机数字表法分为:正常组、生理盐水(NS)组、PE组、溶剂对照组、漆树酸(AA)组、ERK抑制剂组和AA+ERK抑制剂组。收集干预48 h的小鼠心肌细胞,采用Western blot检测ERK、第9位赖氨酸乙酰化的组蛋白H3(H3K9ac)和β-肌球蛋白重链(β-MHC)的蛋白表达水平;RT-qPCR检测心肌细胞肥大标志物β-MHC的mRNA表达水平;免疫共沉淀验证EP300与H3K9ac之间的调控关系;免疫荧光染色及Western blot检测心肌细胞中EP300的表达水平。结果:Western blot结果表明小鼠心肌细胞中H3K9ac水平在PE组显著高于生理盐水对照组(P0.05);Western blot及免疫荧光结果表明PE组EP300表达水平显著高于生理盐水对照组(P0.05);免疫共沉淀结果表明EP300与H3K9ac之间能够相互结合;PE组p-ERK蛋白水平及β-MHC的mRNA和蛋白水平均显著高于NS组(P0.05);而ERK抑制剂组及AA组EP300、H3K9ac、β-MHC及p-ERK水平均显著低于PE组(P0.05)。结论:EP300介导的H3K9ac高乙酰化参与了PE诱导的小鼠心肌细胞肥大,而ERK信号通路可能是AA减轻PE诱导的心肌肥厚的信号通路之一。     

组蛋白乙酰化修饰失衡在苯肾上腺素诱导小鼠心肌肥厚中的调控作用

目的:探讨苯肾上腺素诱导小鼠心肌肥厚的组蛋白乙酰化调控机制,为防治肥厚性心肌病提供新的思路。方法:选取健康C57BL/6小鼠,苯肾上腺素皮下注射建立小鼠心肌肥厚模型,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,ChIP)分别检测心脏核转录因子GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)mRNA表达水平及其启动子区组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化(H3K27ac)水平,Western blot检测小鼠心肌组织组蛋白H3K27ac、心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)及α-肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain,α-MHC)的表达,HE染色及超声心动图观察小鼠心肌肥厚。结果:Western blot及ChIP-qPCR表明小鼠心肌组织组蛋白H3K27ac水平及GATA4启动子区组蛋白H3K27ac水平在苯肾上腺素组显著高于生理盐水对照组(P0.05),GATA4及ANP的表达水平在苯肾上腺素组也显著高于生理盐水对照组(P0.05);而组蛋白乙酰化酶抑制剂漆树酸能够降低苯肾上腺素诱导的组蛋白H3K27的高乙酰化,且GATA4mRNA及ANP蛋白的表达水平在漆树酸处理组也显著降低(P0.05);HE染色及超声心动图显示苯肾上腺素能够降低左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter,LVESD)和左室舒张末期内径(left ventricular enddiastolic diameter,LVEDD)并增加左室后壁(left ventricular posterior wall,LVPW)厚度,诱导小鼠心肌肥厚,而漆树酸能够提高LVESD和LVEDD并降低LVPW厚度,从而改善小鼠心肌肥厚。结论:组蛋白乙酰化修饰失衡参与了苯肾上腺素诱导的小鼠心肌肥厚,而组蛋白乙酰化酶抑制剂漆树酸能够下调苯肾上腺素诱导的组蛋白高乙酰化进而改善小鼠心肌肥厚。     

MEF2C介导microRNA-214发挥抑制心肌细胞肥大的作用

目的:研究微小RNA-214(mi R-214)对心肌细胞肥大的调控作用及其可能的作用靶基因。方法:建立血管紧张素Ⅱ(angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)诱导的C57BL/6乳小鼠心室肌细胞肥大模型;双萤光素酶报告基因实验检测mi R-214与潜在靶基因MEF2C 3’端非翻译区(3’UTR)的结合作用;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和Western blot法分别检测MEF2C及肥厚标志物的m RNA和蛋白表达水平。结果:心肌肥厚标志物ANP、ACTA1和β-MHC,以及mi R-214的表达在Ang-II诱导肥大的小鼠心肌细胞中显著增强;双萤光素酶报告基因实验提示mi R-214与MEF2C 3’UTR相互作用,证实mi R-214可在转录水平抑制MEF2C的表达,MEF2C蛋白水平在肥大的心肌细胞中显著上调;过表达mi R-214及沉默MEF2C均能一致性地抑制Ang-Ⅱ诱导的心肌细胞中肥大标志物的表达。结论:MEF2C是mi R-214的靶基因,并介导了mi R-214发挥抑制心肌细胞肥大的作用。     

