1株H6N6亚型禽流感病毒A/duck/Jiangsu/022/2009的全基因测序及遗传进化分析

目的对2009年分离自华东地区某活禽交易市场的1株国内未见报道的H6N6亚型禽流感病毒进行了全基因序列的测定,以探讨该病毒各基因片段的可能来源。方法通过常规的血清学试验确定病毒HA亚型,经RT-PCR方法扩增出各基因片段,连接到pGEM-Teasy载体上进行序列测定,利用BLAST进行序列的同源性分析,并结合GenBank中已收录的H6N6亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。结果 BLAST结果显示该H6N6病毒的HA基因与近年台湾分离株A/duck/Kingmen/E322/2004(H6N2)的核苷酸一致性最高(94.0%),推导的氨基酸剪切位点序列为P-Q-I-E-T-R-G,是典型低致病性禽流感病毒的特征序列;NA基因与华东地区分离株A/duck/EasternChina/160/2002(H4N6)的亲缘关系最近(核苷酸一致性91.0%);而PB1基因与荷兰2003年间分离的H7N7亚型流感病毒关系密切;PA基因则与1999-2000年间意大利分离的H7N1亚型流感病毒亲缘关系较近;NS1蛋白在第218位提前引入终止密码子致使C末端缺失13个氨基酸。结论国内首次分离到的H6N6亚型禽流感病毒的基因组构成较为复杂,但8个基因片段均属于欧亚系,与分离自北美地区的H6N6病毒的遗传距离较远,分别位于不同的进化分支。     

DG01株H5N1亚型禽流感病毒全基因组序列分析

根据国内外已公布的AIV H5N1亚型全基因组序列设计了8对引物,对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A/Duck/Guangdong/DG01/05(简称DG01)毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22 341bp,PB1 2 341bp,PA2 233bp,HA1 779bp,NP 1 565bp,NA1 398 bp,M1 027bp,NS 875 bp 8个节段组成,与往年及同年一些流行株比较分析结果显示,DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征,NA基因及NS1基因均有部分缺失,从基因特点分析属于2005年流行代表株。     

3株H9N2亚型禽流感病毒广西分离株全基因组序列的测定与分析

目的对3株H9N2亚型禽流感病毒进行全基因序列的测定与分析。方法根据GenBank公布的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的全基因序列,设计了8对引物,运用RT-PCR方法获取了3株H9N2亚型AIV广西地方分离株A/Chick-en/Guangxi/1/00、A/Chicken/Guangxi/14/00和A/Chicken/Guangxi/17/00的全基因序列,并对所得序列进行了比较分析。结果同源性分析及遗传进化分析发现,所分离的3个毒株的各基因与A/Chicken/Guangdong/4/00和A/Chicken/Jiangsu/1/00的相应基因的核苷酸序列有着较高的同源性和较近的亲缘关系,可能起源于同一种系。所分离毒株中每个毒株的8个基因,在遗传进化树上的分支不具有统一性,说明此3个毒株可能为不同基因亚系间发生自然重排的产物。氨基酸序列比较发现,A/Chicken/Guangxi/1/00、A/Chicken/Guangxi/14/00和A/Chicken/Guangxi/17/003株AIV的na基因核苷酸序列在开放性阅读框架的187～195位均缺失了ACAGAGATA共9个核苷酸,它们所编码的氨基酸为T、E、I。3个分离株的HA蛋白第226位氨基酸均为Gln,证明它们为人类非易感性的H9N2亚型AIV。结论此3株H9N2亚型流感病毒为基因自然重排的产物,其na基因均存在缺失,且从分子水平上证明它们对人类不具有易感性。     

