利用酵母磷酸甘露糖异构酶基因作为拟南芥遗传转化的筛选标记

利用PCR反应克隆来自酿酒酵母的磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因pmi,通过农杆菌介导的花序侵染法将PMI的基因导入受体拟南芥中,将转化后的拟南芥种子放在质量浓度为1g/L的甘露糖MS培养基上进行筛选培养,共得到抗性拟南芥植株4株。PCR反应证明酵母PMI的基因pmi已经整合到拟南芥基因组中,RT-PCR检测证明该基因的内含子能够在拟南芥中被正确剪切,同时通过GUS化学组织染色方法证明了伴随转化的GUS基因gus在拟南芥中得以表达,以上研究结果说明酵母PMI/甘露糖系统可以作为拟南芥遗传转化的筛选标记。     

人成纤维细胞生长因子-21的拟南芥油体表达系统构建

【目的】利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)油体系统表达人成纤维细胞生长因子-21(Fibroblastgrowth factor-21,FGF21),为利用植物油体表达系统规模化生产FGF21奠定基础。【方法】以磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因作为转基因植物的安全筛选标记,将带有组氨酸标签的人源FGF21基因与大豆油体蛋白基因融合,克隆至大豆油体蛋白启动子驱动的表达载体pCAMBIA1390MDo(p1390MDo)上,构建植物双元表达载体p1390MDoFGF21。采用冻融法将植物双元表达载体p1390MDoFGF21转入农杆菌GV3101,花粉管导入法转化拟南芥,采用PCR检测、Southern blot筛选转基因拟南芥阳性植株(T0),并对FGF21蛋白在转基因拟南芥种子(T1)中的表达进行Western blot分析。【结果】成功构建了带PMI安全筛选标记的植物双元表达载体p1390MDoFGF21。PCR扩增和Southern blot分析结果表明,重组FGF21融合基因以单拷贝和多拷贝2种方式已整合到转基因拟南芥基因组中。BandScand 5.0软件和Western blot分析结果显示,FGF21融合蛋白约占转基因拟南芥种子可溶性蛋白的3.76%,并具有良好的免疫原性。【结论】FGF21融合基因已经转入拟南芥中,并在以PMI为选择标记的转基因拟南芥种子中成功高效表达。     

转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠的制备

为了获得β-甘露聚糖酶基因manA的转基因小鼠,从黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因manA,进行体外表达检测甘露聚糖酶活性后,将此基因插入到含有猪腮腺分泌蛋白(PSP)基因启动子的表达载体pPSPBGPneo中,得到在腮腺组织特异表达β-甘露聚糖酶基因manA的载体pPSP-manA,总长为16.3 kb,将其进行线性化后回收得到高质量DNA片段,通过显微注射得到17只原代小鼠,进行PCR和Southern blot检测发现有6只阳性转基因小鼠,表明转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠制备成功.     

根癌农杆菌介导gna基因对水稻的转化

褐飞虱在中国分布很广,近年来已成为南方稻区的主要害虫。大量研究表明,进行抗虫基因分子育种是迅速改良水稻褐飞虱抗性的有效途径。采用农杆菌介导法将来源于大肠杆菌的6-磷酸甘露糖异构酶(PMI)安全选择标记基因和)花莲凝集素(GNA)抗虫基因构建于同一表达载体上进行遗传转化,获得带有安全标记基因的抗褐飞虱转基因植株。通过PCR扩增、Southern印迹和GUS检测分析表明,PMI标记基因和抗虫GNA基因同时被转入部分植株中并得到了表达,其外缘基因主要以单拷贝的方式插入水稻基因组中。对随机选取的8个转基因单株T0代种子经含潮霉素的培养基培养15d后抗感苗数统计分析表明,绝大多数转基因植株后代符合单基因的遗传分离规律。     

拟南芥Mg2+转运蛋白AtMGT10的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】在大肠杆菌系统中原核表达拟南芥叶绿体Mg~(2+)转运蛋白AtMGT10,通过免疫健康成年家兔,获得针对AtMGT10蛋白的多克隆抗体,为研究AtMGT10蛋白在植物生长发育中的功能奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆AtMGT10基因编码区187~786bp的cDNA片段,连接到pET-28a中构建原核表达载体pET-28aAtMGT10~(63-262),转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达带有His标签的His-AtMGT10~(63-262)截短重组蛋白。用镍柱亲和纯化后的重组蛋白作为抗原皮下注射免疫家兔,制备针对AtMGT10蛋白的多抗血清。提取拟南芥野生型叶片总蛋白,用AtMGT10多抗血清进行蛋白免疫印迹检测。【结果】经PCR扩增获得了600bp的AtMGT10基因cDNA片段,成功构建原核表达载体pET-28a-AtMGT10~(63-262),在大肠杆菌系统中表达出His-AtMGT10~(63-262)蛋白,经亲和纯化后免疫家兔获得了Anti-AtMGT10多抗血清。在拟南芥野生型总蛋白中用Anti-AtMGT10经免疫印迹检测到大约50ku的蛋白条带,利用抗原竞争试验进一步证明检测到的信号就是拟南芥内源AtMGT10蛋白。【结论】原核表达了His-AtMGT1063-262蛋白,成功制备了特异性较强的AtMGT10蛋白多克隆抗体。     

