RNAi沉默pyk2基因对鼠脑胶质瘤细胞增殖、侵袭能力的影响

目的 探讨pyk2小干扰RNA表达载体对小鼠脑胶质瘤G422细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 用以pGenesil-1质粒为载体,以pyk2为靶基因,构建短发夹状小干扰RNA表达载体.用pyk2短发夹状小干扰RNA表达载体转染体外培养的人脑胶质瘤G422细胞,反转录聚合酶链反应和Western blot法检测pyk2基因和蛋白表达的改变,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染后细胞的增殖情况,Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力.结果 构建了pGenesil-1-pyk2重组质粒,并成功转染G422细胞.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)显示pyk2 siRNA转染G422细胞后显著降低pyk2mRNA的表达,以48 h为著,下降近70%;Western blot证实转染后pyk2蛋白的表达下降近65%;G422细胞的活力降低为(67.1±5.2)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降.结论 pGenesil-1-pyk2 siRNA重组质粒明显下调pyk2在胶质瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖,抑制其侵袭能力.     

RNA干扰技术沉默STAT3对人前列腺癌细胞生长的抑制作用

目的: 探讨RNA干扰技术沉默STAT3基因表达对人前列腺癌细胞PC3及LNCaP的生长抑制作用。　方法: 针对STAT3mRNA序列设计合成 3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,转染PC3及LNCaP细胞;采用Western印迹、Northern印迹等技术观察重组质粒对STAT3基因表达的影响;用MTT法观察重组质粒对PC3及LNCaP细胞体外生长抑制作用;用流式细胞术(FCM)及吖啶橙染色检测重组质粒诱导细胞凋亡。　结果: 成功构建pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3重组质粒,并成功转染PC3及LNCaP细胞;Western印迹,Northern印迹结果证实重组质粒在mRNA及蛋白水平分别显著抑制STAT3基因表达,抑制率为60% ~75%;MTT及FCM结果证明上述重组质粒可显著抑制PC3及LNCaP细胞的体外生长并诱导PC3细胞凋亡。结论: pSilencer1. 0 U6 siRNA STAT3可抑制STAT3在人前列腺癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡。     

莪术醇对人脑胶质瘤U251细胞增生与凋亡影响的实验研究

目的 本研究观察中药活性成分莪术醇对人脑胶质瘤细胞株U251增生与凋亡的影响,检测其对胶质瘤细胞凋亡相关基因表达的影响,初步探讨其抗胶质瘤的可能机制,为脑胶质瘤的中草药治疗积累实验数据.方法 以体外培养的人脑胶质瘤细胞株U251为模型,以培养基稀释莪术醇成不同浓度,观察与检测以下内容:MTT法检测不同时间、不同浓度莪术醇对U251细胞增生的影响;显微镜观察不同浓度莪术醇对U251细胞形态学的影响;流式细胞仪检测不同浓度莪术醇对U251细胞凋亡的影响;RT-PCR法检测不同浓度莪术醇对U251细胞中凋亡相关基因bcl-2与COX-2表达水平的影响.结果 莪术醇对人脑胶质瘤U251细胞增生有抑制效应,且表现出浓度依赖性与时间依赖性(P＜0.05).结论 莪术醇对人脑胶质瘤U251细胞有明确的增生抑制作用.诱导凋亡、抑制增生可能为莪术醇抑制胶质瘤增生效应的重要机制.莪术醇下调人脑胶质瘤U251细胞中bcl-2与COX-2的基因表达水平可能为其诱导凋亡、抑制增生的重要机制之一.     