白藜芦醇抑制高糖诱导的H9C2心肌细胞系肥大

目的观察白藜芦醇对高糖诱导H9C2心肌细胞系氧化应激和肥大的作用及其可能机制。方法将H9C2心肌细胞分为正常糖浓度组(NG组)、高糖组(HG组)、白芦藜醇组(Res组)和白藜芦醇+DAPT组(Res+DAPT组)。用鬼笔环肽检测细胞表面积;DCFH-DA法检测细胞内活性氧簇(ROS);比色法检测超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量;实时荧光定量PCR及Western blot检测Notch1、Hes1、ANP、BNP mRNA和蛋白表达。结果与NG组相比,高糖可诱导心肌细胞肥大(P0.01),ROS和MDA含量增加(P0.01),SOD活性下降(P0.01),伴随ANP和BNP基因及蛋白表达增加(P0.05),Notch1和Hes1表达下降(P0.05),白藜芦醇处理后可逆转心肌细胞肥大(P0.01),减轻ROS和MDA氧化损伤(P0.01),增加SOD活性(P0.01),抑制ANP和BNP表达(P0.05),增加Notch1及Hes1表达(P0.05)。结论白藜芦醇可能通过改善氧化应激,活化Notch1/Hes1信号通路抑制高糖引起的H9C2心肌细胞肥大。     

ECE1过表达通过eNOS/NO通路促进AngⅡ诱导的体外培养大鼠心肌细胞肥大和凋亡

目的:探讨过表达内皮素转换酶1(ECE1)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的体外培养大鼠H9C2心肌细胞肥大和凋亡的影响.方法:采用AngⅡ作用于体外培养的H9C2心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型.将细胞分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+质粒空载体(AngⅡ+NC)组和AngⅡ+ECE1过表达组.CCK-8法检测细胞活...     

父代饮酒致子代小鼠心脏发育异常的组蛋白乙酰化修饰机制

目的:探讨父代饮酒对子代心脏发育的影响,以及组蛋白乙酰化修饰机制。方法:雄性C57小鼠给予连续酒精(体积分数40%,每天10 mL/kg)暴露6周,分别设空白对照组(无处理)及阴性对照组(生理盐水灌胃)。干预后雌雄小鼠合笼,收集新生子代小鼠心脏组织。测量新生小鼠出生体重;电镜检测心肌细胞超微结构;TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平;qPCR检测caspase-3及Bcl-2的mRNA表达水平;Western blot法检测active caspase-3、caspase-3及Bcl-2蛋白表达水平;ChIP-qPCR法检测caspase-3及Bcl-2启动子上组蛋白H3K9及H3K27乙酰化水平。结果:父代饮酒小鼠子代出生体重明显较对照组降低(P0.05);电镜下见酒精组新生小鼠心肌细胞出现肌丝溶解、肌浆网扩大和肌丝排列紊乱;同时其凋亡细胞较对照组明显增多;酒精组caspase-3 mRNA表达较对照组显著升高(P0.05),active caspase-3蛋白水平较对照组显著升高(P0.05),Bcl-2 mRNA及蛋白均较对照组显著降低(P0.05);caspase-3基因启动子组蛋白H3K9乙酰化水平较对照组显著升高(P0.05);Bcl-2启动子组蛋白H3K27乙酰化水平较对照组显著降低(P0.05)。结论:父代饮酒可以引起子代小鼠心脏发育异常。组蛋白乙酰化修饰可能介导了子代小鼠心肌细胞凋亡过程。     