枯草芽孢杆菌纤溶酶植物根系分泌表达生物反应器模型的建立

[目的]枯草芽孢杆菌纤溶酶是一种碱性丝氨酸蛋白水解酶,具有强烈的纤溶活性,临床上可用于预防和治疗血栓栓塞性疾病,可用于开发新型溶栓药物。[方法]该研究采用PCR法克隆枯草芽孢杆菌纤溶酶基因及其前导肽序列,通过农杆菌介导转化野生型拟南芥,并利用纤维蛋白平板法检测BSFE纤溶活性。[结果]通过农杆菌介导转化获得转BSFE基因拟南芥,PCR检测证实BSFE基因已在转基因拟南芥基因组内整合,纤溶活性检测进一步证实BSFE可在转基因拟南芥体内表达,并可通过组织及根系分泌型表达,建立植物组织及根系分泌表达外源蛋白的系统模型。[结论]该研究为进一步阐明外源蛋白分泌表达机理及建立植物根系分泌生物反应器提供依据。     

玉米Hd6-like基因植物表达载体的构建及其功能分析

利用已克隆的玉米Hd 6-like基因构建植物过量表达栽体PBI-Hd 6,将Hd 6-like插入带有启动子CaMV 35 S和终止子nos的PBI 121中间载体中,经过酶切鉴定表明,目的基因已正确地插入该栽体中.利用根癌农杆菌侵染花序法侵染拟南芥,将Hd 6-like基因转入拟南芥,获得转基因Hd 6-ox植株,经PCR检测表明,该基因已整合到拟南芥的基因组中.转基因Hd 6-ox植株的花期推迟了24 d左右.     

华山新麦草α-醇溶蛋白基因的克隆及原核表达分析

 【研究目的】克隆华山新麦草（Psathyrostachys huashanica）的α-醇溶蛋白基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。【方法】采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆出α-醇溶蛋白基因并进行序列分析,将克隆的华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5克隆到表达载体pET-28a (+)上,获得重组质粒pET28a-Gli-Ns转化大肠杆菌BL21 (DE3)并诱导表达。【结果】从华山新麦草基因组DNA中克隆了4个α-醇溶蛋白基因：Gli-Ns-2 (FJ713595)、Gli-Ns-3 (GQ139525)、Gli-Ns-4 (GQ139526)和Gli-Ns-5 (GQ139527)。序列分析表明,4条序列具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特征,含有8个或9个半胱氨酸残基,序列FJ713595为假基因。利用所构建的大肠杆菌表达载体,经IPTG诱导,华山新麦草α-醇溶蛋白基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核系统中特异性表达。Western-blot证实融合蛋白可成功表达。【结论】克隆了4个华山新麦草的α-醇溶蛋白基因序列,基因Gli-Ns-5(GQ139527)可在原核表达系统中成功表达,为小麦品质改良提供了新的候选基因。     

内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。     

水稻遗传转化甘露糖安全筛选体系的建立

根据genebank中公布的pmi基因序列设计引物,通过PCR扩增从大肠杆菌中分离出6-磷酸甘露糖异构酶基因。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA1300中的潮霉素抗性基因hpt,构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pPMI。对水稻进行了基因枪转化和农杆菌转化,研究了筛选培养基中甘露糖浓度对抗性愈伤组织频率的影响。部分抗性愈伤组织已获得再生植株,PCR检测初步证明外源基因已转入植物细胞。     

新型抗菌蛋白内溶素在大肠杆菌中的融合表达与纯化

抗菌蛋白E17G是一种通过基因改造获得的高效杀菌蛋白。为高效表达抗菌蛋白E17G并减少E17G的抗菌活性对大肠杆菌宿主菌的致死作用,将E17G基因克隆到原核表达载体pGEX 6P 1中,构建的重组原核表达载体pGEX 6P 1 E17G在低温下经IPTG诱导,E17G蛋白在大肠杆菌BL21中以GST E17G融合蛋白的形式表达,采用GST亲和层析纯化和收集GST E17G融合蛋白。SDS PAGE和Western blotting检测结果显示,GST E17G能在大肠杆菌中正确表达,为进一步研究E17G抗菌蛋白的生物学活性奠定了基础。     