我国鸡源与人源H9N2亚型流感病毒聚合酶PB1基因的关系分析

目的　通过对 1996～ 2 0 0 1年自我国部分养鸡场分离鉴定的 8株H9N2亚型鸡流感病毒聚合酶PB1基因测序 ,了解鸡源与人源H9N2亚型流感病毒聚合酶PB1基因的关系。方法　病毒在鸡胚中传代 ,自收获的尿囊液提取RNA ,通过RT-PCR ,扩增聚合酶PB1基因片段 ,并进行序列测定 ,测序结果采用PHYLIP软件在Internet网上分析处理 ,并用TreeView软件绘制系统进化树。结果　 8株H9N2亚型鸡流感病毒聚合酶PB1基因的核苷酸同源性为 97 4 %～ 99 7% ,与三株人源H9N2病毒A/Guangzhou/ 333/ 99、A/HongKong/ 10 73/ 99、A/HongKong/ 10 74 / 99的同源性分别为 90 6 %～ 91 9%、90 4 %～91 5 %、90 2 %～ 91 3%。该 8株鸡源H9N2病毒PB1基因属于相同的进化分支 ,即A/duck/HongKong/Y2 80 / 97-like分支 ,而与该 3株人源株H9N2病毒属于不同的进化分支 ;尚未发现PB1基因属于A/ quail/HongKong/G1/ 97或A/duck/Hong/Y4 39/ 97分支的鸡源分离株。结论　在我国养鸡业流行的H9N2病毒分离株与目前已分离的人源株H9N2病毒其PB1基因属于不同的进化亚分支 ,人源株H9N2病毒PB1基因不是来源于鸡源H9N2病毒。     

我国鸡源H9N2亚型禽流感病毒NS基因的分子进化分析

目的为了明确国内鸡群中H9N2亚型AIV中非结构蛋白(NS)基因系统进化情况,对1998-2008年间分离自发病鸡群中的14株H9N2亚型禽流感病毒(AIV)进行了非结构蛋白(NS)基因的克隆和序列测定,得到了NS1和NS2蛋白的完整编码序列。将NS核甘酸序列及推定的氨基酸序列与GenBank中已有的参考序列作比对,结果14株AIV的NS基因同源性在92.9%～99.9%,在系统进化上均属于NS基因A等位基因群中的A/Chicken/Beijing/1/1994分支。综合已有的研究结果,表明尽管A/Quail/Hongkong/G1/1997分支和A/Duck/Hongkong/Y439/1997分支的NS基因曾偶尔传入鸡群,但并未在我国鸡群中建立稳定的亚系。国内的H9亚型AIV的NS基因仅稳定存在着A/Chicken/Beijing/1/1994分支。     

黑龙江省活禽市场6株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列分析北大核心CSCD

目的了解2018年黑龙江省活禽市场H9N2亚型禽流感病毒变异特点和进化规律。方法采集黑龙江省禽流感监测点活禽市场的环境标本进行H9N2亚型的核酸检测,阳性标本进行病毒分离,对分离的禽流感病毒毒株进行全基因组序列测定,应用生物信息学软件分析其基因特征。结果 6株H9N2亚型禽流感病毒HA基因裂解位点附近氨基酸序列均为PSRSSRGLF,符合典型低致病性禽流感病毒基因的特征,HA蛋白受体结合位点第226位Q→L,具有与α-2,6唾液酸受体亲和力增强的特性,第183位突变为天冬酰氨;NA蛋白中63-65位茎部全部缺失,使病毒的生长受到抑制,在3个可能的血凝素结合位点中,6株病毒发生变异(368N,369G,402D);另外,HA和NA基因潜在糖基化位点也存在增加或缺失的现象;与参考序列相比,PB1、PB2蛋白有3处发生突变,增强了病毒的致病性;M2蛋白发生V27G和S31N突变,对金刚烷类药物产生耐药;NP和NS基因在几个关键位点上均未发生变异。遗传进化分析显示,6株H9N2亚型禽流感病毒在NA、M和NP基因中相似度更高,HA、NA基因位于Y280/97-like分支,PB2、M基因位于G1/97-like分支,PB1、PA、NP和NS基因均位于F/98-like分支。结论 6株H9N2亚型禽流感病毒发生了3配体重组,可能成为高致病性禽流感病毒H5、H7亚型部分基因的供体。因此,应加强对H9N2亚型禽流感病毒的监测,密切关注其变异情况及重组趋势。     

DG01株HSN1亚型禽流感病毒全基因组序列分析

根据国内外已公布的AIVH5N1亚型全基因组序列设计了8对引物，对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A／Duck／Guangdong／DG01／05（简称DG01）毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22341bp，PB1 2341bp，PA2 233bp，HA1 779bp。NP1 565bp，NA1 398bp，M1 027bp。NS 875bp8个节段组成，与往年及同年一些流行株比较分析结果显示。DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征，NA基因及NS1基因均有部分缺失，从基因特点分析属于2005年流行代表株。     