靶向MMP-2的RNAi抑制胰腺癌PANC-1细胞侵袭性的研究

目的 观察RNAi体外沉默胰腺癌PANC-1细胞MMP-2基因对胰腺癌细胞MMP-2表达及细胞侵袭能力的抑制作用.方法 设计靶向MMP-2的siRNA并构建到pGCsi-U6质粒,重组质粒通过脂质体Lipofectamine 2000转染PANC-1细胞,流式细胞仪检测质粒的转染率,RQ-PCR检测细胞MMP-2的mRNA表达水平;ELISA检测细胞MMP-2蛋白的分泌量;Transwell小室侵袭观察各组细胞侵袭能力;MTT比色法检测各组细胞增殖活性.结果 测序鉴定证实,干扰质粒构建成功,重组质粒转染率最高达82.1%.转染干扰质粒PANC-1细胞的MMP-2基因mRNA表达抑制了71.74%(P＜0.05);MMP-2蛋白分泌下降了49.82%(P＜0.05);细胞侵袭能力抑制率达33.0%(P＜0.05);细胞的增殖活性无明显变化(P＞0.05).结论 靶向MMP-2的RNAi能抑制胰腺癌PANC-1细胞的体外侵袭能力,提示MMP-2可以作为胰腺癌基因治疗的靶点,亟待RNAi能为肿瘤治疗开创崭新局面.     

血管内皮生长因子-C shRNA对肝癌HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 检测靶向血管内皮生长因子-C(vasenlar endothelial growth factor-C,VEGF-C)shRNA质粒载体对肝癌HepG2细胞增殖及侵袭能力的影响.方法 构建VEGF-C shRNA质粒载体,脂质体转染方法转入肝癌HepG2细胞.通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞的转染率;RT-PCR及Western blot检测转染细胞内VEGF-C mRNA及蛋白的表达变化;MTT法检测细胞增殖抑制率;人工基底膜体外侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 VEGF-C shRNA稳定转染后,肝癌HepG2细胞内VEGF-C mRNA及蛋白表达水平显著下降;VEGF-C shRNA对肝癌HepG2细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑制增殖效应呈时间依赖性;VEGF-C shRNA可有效抑制肝癌HepG2细胞的人工基底膜体外侵袭能力,抑制率为51.54%.结论 VEGF-C在肝癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用;通过RNA干扰技术实现VEGF-C沉默,在肝癌的基因治疗中具有较好的应用前景.     

RNAi技术沉默Bcl-2基因对人膀胱癌细胞株T24增殖影响的研究

目的探讨RNA干扰(RNAi)技术沉默Bcl-2基因表达对人膀胱癌细胞株T24增殖的影响。方法针对Bcl-2 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA(siRNA)的DNA模板,构建pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,转染T24细胞。采用Western blot检测重组质粒对Bcl-2蛋白表达的影响,MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用,Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FCM)检测转染重组质粒后细胞的凋亡状况。结果成功构建了pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒,并成功转染T24细胞。重组质粒抑制Bcl-2基因的表达接近70%;转染重组质粒后,T24细胞的活力降低为(66.9±5.6)%;重组质粒组的T24细胞凋亡率为34.55%～45.39%。结论pGenesil-1-Bcl-2 siRNA重组质粒明显下调Bcl-2在膀胱癌细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞生长,促进其凋亡。     

腺病毒载体介导的Polo样激酶1短发夹环RNA对胶质瘤体内外增殖的抑制作用

目的探讨重组腺病毒载体介导的Polo样激酶1（PLK1）短发夹环RNA（shRNA）对人胶质瘤细胞株U251在体内外增殖的抑制作用。方法设计并合成针对PLK1的shRNA，并克隆至真核表达载体pEGFP—H1上，再将H1启动子和shRNA亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack上，通过在携带有pAdeasy-1质粒的BJ5183细菌内同源重组，生成针对PLK1的shRNA重组腺病毒载体pAD-H1／PLK1，经293细胞包装产生重组腺病毒AD-H1／PLK1，感染U251细胞。应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）的方法检测U251细胞PLK1mRNA表达，流式细胞仪检测细胞凋亡以及细胞G2／M期转变情况，以噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞的增殖活性。同时制备裸鼠U251细胞移植瘤模型并注射重组腺病毒，观察肿瘤生长情况。结果成功构建针对PLK1基因的RNA干扰腺病毒表达载体，与AD-H1组比较AD-H1／PLK1组在转染24h和48hU251细胞PLK1mRNA表达水平分别降低50．4％（P〈0．01）和71．9％（P〈0．01）。且感染AD-H1／PLK1病毒48h后的U251细胞凋亡率从8．3％升至65．6％（P〈0．01），而G2／M期的细胞从21．5％增至51．4％（P〈0．01），细胞的增殖能力则下降50％（P〈0．01）。体内实验表明重组腺病毒载体介导的PLK1shRNA也明显抑制肿瘤生长（P〈0．01）。结论腺病毒介导的RNA干扰技术可有效降低PLK1在胶质瘤细胞中的表达水平，抑制肿瘤细胞在体内外的增殖活性。     

