Bax、Bcl-2ASODN联合转染增强宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的实验研究

目的:研究凋亡抑制基因bcl-2反义寡核苷酸(ASODN)和促凋亡基因bax联合转染对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响,进而探求其放射增敏作用。方法:用逆转录病毒颗粒感染HeLa细胞,获得HeLa-bax细胞后,将bcl-2ASODN转染HeLa及HeLa-bax细胞,36h后放射治疗,通过MTT法、细胞形态学及流式细胞仪检测细胞增殖与凋亡,半定量RT-PCR测bcl-2及bax基因的表达。结果:(1)HeLa细胞经bcl-2ASODN及bax联合转染并放疗后,光镜观察有明显凋亡趋势;(2)MTT法及流式细胞仪检测其凋亡率明显高于单基因转染+放疗组(P<0.05);(3)RT-PCR结果显示,bax基因表达显著增强,而bcl-2基因表达较各对照组明显减弱。结论:凋亡抑制基因bcl-2ASODN和促凋亡基因bax联合转染诱导HeLa细胞凋亡效果明显优于单基因转染,可有效提高HeLa细胞的放射敏感性。     

小剂量甲磺酸伊马替尼对缺氧的子宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响

缺氧是导致肿瘤细胞放疗抵抗的主要原因之一.缺氧在实体瘤中是一个常见的现象,实体瘤中缺氧细胞占10%～50%,对放射线有较强的抵抗,成为肿瘤放疗后复发和转移的潜在根源[1].甲磺酸伊马替尼(其他名称:格列卫)是一种高效特异的酪氨酸激酶抑制剂,通过阻止酪氨酸激酶受体如Bcr-Abl、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、干细胞因子(c-Kit)等的自身磷酸化,影响细胞信号传导,从而影响肿瘤细胞的增殖、分化与凋亡.本研究将分子靶向药物--甲磺酸伊马替尼作用于正常和缺氧状态下的宫颈癌细胞系HeLa细胞,研究小剂量甲磺酸伊马替尼对于缺氧状态下HeLa细胞放射敏感性的影响及其作用机制,为甲磺酸伊马替尼进一步应用于宫颈癌的放射增敏治疗提供实验依据.     

小剂量甲磺酸伊马替尼对缺氧的子宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响

缺氧是导致肿瘤细胞放疗抵抗的主要原因之一.缺氧在实体瘤中是一个常见的现象,实体瘤中缺氧细胞占10%～50%,对放射线有较强的抵抗,成为肿瘤放疗后复发和转移的潜在根源[1].甲磺酸伊马替尼(其他名称:格列卫)是一种高效特异的酪氨酸激酶抑制剂,通过阻止酪氨酸激酶受体如Bcr-Abl、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、干细胞因子(c-Kit)等的自身磷酸化,影响细胞信号传导,从而影响肿瘤细胞的增殖、分化与凋亡.本研究将分子靶向药物--甲磺酸伊马替尼作用于正常和缺氧状态下的宫颈癌细胞系HeLa细胞,研究小剂量甲磺酸伊马替尼对于缺氧状态下HeLa细胞放射敏感性的影响及其作用机制,为甲磺酸伊马替尼进一步应用于宫颈癌的放射增敏治疗提供实验依据.     

小剂量甲磺酸伊马替尼对缺氧的子宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响

缺氧是导致肿瘤细胞放疗抵抗的主要原因之一.缺氧在实体瘤中是一个常见的现象,实体瘤中缺氧细胞占10%～50%,对放射线有较强的抵抗,成为肿瘤放疗后复发和转移的潜在根源[1].甲磺酸伊马替尼(其他名称:格列卫)是一种高效特异的酪氨酸激酶抑制剂,通过阻止酪氨酸激酶受体如Bcr-Abl、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、干细胞因子(c-Kit)等的自身磷酸化,影响细胞信号传导,从而影响肿瘤细胞的增殖、分化与凋亡.本研究将分子靶向药物--甲磺酸伊马替尼作用于正常和缺氧状态下的宫颈癌细胞系HeLa细胞,研究小剂量甲磺酸伊马替尼对于缺氧状态下HeLa细胞放射敏感性的影响及其作用机制,为甲磺酸伊马替尼进一步应用于宫颈癌的放射增敏治疗提供实验依据.     