2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA及NS基因进化分析

目的 分析2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)血凝素(Hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)及非结构蛋白(Non-structural,NS)基因进化特征.方法 从2014年长沙市活禽市场采集501份环境标本,利用Real-time PCR方法进行A型、H5、H7和H9亚型流感病毒核酸检测,并对单一H5阳性标本进行核苷酸测序,病毒HA、NA和NS基因测序结果进行在线BLAST分析,利用Mega5和Bioedit软件构建核苷酸进化树和氨基酸(Amino acids,aa)比对.结果 从501份环境标本中检出A型H5亚型病毒阳性标本177份(检出率35.33％),其中8份标本经核苷酸测序鉴定为H5N1亚型病毒,进化分析表明大部分H5N1病毒HA基因位于2.3.2分支内,聚集形成一个新亚分支,NA及NS基因位于2.3.2.lb亚分支.HA蛋白受体结合位点aa为QSG,表现为禽流感病毒受体特征;NA蛋白未出现H275Y及N295S aa替换,对神经氨酸酶抑制剂敏感;HA、NA及NS蛋白关键分子位点表现为高致病性的分子特征.结论 2014年长沙市活禽市场污水中H5N1亚型禽流感病毒HA、NA和NS基因表现为高致病性的分子特征,但不具有对人易感的受体特征,需要进一步监测.     

2019-2020年山东省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒抗原性及血凝素基因特征分析北大核心CSCD

目的了解山东省2019-2020年分离株A(H1N1)pdm09亚型流感病毒的抗原性及血凝素(hemagglutinin, HA)基因变异情况。方法采用单向红细胞凝集抑制试验对2019-2020监测年分离的15株A(H1N1)pdm09亚型流感病毒进行抗原性分析;PCR扩增病毒的HA基因并测序,进行进化分析,以及糖基化位点、抗原变异位点、受体结合位点的变异分析。结果 2019-2020年流行株A(H1N1)pdm09亚型流感病毒均为疫苗株A/Brisbane/02/2018的类似株。HA基因均属于6B.1分支,毒株HA基因核苷酸序列与当季疫苗株A/Brisbane/02/2018的同源性为98.5%~99.0%,与最新疫苗株A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019的核苷酸同源性为99.3%~99.8%。所有毒株与当季疫苗株相比均出现了T185I位点变异。结论 2019-2020监测年度山东省流行的A(H1N1)pdm09亚型流感病毒与WHO推荐的疫苗组分匹配性良好,疫苗株推荐存在滞后性。HA基因与其编码的氨基酸持续变异,因此应加强对病毒变异的监测,为疫苗筛选及流感防控措施的制定提供参考。     

H9亚型禽流感病毒HA基因的克隆与序列分析

目的扩增、克隆H9N2 HA基因,并进行序列分析,为H9N2流感病毒种间及跨种传播机制研究奠定基础。方法设计特异性引物,扩增克隆H9N2亚型禽流感病毒,测序后进行序列分析。结果成功克隆出4株H9N2亚型禽流感病毒,全长均为1.7 kb,ORF为1 683 bp,编码560个氨基酸;联机检索,与参考毒株比对核苷酸和氨基酸同源性均在90%以上。结论成功克隆4株H9N2亚型禽流感病毒,序列分析显示其核苷酸和推导氨基酸与参考毒株高度同源。     

1株重组H6N2禽流感病毒全基因组特征分析

目的 掌握广州地区禽类市场H6N2亚型禽流感病毒的分子遗传特征,为禽流感的科学防控提供研究数据.方法 对禽类市场外环境分离株A/EN/Guangzhou/13565/2018(H6N2)进行全基因组序列测定,应用生物信息软件分析分子遗传特征.结果 A/EN/Guangzho u/13 5 6 5/2018(H6 N2)...     

Genetic Characterization and Pathogenicity of H7N7 and H7N9 Avian Influenza Viruses Isolated from South Korea