黏着斑激酶对胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的探讨反义黏着斑激酶（FAK）对U251人胶质瘤细胞株生物学行为影响。方法以LipofecTAMINE^TM介导的反义FAK寡核苷酸转染U251人胶质瘤细胞株，用Western blot检测胶质瘤细胞株FAK含量的改变，研究其多种细胞生物学行为的变化。结果脂质体介导FAKODN转染率为85．9％。转染反义FAK后，U251人胶质瘤细胞株FAK表达明显减少。U251细胞生长抑制率为64．52％，侵袭细胞下降至21．7个，细胞周期分析显示s期细胞降至25．16％。细胞凋亡率升至34．5％。透射电镜观察到凋亡细胞。结论反义FAK寡核苷酸可显著降低FAK在U251中的表达，降低FAK表达能够显著抑制U251人胶质瘤细胞株侵袭能力，抑制细胞增殖和诱导凋亡。     

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的 构建人Wip1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响.方法 设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列,构建到慢病毒pFU-GW-iRNA载体中.慢病毒包装转染HEK293T细胞,获得病毒上清并测定其滴度;感染U251细胞,实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot鉴定RNA干扰效率;筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞,CCK-8法检测细胞的增殖,Western blot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达.结果 PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体,病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10~8～8×10~8 TU/ml.可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达,构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36.3%、32.9%、23.8%.稳定Wip1 RNA干扰后的U251细胞4 d后细胞增殖能力下降35.1%.结论 慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达,Wip1基因促进了U251细胞的增殖.     

RNA编辑酶ADAR2在人胶质瘤细胞株中的表达

目的 观察人胶质瘤细胞株SHG44、BT325、U251和正常人脑星形细胞(NHA)中ADAR2mRNA表达水平及苯乙酸(PA)对U251细胞中ADAR2表达的影响.方法 实时荧光定量聚合酶链反应( Real-time fluorescent quantitative PCR)方法检测胶质瘤细胞中ADAR2mRNA表达水平,检测PA处理前后U251细胞中ADAR2mRNA表达水平的变化;噻唑蓝(MTT)比色法检测PA作用24、48和72 h后U251细胞增殖.Western印迹法检测PA作用前后U251细胞中ADAR2蛋白表达.结果 Real-time PCR检测显示:ADAR2 mRNA在NHA中表达极弱(19.9±2.2),在SHG44和BT325细胞中明显表达(35.6±2.8、78.8±3.2),在U251细胞中表达水平最高(101.3±3.5).PA3.0和5.0 mmol/L作用U251细胞24h后,ADAR2mRNA分别为60.3±1.5和50.5±l.2(P＜0.01);MTT法检测显示PA对U251细胞的增殖呈时间和剂量依赖性抑制(P＜0.01);Western印迹法显示PA可降低ADAR2蛋白表达水平.结论 在不同的胶质瘤细胞中,ADAR2mRNA表达水平不同;PA可抑制U251细胞中ADAR2mRNA和蛋白水平的表达.     

RNAi沉默STAT3基因对人卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨RNA干扰沉默STAT3基因表达对人卵巢癌细胞SKOV3的生长抑制作用.方法针对STAT3 mRNA序列设计合成3对编码小干扰RNA（siRNA）的DNA模板,构建重组质粒（pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3）,转染SKOV3细胞进行体外研究;采用Western blot、实时聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学技术检测重组质粒对STAT3基因表达的作用;MTT法检测重组质粒对SKOV3细胞增殖的影响;流式细胞术（FCM）及吖啶橙染色检测重组质粒诱导的细胞凋亡.结果 （1）免疫组织化学技术证实卵巢癌细胞株SKOV3及癌组织中STAT3呈高表达;（2）成功构建pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒,并成功转染SKOV3细胞;（3）MTT法证实重组质粒抑制SKOV3细胞的增殖,流式细胞技术证明重组质粒诱导细胞凋亡;（4）RT-PCR与Western blot分析表明,重组质粒在mRNA及蛋白质水平特异的抑制STAT3的表达;（5）STAT3基因表达的下调抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达.结论 pSilencer 1.0-U6-siRNA-STAT3重组质粒可抑制STAT3在人卵巢癌细胞SKOV3中的表达,并抑制肿瘤细胞的生长,促进其凋亡.     