miR-520a-5p靶向TGR5调控H9c2细胞中高糖引起的心肌肥大

目的 探讨高糖引起H9c2细胞心肌肥大的潜在机制.方法 通过高糖处理H9c2细胞后,检测其表面积大小以及心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平.通过高通量测序检测高糖处理H9c2细胞表达的差异miRNA.过表达差异miRNA后检测心脏肥大标志物ANP的表达水平.通过miRDB在线分析miRNA的潜在底物.结果 高糖可使心肌细胞H9c2的大小增加(P＜0.05)、表面积增加(P＜0.05).高糖处理后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均上升(P＜0.05).敲低miR-520a-5p后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均下降(P＜0.05)、心肌细胞H9c2表面积减少(P＜0.05).过表达miR-520a-5p后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均上升(P＜0.05)、心肌细胞H9c2表面积增加(P＜0.05).miR-520a-5p靶向TGR5的3端非编码区(P＜0.05).过表达miR-520a-5p后,TGR5表达水平下降.敲低TGR5后,TGR5表达水平上升.敲低TGR5后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均上升(P＜0.05)、心肌细胞H9c2表面积增加(P＜0.05).过表达TGR5后,心脏肥大标志物ANP,BNP,β-MHC的表达水平均下降(P＜0.05)、心肌细胞H9c2表面积减少(P＜0.05).结论 高糖处理后,miR-520a-5p的表达水平上升,miR-520a-5p通过靶向TGR5 mRNA的3端非编码区后降解了TGR5 mRNA,降低了TGR5的蛋白水平,随后引起了H9c2细胞的心肌肥大.     

去泛素化酶USP14调控H_2O_2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤

目的:观察抑制泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14,USP14)的活性对H_2O_2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的影响。方法:体外培养H9c2心肌细胞,用H_2O_2(25μmol/L)处理2 h,建立心肌细胞氧化应激损伤模型。将细胞分为对照(control,CON)组、模型组(H_2O_2组)、USP14抑制剂IU1处理组(IU1组)和IU1处理后建模组(IU1+H_2O_2组)。MTS法检测H9c2心肌细胞活力;流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS)的产生和细胞存活率;Western blot法检测丝裂原活化蛋白激酶家族相关蛋白的表达变化。结果:与CON组相比,H_2O_2组细胞活力、细胞存活率显著降低,细胞内ROS含量、Bax/Bcl-2、P53、p-ERK1/2、p-JNK和p-P38的蛋白水平显著增加(P0.05);与H_2O_2组比较,IU1+H_2O_2组细胞活力、细胞存活率显著增加,细胞内ROS含量、Bax/Bcl-2、P53、p-ERK1/2、p-JNK和p-P38蛋白水平显著降低(P0.05)。结论:抑制USP14活性可以减轻氧化应激条件下H9c2心肌细胞的损伤,其机制可能与抑制丝裂原活化蛋白激酶信号活化和下调凋亡相关蛋白有关。     

过表达miR-130a-3p对心肌细胞肥大的缓解作用研究

本研究旨在探索miR-130a-3p对心肌细胞肥大的作用及其可能机制。通过胸主动脉缩窄法(TAC)构建压力超负荷所致心肌肥厚小鼠模型。使用去甲肾上腺素(NE)刺激SD乳鼠原代心肌细胞(NRCMs)及H9c2大鼠心肌细胞系,诱导这两种心肌细胞发生肥大表型转变。检测miR-130a-3p的表达变化,并进一步探索其对心肌细胞肥大是否有调控作用。结果表明,miR-130a-3p在肥厚心肌组织、肥大NRCMs及H9c2细胞中的表达均明显降低。给予miR-130a-3p mimics使其过表达后,H9c2细胞中肥大标志基因心房利钠肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)和肌球蛋白重链β(β-MHC)的表达较对照组(mimics N.C.+NE组)明显下调,且细胞面积明显减小。而给予miR-130a-3p inhibitor抑制其表达后,肥大心肌细胞中ANP、BNP、β-MHC的表达进一步上升,且细胞面积进一步增加。Western blot检测发现,过表达miR-130a-3p后心肌细胞中磷酸化Akt和磷酸化mTOR的表达水平下调。以上结果提示,miR-130a-3p mimics可缓解心肌细胞肥大的程度;其inhibitor则可使心肌细胞肥大进一步加剧。过表达miR-130a-3p可能通过影响Akt通路来缓解H9c2心肌细胞肥大的程度。     