H7 low pathogenic avian influenza viruses (LPAIVs) can mutate into highly pathogenic avian influenza viruses (HPAIVs). In addition to avian species, H7 avian influenza viruses (AIVs) also infect humans. In this study, two AIVs, H7N9 (20X-20) and H7N7 (34X-2), isolated from the feces of wild birds in South Korea in 2021, were genetically analyzed. The HA cleavage site of the two H7 Korean viruses was confirmed to be ELPKGR/GLF, indicating they are LPAIVs. There were no amino acid substitutions at the receptor-binding site of the HA gene of two H7 Korean viruses compared to that of A/Anhui/1/2013 (H7N9), which prefer human receptors. In the phylogenetic tree analysis, the HA gene of the two H7 Korean viruses shared the highest nucleotide similarity with the Korean H7 subtype AIVs. In addition, the HA gene of the two H7 Korean viruses showed high nucleotide similarity to that of the A/Jiangsu/1/2018(H7N4) virus, which is a human influenza virus originating from avian influenza virus. Most internal genes (PB2, PB1, PA, NP, NA, M, and NS) of the two H7 Korean viruses belonged to the Eurasian lineage, except for the M gene of 34X-2. This result suggests that active reassortment occurred among AIVs. In pathogenicity studies of mice, the two H7 Korean viruses replicated in the lungs of mice. In addition, the body weight of mice infected with 34X-2 decreased 7 days post-infection (dpi) and inflammation was observed in the peribronchiolar and perivascular regions of the lungs of mice. These results suggest that mammals can be infected with the two H7 Korean AIVs. Our data showed that even low pathogenic H7 AIVs may infect mammals, including humans, as confirmed by the A/Jiangsu/1/2018(H7N4) virus. Therefore, continuous monitoring and pathogenicity assessment of AIVs, even of LPAIVs, are required.     

H9N2亚型禽流感病毒纤突蛋白基因的分析

目的　克隆禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ / 99(H9N2 )纤突蛋白血凝素基因和神经氨酸酶基因 ,并与同一亚型不同毒株的病毒进行比较。方法　本研究以自行设计的引物 ,一次性成功地扩增出KMⅢ毒株HA和NA全长基因cD NA ,并将它们克隆和测序。以获得的核苷酸序列和氨基酸序列与其它毒株的HA蛋白和NA蛋白比较。结果　HA基因由16 83bp组成 ,编码 5 6 0个氨基酸 ;NA全基因为 14 0 7bp、编码 4 6 9个氨基酸残基 ;HA1羧基端的氨基酸组成是 :R -S -S -R ,符合低致病力毒株的分子特征。它们的氨基酸组成虽有差异 ,但与血凝素和神经氨酸酶功能关系密切的氨基酸残基却高度保守。联机检索表明 ,KMⅢ的HA基因cDNA与其它H9N2亚型HA基因最大同源性在 82 %～ 96 %之间。NA基因cDNA与其它H9N2亚型NA基因的最大同源性在 88%～ 97%之间。结论　我们首次克隆和测序了KMⅢ毒株的HA基因和NA基因 ,并对它们进行了分析     

2007--2008年上海市H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化

目的对分离自上海活禽批发市场的11株H9N2亚型AIV（2007年5株、2008年6株）进行了PB2,PBl,HA,NP和NA的测序,以阐明2007年至2008年上海地区H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异及分子特征。方法采集鸡气管和泄殖腔样品,将H9亚型荧光RT—PCR试剂盒检测的阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了这11个毒株的PB2,PBl,HA,NP和NA并进行了序列测定。结果对HA基因进行遗传发生关系分析,这11株分离株均属于Ck／Bei／1／94系。这11个毒株的5个片段的组成有两种方式。结论上海活禽批发市场的1l株H9N2亚型AIV毒株中已包含了H5的片段,所以在今后的工作中加强H9N2亚型禽流感流行病学监测是非常必要的。     

2009年广东省甲型流行性感冒暴发流行期间首株甲型H1N1流行性感冒病毒血凝素基因分析

目的 检测和分析2009年广东省甲型流行性感冒(流感)暴发流行期间首株甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)基因.方法 对2009年广东省首例确诊的甲型H1N1流感患者的咽拭子进行病毒分离,取细胞培养上清液提取病毒核酸,采用HA基因的特异性引物进行RT-PCR,PCR产物进行克隆、测序和同源性分析.结果 获得2009年广东省首株甲型H1N1流感病毒的HA基因,大小为1710 bp,命名为A/GuangzhouSB/01/2009(H1N1)HA,GenBank登录号为GQ268003.与疫情发源地近期报告的277株甲型H1N1流感病毒的HA基因比对,同源性为99.0%～99.8%;其中与美国报告的病毒株的同源性高达99.8%,与患者发病前曾到美国旅游的流行病学史一致.与25株中国季节性甲型H1N1流感病毒的HA基因比对,同源性为72.3%～85.6%.结论 2009年广东省甲型流感暴发流行期间首株甲型H1N1流感病毒与目前流行的甲型H1N1流感病毒同源性高,与中国季节性甲型H1N1流感病毒同源性较低.     