赤霉病菌特异抗体-防御素融合蛋白的表达和功能鉴定

选择对赤霉病菌具有高度特异性和亲合力的单链抗体,与植物防御素构建成融合蛋白基因,将融合蛋白及防御素基因分别与细菌表达载体pGEX和植物表达载体pMBL4构建成重组载体,在细菌中经IPTG诱导表达GST融合蛋白,亲和层析纯化蛋白;经根癌农杆菌介导的真空渗入法在烟草叶片中瞬间表达,提取叶片总蛋白用于鉴定。抑菌活性分析表明,烟草叶片瞬间表达的防御素和抗体-防御素融合蛋白,均对赤霉病菌有强烈的抑菌作用;从细菌中纯化的防御素蛋白,也能有效抑制赤霉病菌生长。说明赤霉病菌抗体-防御素融合蛋白基因,可作为抗赤霉病资源,用于改良植物的抗赤霉病性。     

非洲马瘟病毒VP7基因的克隆与表达

为获得非洲马瘟病毒VP7蛋白,以用于制备AHS血清学诊断试剂并为AHS新型疫苗的构建奠定基础,笔者采用原核表达系统表达VP7蛋白。在GeneBank中查找非洲马瘟病毒VP7基因序列,人工合成VP7基因,将VP7基因片段克隆插入pBAD/Thio-TOPO表达载体,将重组质粒转入大肠杆菌TOP10。经测序鉴定,筛选获得VP7基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,经L-Arabinose诱导表达VP7融合蛋白抗原。SDS-PAGE分析表明以终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖进行诱导,4h后表达可达到高峰,融合蛋白质量约54.72kDa。Westernblotting检测和间接ELISA表明诱导表达的融合蛋白能与非洲马瘟病毒VP7单克隆抗体发生特异性反应,说明蛋白有特异的免疫学活性。     

烟草花叶病毒运动蛋白的表达及特异性抗体制备

从烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)感染的发病烟草叶片中提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到其运动蛋白基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上.DNA序列分析表明,所得运动蛋白基因全长为807 bp,与已报道的TMV-U1株系核苷酸和氨基酸同源性均为100%.将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-29a上,并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导4 h后蛋白表达量达到最大,超声波显示所得融合蛋白以不可溶形式存在.SDS-PAGA检测蛋白表达情况,表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体,ELISA测定效价为25600,Western-blot检测证明在烟草叶片被侵染早期MP得到表达,且抗体特异性良好.     

人雌激素相关受体α配体结合域的原核表达载体构建·表达及鉴定

[目的]构建含人雌激素相关受体α配体结合域区段的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]用Trizol试剂提取人肺腺癌A549细胞总RNA,逆转录为cDNA;应用PCR扩增人EERα-LBD基因片段,插入表达载体pET-30a-c(+)中;转化大肠杆菌BL2 l(DE3)PLysS,经IPTG诱导后表达并鉴定。[结果]应用PCR方法扩增出约687 bp的基因片段,酶切、纯化、连接至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约32 kD,纯化后用生物大分子相互作用系统鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人EERα-LBD融合蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达·纯化及活性检测李

[目的]表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1,并对其进行纯化和相关活性的检测。[方法]以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组质粒pGEM-VP1为模板,用特异性表达引物扩增其编码区,经酶切后与pGEX-4T-1、pPROExHTb等原核表达载体相连,转化大肠杆菌BL21（DE3）pLysS表达菌株,经IPTG诱导表达,以实现VP1蛋白的表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并对2种载体重组菌进行超声裂解,取上清和沉淀电泳,用金属螯合亲合层析法对His-VP1进行纯化。[结果]SDS-PAGE电泳分析显示pPRO-VP1诱导后目的条带为33ku,与预期结果相符;目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带;His-VP1可与A型口蹄疫病毒豚鼠灭活阳性血清发生特异性的反应。[结论]表达及纯化了具有高特异性的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1,为深入研究结构蛋白VP1在口蹄疫病毒致病机制中的作用奠定了基础。     