Drp1在高糖诱导的大鼠心肌细胞肥大中的作用研究

目的:探讨发动蛋白相关蛋白1(Drp1)在高糖诱导的心肌细胞肥大模型中的表达及其作用机制。方法:原代乳大鼠心肌细胞培养,用高糖诱导建立心肌细胞损伤模型,将细胞分为对照组、高渗透压组、DMSO组、高糖组和高糖+线粒体分裂抑制剂1(Mdivi-1)组。用麦胚凝集素荧光染色检测单个心肌细胞表面积;用线粒体膜电位(MMP)检测试剂盒(JC-1)检测心肌细胞MMP水平;Western blot检测心肌细胞肥大标志物心房钠尿肽(ANP)及Drp1和Drp1在Ser616/Ser637位点的磷酸化蛋白[p-Drp1(Ser616/Ser637)]的蛋白水平。结果:与对照组相比,高渗透压组各检测结果均无显著差异(P>0.05)。与对照组和高渗透压组相比,高糖组心肌细胞的表面积均显著增大(P<0.01),MMP显著降低(P<0.01),而Drp1总蛋白表达无显著变化(P>0.05);心肌细胞ANP表达显著增加(P<0.01),p-Drp1(Ser616)水平显著升高(P<0.05),而p-Drp1(Ser637)水平显著降低(P<0.05)。与高糖组相比,高糖+Mdivi-1组ANP和p-Drp1(Ser616)蛋白水平显著降低(P<0.05),而p-Drp1(Ser637)的水平显著升高(P<0.05)。结论:高糖诱导心肌细胞肥大的机制,与Drp1在Ser616位点磷酸化水平升高、Ser637位点磷酸化水平降低导致的线粒体分裂增加有关。     

P38 MAPK信号通路参与BMP-13诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化

 目的 探讨P38MAPK对BMP-13诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化的影响。方法 实验4个部分分组如下：1.BMP-13腺病毒（Ad-BMP-13）对P38MAPK的作用：Ad-BMP-13转染组、Ad-GFP转染组和C3H10空白组。Western blot检测磷酸化P38MAPK（p-P38MAPK）和总P38MAPK（t-P38MAPK）的表达变化,免疫荧光技术定位p-P38MAPK;2.P38MAPK干扰腺病毒（Ad-si-P38）对P38MAPK的作用：si-P38干扰组、si-NC干扰对照组和C3H10空白组。Western blot检测t-P38MAPK的表达;3.Ad-si-P38阻断P38MAPK后对BMP-13诱导分化的影响：si-P38+Ad-BMP-13转染组、si-NC+Ad-BMP-13转染组、si-NC+Ad-GFP转染组和C3H10空白组。Western blot检测cTnT和Cx43的表达,荧光定量PCR检测GATA-4和MEF-2C的mRNA表达;4.SB203580阻断P38MAPK后对BMP-13诱导分化的影响： DMSO+Ad-BMP-13转染组、SB203580(2、5和10μmol/L)+Ad-BMP-13转染组 。荧光定量PCR检测GATA-4和MEF-2C的mRNA表达。结果 BMP-13促进P38MAPK的磷酸化。Ad-si-P38可以有效降低P38MAPK表达水平。Ad-si-P38阻断P38MAPK后BMP-13诱导组cTnT、Cx43表达有明显降低（P<0.05）,GATA-4和MEF-2C的表达也有显著降低（P<0.05）。随P38MAPK特异性抑制剂SB203580浓度增加,BMP-13诱导组GATA-4和MEF-2C的表达降低（P<0.05）。结论 Ad-BMP-13可以通过激活P38MAPK信号通路来调控C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化。     

Sirt1参与异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌肥大

目的:观察Ⅲ类组蛋白去乙酰基酶1(Sirt1)在异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥大中的表达及作用。方法:昆明小鼠随机分为正常对照组、ISO模型组和ISO+NAM(烟酰胺,Sirt1抑制剂)组。皮下注射ISO诱导小鼠心肌肥大。以心脏重量指数(心脏重量/体重)、HE染色、透射电镜以及脑钠肽(BNP)mRNA表达水平观察心肌肥大的变化。同时采用RT-PCR、Western blotting检测各组心肌Sirt1 mRNA、蛋白质的表达。结果:与对照组相比,心脏重量指数,HE染色,透射电镜以及BNP mRNA表达水平均显示皮下注射ISO可明显诱导小鼠心肌肥大;Sirt1在心肌肥大模型组表达显著增多(P0.01),其抑制剂NAM可明显减轻ISO诱导的心肌肥大(P0.05),并降低Sirt1的表达(P0.01)。结论:Sirt1的激活可能参与ISO诱导的小鼠心肌肥大。     