小干扰RNA抑制雄激素受体基因表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响

目的 观察小干扰RNA技术(siRNA)抑制雄激素受体(AR)基因的表达对人膀胱癌T24细胞增殖及凋亡的影响.方法 化学合成针对AR的siRNA,用脂质体转染T24细胞.采用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测AR mRNA和蛋白的变化.转染细胞48 h后用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞体外增殖活性的变化,流式细胞术检测细胞的凋亡状况.结果 成功的转染T24细胞,实时荧光定量RT-PCR筛选出一条AR mRNA抑制效率最高的siRNA,行Western blot检测可抑制AR蛋白表达至70.3%.转染细胞48 h后,T24细胞增殖活性抑制率达到(25.9±5.4)%,细胞凋亡率达到21.61%.结论 应用siRNA干扰技术能有效的抑制AR基因的表达,同时可抑制人膀胱癌T24细胞的体外增殖活性及促进其凋亡的发生.     

Effect of cysteine-rich protein 61 on proliferation and cell cycle in human renal tubular epithelial cells

Objective To investigate the effect of cysteine-rich protein 61 (Cyr61) on proliferation and cell cycle in human renal tubular epithelial cells (HK-2). Methods Cyr61 cDNA was cloned into pEGFP-N2, then HK-2 cells were transfected with the recombinant plasmid pEGFP-N2-Cyr61 by Lipofectamine. The cell proliferation was measured by MTT. The expression level of Cyr61, p-FAK and cyclin dependent cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) protein were detected by Western blotting. The cell cycle and cell apoptosis were analyzed by flow cytometry. Results The recombinant plasmid pEGFP-N2-Cyr61 could be transfected into HK-2 efficiently. After transfection, the proliferative activity was significantly increased, the proportion of HK-2 cells in G1 phase decreased and in S-phase increased significantly, the level of cell apoptosis decreased markedly (all P＜0.01). The expressions of Cyr61, p-FAK and CDK2 in Cyr61-transfected group were all amplified significantly (all P＜0.01). Conclusions Cyr61 protein over-expressed in HK-2 cells can increase CDK2 expression throngh FAK pathway, resulting in the promotion of HK-2 cells entering into S phase, cell proliferation and the reduction of cell apoptosis.     

RNA激活技术上调p21WAF1/CIP1基因表达对胆囊癌细胞增殖、侵袭与迁移能力的影响

目的利用RNA激活技术上调人胆囊癌细胞(GBC-SD)中p21基因的表达,观察其对GBS-SD细胞体外增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法将与p21基因启动子DNA序列互补的双链RNA分子(dsRNA)转染入人胆囊癌细胞中,采用RT-PCR法和Western blot分别检测p21基因mRNA及蛋白的表达情况;MTT法检测细胞增殖活性;Transwell小室法检测RNAa后细胞侵袭、迁移能力的变化。结果 dsRNA转染GBC-SD细胞72h后能显著上调p21基因mRNA和蛋白的表达,与空白组和对照组比较,转染dsp21后,GBC-SD细胞的增殖活性明显受到抑制,细胞侵袭及迁移能力明显下降。结论 RNAa技术能有效上调p21基因的表达并抑制细胞的增殖活性,降低其侵袭及迁移能力,为胆囊癌疾病的基因治疗提供依据。     