广西犬源H9N2亚型流感病毒分离株的全基因组测序分析及其对小鼠的致病性实验

目的 对广西犬只尤其是宠物犬中携带H9N2亚型流感病毒进行全基因组序列特征分析以及小鼠的致病性研究,为流感病毒疫情的防控提供科学依据。方法 采用RT-PCR的方法扩增、测序全基因组,DNAStar和MEGA6.0软件分析氨基酸同源性和进化树,通过小鼠感染实验探究其致病性。结果 13株H9N2毒株8个基因节段来源于5个不同谱系的毒株,属于新基因型,氨基酸同源性与广西分离株A/equine/Guangxi/3/2011≥99.0%,6个内部基因与2013年自人流感病毒分离株H7N9亲缘关系密切。毒株HA的裂解位点均为RSSR↓GLF,表明低致病力。氨基酸位点HA226、 NA119、NP375和PB2的701位等有变化,其中HA226位为亮氨酸L,具有与人SAα2,6-Gal结合的特性。BALB/c小鼠感染健康犬只中分离的H9N2病毒未在体内复制,而源自感冒犬只的毒株Ca/GX/8和Ca/GX/10能够在体内复制,临床症状明显但不致死。病毒经小鼠体内传代后致病力增强,推测是PB2的611位和PA623位氨基酸改变导致。结论 从广西各地犬只中获得的13株H9N2亚型流感病毒株经分析发现虽源于禽源,但具备和人源受体特异性结合的能力,且内部基因遗传进化关系复杂,对哺乳动物及人类存在较大威胁,亟需加强防控。     

2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09流感病毒基因特性分析

目的 分析海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒的抗原性和基因特性,了解病毒的变异情况,为海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒的防控提供依据。方法 选取14株2019-2020年海南省流感监测网络实验室分离到的A(H1N1)pdm09亚型流感病毒进行基因序列测定,测序结果用MEGA 10.1.8和DNASTAR7.0.1软件进行基因特性分析。结果 2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒与国际疫苗株A/Brisbane/02/2018的血凝素基因(Hemagglutinin HA)和神经氨酸酶基因(Neuraminidase NA)均在核苷酸进化树6B.1分支上。海南分离株与疫苗株A/Brisbane/02/2018 HA基因核苷酸和氨基酸同源性范围分别为98.5%~99.1%和97.7%~99.1%,对神经氨酸酶抑制剂敏感,HA基因在Sa抗原决定簇NQT162-164有共同变异位点,N162位点的变异增加了1个潜在糖基化位点。Sb抗原决定簇K156位点发生变异的分离株为参考血清A/Brisbane/02/2018的低反应株,其余分离株均为疫苗株A/Brisbane/02/2018的类似株。结论 2019-2020年海南省A(H1N1)pdm09亚型流感病毒与WHO推荐的北半球疫苗组分匹配。     

Genetic Characterization and Pathogenesis of Three Novel Reassortant H5N2 Viruses in South Korea, 2018

The outbreaks of H5N2 avian influenza viruses have occasionally caused the death of thousands of birds in poultry farms. Surveillance during the 2018 winter season in South Korea revealed three H5N2 isolates in feces samples collected from wild birds (KNU18-28: A/Wild duck/South Korea/KNU18-28/2018, KNU18-86: A/Bean Goose/South Korea/KNU18-86/2018, and KNU18-93: A/Wild duck/South Korea/KNU18-93/2018). Phylogenetic tree analysis revealed that these viruses arose from reassortment events among various virus subtypes circulating in South Korea and other countries in the East Asia–Australasian Flyway. The NS gene of the KNU18-28 and KNU18-86 isolates was closely related to that of China’s H10N3 strain, whereas the KNU18-93 strain originated from the H12N2 strain in Japan, showing two different reassortment events and different from a low pathogenic H5N3 (KNU18-91) virus which was isolated at the same day and same place with KNU18-86 and KNU18-93. These H5N2 isolates were characterized as low pathogenic avian influenza viruses. However, many amino acid changes in eight gene segments were identified to enhance polymerase activity and increase adaptation and virulence in mice and mammals. Experiments reveal that viral replication in MDCK cells was quite high after 12 hpi, showing the ability to replicate in mouse lungs. The hematoxylin and eosin-stained (H&E) lung sections indicated different degrees of pathogenicity of the three H5N2 isolates in mice compared with that of the control H1N1 strain. The continuing circulation of these H5N2 viruses may represent a potential threat to mammals and humans. Our findings highlight the need for intensive surveillance of avian influenza virus circulation in South Korea to prevent the risks posed by these reassortment viruses to animal and public health.