坎沙曲联合缬沙坦与奥帕曲拉均减轻大鼠心肌肥厚

目的比较坎沙曲联合缬沙坦与奥帕曲拉(OMA)对大鼠心肌肥厚的保护作用。方法注射1 mg/kg异丙肾上腺素(ISO)制备大鼠心肌肥厚模型,随机分为对照组、心肌肥厚组、坎沙曲组、缬沙坦组、OMA组与坎沙曲+缬沙坦(半量及全量)组,每组n=8,染色后测定心肌细胞横截面积、心肌间质胶原容积分数及血管周围胶原面积;免疫组化学检测心肌组织p-PI3K和p-Akt表达;放免法测定血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、心房利钠肽(ANP)、缓激肽(BK)水平。结果 1)坎沙曲+缬沙坦(全量)及OMA组均可降低心肌肥厚组大鼠心脏重量指数(分别为3.64±0.30、3.62±0.28和4.32±0.58)、心肌细胞横截面积、心肌间质胶原容积分数及血管周围胶原面积的明显上升(P<0.01),两组间无明显差异。2)与心肌肥厚组相比,坎沙曲+缬沙坦(全量)及OMA组均可降低血浆AngⅡ含量[分别为(741±89)、(682±66)和(479±62)ng/L],并显著上调ANP[分别为(117±33)、(298±91)和(288±95)μg/L]及BK[分别为(124±12)、(232±21)和(309±24)ng/L]水平(P<0.01),但坎沙曲+缬沙坦(全量)较OMA组BK的上调幅度低。3)坎沙曲+缬沙坦(全量)与OMA均下调心肌肥厚组心肌组织p-PI3K和p-Akt蛋白表达,且两者间无明显差异。结论坎沙曲联合缬沙坦与OMA均可减轻大鼠心肌肥厚,但对血浆激素水平的影响有差异。     

芳香烃受体在体外高糖环境诱导心肌肥大过程中的表达

目的:观察高糖环境诱导心肌细胞肥大过程中芳香烃受体(AhR)的表达情况,并探讨其可能的作用机制。方法:以体外培养的大鼠心肌细胞H9c2为研究对象,实验分为正常糖浓度组、高糖组、DMSO组和白藜芦醇(AhR拮抗剂)组。免疫荧光染色观察AhR的表达情况,罗丹明标记的鬼笔环肽染色细胞骨架并计算细胞表面积,DCFH-DA法检测细胞内活性氧簇(ROS)的生成水平,实时荧光定量PCR及Western blot法检测AhR、CYP1A1、心钠素(ANP)和脑钠素(BNP)的表达情况。结果:正常糖浓度环境下,AhR的表达主要定位于细胞质,高糖刺激时转入细胞核内。高糖刺激可促使心肌细胞肥大、心肌细胞内ROS生成增加,白藜芦醇阻滞AhR后,心肌肥大得到明显改善,同时ROS生成水平明显减少。与正常糖浓度组及白藜芦醇组相比,高糖组的AhR、CYP1A1、ANP和BNP mRNA及蛋白表达水平明显升高,上述指标高糖组与DMSO组相比差异无统计学显著性,而白藜芦醇组明显低于DMSO组。结论:在高糖诱导的心肌肥大过程,心肌细胞的AhR表达增加可能参与维持正常糖代谢过程;高糖环境可激活AhR转入细胞核内,上调CYP1A1的表达,并促进ROS的生成,这可能是高糖诱导心肌肥大的重要机制之一。     

RIP3/CaMKⅡ信号通路对重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响

目的:观察RIP3/CaMKⅡ信号通路对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响,并探讨CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93对心肌损伤的作用。方法:将60只雄性BALB/c小鼠分为正常对照组、CVB3组、CVB3+KN-93组和CVB3+KN-93+Ti(活性氧簇特异性抑制剂)组,以上小鼠腹腔及尾静脉注射药物连续7 d。采用双抗体夹心免疫法检测小鼠心肌细胞坏死标志物,心脏超声技术检测小鼠心脏结构和功能,绘制Kaplan-Meier生存曲线,观察KN-93对小鼠心肌的保护作用。结果:CVB3+KN-93组小鼠心肌细胞坏死较CVB3组显著减轻,心脏功能和生存曲线改善(P<0.01);CVB3+KN-93组小鼠心肌组织H2O2含量较CVB3组显著下降(P<0.01);加入Ti后,CVB3+KN-93+Ti组H2O2含量较CVB3+KN-93组轻度下降(P<0.05),但无论是心脏功能还是生存曲线均无显著差异。结论:RIP3/CaMKⅡ信号通路在CVB3诱导的急性重症病毒性心肌炎小鼠心肌细胞损伤中起到主导作用;KN-93能阻断这种作用并可能产生新的治疗方式,其效果可能是通过对CaMKⅡ的直接抑制和对活性氧簇的间接抑制而实现的。