MicroRNA-155对甲状腺乳头状癌细胞生物学行为的作用及机制研究

目的探讨miR-155在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)细胞生长、侵袭与转移过程中的作用及可能的作用机制。方法构建人的miR-155类似物并体外转染PTC BCPAP细胞,通过CCK8及transwell试验观察细胞增殖及侵袭能力的变化。miR-155类似物体外转染BCPAP细胞并用Western blot方法检测MAPK通路相关蛋白本底及磷酸化表达。给予ERK通路抑制剂U0126观察能否逆转miR-155过表达造成的甲状腺癌细胞异常增殖及侵袭能力增强。结果过表达miR-15548 h后通过CCK8试验检测发现BCPAP细胞明显增殖,过表达miR-15524h、48 h后通过transwell试验发现甲状腺癌细胞侵袭能力明显增强(P<0.05);利用Western blot检测MAPK信号通路相关蛋白JNK、ERK、P38的表达均明显上调(P<0.05)。同时检测细胞内p-ERK蛋白表达升高(P<0.05),利用ERK通路抑制剂U0126与miR-155共同处理细胞发现p-ERK表达较miR-155组明显降低(P<0.05)。同时,我们检测各组细胞的增殖及侵袭情况,发现U0126能逆转miR-155造成的促增殖及促侵袭作用。结论miR-155能通过激活MAPK通路的ERK通路,进而促进PTC BCPAP细胞的增殖以侵袭能力,为治疗甲状腺癌提供了潜在的靶点。     

The protection effect of cysteine rich-protein 61 on renal tubular epithelial cells against apoptosis induced by hypoxia

Objective To observe the expression of cysteine rich-protein 61 (Cyr61) on renal tubular cells, to explore its effects against hypoxic induced kidney injury and the underlying mechanisms. Methods A stably Cyr61 expressed tubular cell line Cyr61-HK2 was established based on HK2 cells and recombinant Cyr61-lentivirus. BrdU incorporation assay was used for cell proliferation. The apoptosis of cells was analyzed by flow cytometry with Annexin V and propidiumiodide staining. Western bloting was used to detect the protein expression of BAD, Akt and ERK. Results (1) Cyr61-HK2 cells displayed more proliferation ability than HK2 cells. (2) Under hypoxia condition, the apoptosis of both HK2 and Cyr61-HK2 cells increased, but the apoptosis of Cyr61-HK2 cells was lesser than HK2 cells. (3) The expression of Cyr61 led to the phosphorylation of BAD, Akt and ERK on 0 h, 0.5 h, 1 h (all P＜0.05). Conclusion The expression of Cyr61 can promote cell proliferation and dampen cell apoptosis induced by hypoxia, which may be involved in the Akt/ERK signal pathway.     

缺氧时丝裂原激活蛋白激酶类对人肾小管上皮细胞富含半胱氨酸蛋白61基因转录活性的调控

目的 探讨丝裂原激活蛋白激酶类（MAPKs）对缺氧条件下人近端肾小管上皮细胞（HKC）中富含半胱氨酸蛋白61（Cyr61）基因转录活性的调控机制。方法 缺氧培养HKC，Northern印迹检测Cyr61mRNA表达；Western印迹检测Cyr61、p38、细胞外信号调节激酶（ERK1／2）、c—Jun—N末端蛋白激酶（JNK）以及缺氧诱导因子1c（HIF-1α）的表达。构建含有人Cyr61基因启动子的报告基因Cyr61-luc质粒，将其单独或者分别与表达活性MAPKs的质粒Ca—MEK1和Ca—MKK6共同瞬时转染HKC。通过荧光素酶活性检测观察缺氧、MAPKs抑制剂和MAPKs活性酶对Cyr61基因转录活性的调控。结果 缺氧时HKC表达cyr61、HIF-1α增高，ERK1／2、JNK、p38总量不变，而其各自的磷酸化形式均明显增加。HKC转染Cyr—luc后，p38通路抑制剂SB203580和ERK通路抑制剂PD98059显著抑制缺氧时Cyr61的转录活性，两者协同作用时抑制作用显著增强。Ca—MEK1与Cyr—luc共转染HKC后，Cyr61转录活性无改变；而Ca—MKK6与Cyr—luc共转染后，Cyr61转录活性显著增高。对缺氧培养的HKC，PD98059处理使HIF-1α和Cyr61蛋白表达显著降低；SB203580处理可显著降低Cyr61蛋白表达，但对HIF-1α无影响。结论 在HKC中，缺氧可通过p38通路直接上调Cyr61基因启动子活性，也可通过ERK1／2途径促进HIF-1α表达，间接调节Cyr61基因启动子活性。