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA4编码区的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物（Banana bunchy top virus Chinese Zhangzhou,BBTV-ZZ)DNA4编码区，序列分析结果表明，该编码区由351个核苷酸组成，推测其编码一个含116个氨基酸的蛋白质（M.W.14.5ku)，将BBTVDNA4编码区克隆到原核表达载体pTYB2上，构建了该基因的融合表达载体pYTB-B4,SDS-PAGE电泳分析表明，69ku的融合蛋白在大肠杆菌ER2566（DE3）中正确表达，以含表达产物的凝胶为抗原，免疫家兔，制备了BBTVDNA4编码蛋白的特异抗血清，Western blot显示，在Southern blot分析为阳性的转BBTV DNA 4编码区烟草中，14．5ku的BBTV DNA4编码区蛋白得到表达，这为进一步研究BBTV DNA4编码区蛋白在整个植株体内的功能奠定了基础。     

微小牛蜱Bm86基因的克隆与原核表达

根据已发表的Bm86基因序列,设计表达型引物,利用RT-PCR技术,从微小牛蜱饥饿幼蜱的研磨物中扩增Bm86基因,将PCR产物连入pGEM-T Easy载体,构建重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86.测序分析表明:克隆的微小牛蜱Bm86基因序列与GenBank上登录的Bm86基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97%和95.6%.然后对重组克隆载体pGEM-T easy-Bm86进行双酶切,获得带有粘性末端的Bm86基因片段,并将此片段定向亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-Bm86,将其转化到BL21宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测表明表达产物为分子量为88 Ku的融合蛋白,目的蛋白约占蛋白总量的39%,表达量约为1.08 mg/mL.Western blot分析表明此表达产物能被兔抗微小牛蜱阳性血清所识别.     

中华蜜蜂MRJP7基因的原核表达及多克隆抗体的制备

用PCR方法从含中华蜜蜂Accmrjp7基因的质粒DNA模板中扩增出MRJP7成熟肽编码区片段,将该片段克隆入原核表达载体pGEX-4T-2,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中进行融合表达,SDS—PAGE和薄层扫描显示,该基因得到高效表达,表达产物大小约为66kDa,占细胞总蛋白的22．8％。利用割胶回收的方法,获得目的蛋白,注射兔子制备多克隆抗体,并利用所获抗体进行Western blot印迹分析,检测MRJPs,获得特异性条带。     

灰飞虱原肌球蛋白的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】通过筛选灰飞虱cDNA酵母表达文库发现原肌球蛋白（tropomyosin,Tm）能与水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）P10蛋白发生互作。研究旨在克隆灰飞虱原肌球蛋白基因（Tm）,将其在原核细胞中进行表达,纯化Tm蛋白,免疫大白兔并制备其多克隆抗体,为进一步分析Tm在灰飞虱与RBSDV互作过程中的作用提供抗体条件。【方法】根据与之高度同源的Tm基因信息确定灰飞虱Tm的开放阅读框（open reading frame,ORF）。提取灰飞虱总RNA,采用RT-PCR方法从灰飞虱中克隆Tm的ORF,连接至pMD-18T载体后进行测序分析,利用DNAstar软件分析该基因序列及其编码的蛋白特性。将测序验证正确的Tm通过EcoR V和BamH I限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pET-32a (+)。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),经终浓度为0.4 mmol?L^-1的IPTG诱导表达4 h后检测Tm融合蛋白的表达情况。离心收集诱导表达的大肠杆菌菌液,进行超声波破碎处理,收集上清及沉淀,采用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达。利用Ni-NTA Agarose纯化上清中的可溶性融合蛋白,经100 mmol?L^-1咪唑洗脱和0.01 mol?L^-1 PBST溶液透析后获取纯化的Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备多克隆抗血清,并采用间接ELISA法检测抗血清效价。纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的Tm多克隆抗体进行Western blotting检测,分析抗体的特异性。【结果】序列分析显示,灰飞虱Tm的ORF大小为852 bp。采用RT-PCR克隆获得此ORF并进行测序分析,结果表明扩增所得灰飞虱Tm的ORF长为852 bp,编码283个氨基酸,理论分子量大小为32.6 kD。序列比对结果发现所编码蛋白在不同物种间保守。将Tm ORF克隆入pET-32a (+)表达载体后在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析显示,融合蛋白大小约为55 kD,主要以可溶性蛋白形式表达,在包涵体中也有少量表达。纯化上清中的可溶性Tm融合蛋白,免疫大白兔,制备了多克隆抗体。抗体效价测定结果显示该抗体具有较好的灵敏度,效价大于1﹕409 600。采用制备的Tm多克隆抗体检测纯化的Tm融合蛋白及灰飞虱总蛋白,分别检测到1条约55 kD和约37 kD的特异性条带,表明该抗体有较强的特异性。【结论】克隆获得了灰飞虱Tm的ORF,并在大肠杆菌BL21 (DE3)中进行了诱导表达,纯化获得了Tm融合蛋白,制备了高效价的Tm多克隆抗体。