多西紫杉醇对人宫颈癌细胞放射增敏作用的研究

目的探讨多西紫杉醇对人宫颈癌细胞系Hela的放射增敏作用。方法2004年在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所采用克隆形成实验分析不同浓度多西紫杉醇以及多西紫杉醇不同预处理时间对Hela细胞生长抑制的影响,用多靶单击拟合模型方程测定各组细胞放射增敏比评价增敏效果;四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法检测1.0nmol/L多西紫杉醇对2Gy/次常规分割放疗和1Gy/次、0.5Gy/次低剂量分割放疗方式的增敏效果。结果1.0nmol/L和5.0nmol/L多西紫杉醇放射增敏比分别为1.26和1.69。5.0nmol/L多西紫杉醇分别预处理3h、6h、12h、24h的放射增敏比分别为:1.21、1.31、1.62、1.71,预处理6～12h期间细胞放射增敏比增高速率最快。1.0nmol/L多西紫杉醇对2Gy/次、1Gy/次(×2)、0.5Gy/次(×4)分割放疗组的放射增敏比分别为:2.03、2.51、3.57;多西紫杉醇增敏比分别为:1.41、1.82、2.92,每组中放射增敏比较多西紫杉醇增敏比高。结论多西紫杉醇对宫颈癌细胞系Hela有良好的放射增敏作用,对低剂量分割放射的增敏作用更强。     

抑制mdr1基因对人宫颈癌细胞放射敏感性影响的实验研究

目的:探讨用反义技术抑制癌基因mdr1对宫颈癌细胞(HeLa)放射敏感性的影响。方法:设空白组、mdr1正义寡核苷酸组和脂质体组(仅加入等量的脂质体)为对照组以及mdr1反义寡核苷酸组,用RT-PCR检测宫颈癌细胞处理前后mdr1表达水平的变化。用集落形成试验检测各实验组照射后人宫颈癌HeLa细胞株集落形成率,AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡率的变化,流式细胞仪测定Bcl-2蛋白的表达。结果:mdr1反义寡核苷酸能有效地抑制mdr1癌基因的表达,经脂质体介导的mdr1反义寡核苷酸作用的宫颈癌细胞经60Coγ射线照射后其集落形成率较正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降,而凋亡率明显增加,Bcl-2蛋白表达显著下调,与对照各组比较有显著差异(P<0.05)。结论:mdr1反义寡核苷酸通过抑制mdr1基因降低人宫颈癌HeLa细胞放射抗性。其辐射增敏作用可能与mdr1反义寡核苷酸增加照射后肿瘤细胞的凋亡率有关。     

吉西他滨对人子宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用及其机理研究

目的研究低浓度[即处理24 h时的10％药物致死剂量,24 h IC10]吉西他滨对人宫颈癌HeLa细胞的放射增敏作用及其机理。方法采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选吉西他滨增敏实验的浓度(即24 h IC10);以该浓度吉西他滨处理HeLa细胞4、8、12及24 h,弃药后立刻行60Coγ射线照射(4、6、8 Gy),计数细胞存活分数,计算增敏比;同时采用流式细胞仪分析细胞周期分布和凋亡效应,蛋白印迹杂交法分析p53、bcl-2及box蛋白表达量的变化。结果吉西他滨的24 h IC10,为0.01μmol/L,该浓度吉西他滨分别处理细胞4、8、12及24 h,弃药后立刻照射,增敏比分别为1.19、1.35、1.72、1.93。流式细胞仪分析显示,S期细胞比例随吉西他滨处理时间延长而逐渐升高(P<0.01),其中处理24 h时,S期细胞占51.8％。吉西他滨处理后照射,凋亡细胞比例占21.6％,同时,凋亡相关基因p53、bcl-2及bax蛋白的表达量,与单纯吉西他滨处理及单纯照射相比无明显变化(P>0.05)。结论低浓度吉西他滨对HeLa细胞具有放射增敏作用,其增敏比随吉西他滨处理时间延长而增加。增敏机理与细胞S期阻滞密切相关,而与引发细胞凋亡关系不明显。     

NS-398对宫颈癌细胞系的增殖抑制作用及对survivin基因表达的影响

目的:研究选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂NS-398对宫颈癌HeLa,SiHa细胞系的增殖、凋亡作用及其对凋亡抑制基因survivin表达的影响。方法:体外培养宫颈癌HeLa,SiHa细胞系,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析不同浓度的NS-398分别作用于HeLa,SiHa细胞系24h、48h后对细胞增殖的作用;流式细胞仪(FCM)检测对细胞凋亡的作用;RT-PCR分析对凋亡抑制基因survivin表达的影响。结果:MTT检测显示,NS-398可抑制宫颈癌HeLa,SiHa细胞系增殖,并有浓度时间依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。FCM检测提示,NS-398可诱导HeLa,SiHa细胞系凋亡,有浓度依赖性,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR分析表明,NS-398可抑制HeLa,SiHa细胞系凋亡抑制基因survivinmRNA表达,与对照组的差异有统计学意义(P<0.05)。结论:NS-398可抑制宫颈癌HeLa,SiHa细胞增殖,诱导凋亡,其机制与抑制凋亡抑制基因survivin mRNA表达有关,为宫颈癌治疗提供了新的靶点和理论依据。     

Ubiquitin B在宫颈癌细胞凋亡中的作用及机制的初步探讨

目的:研究Ubiquitin B的过度表达对宫颈癌细胞凋亡的影响,并初步探讨其机制.方法:脂质体转染Ubiquitin B至宫颈癌细胞系HeLa细胞后,real-time PCR检测细胞内Ubiquitin B mRNA的表达水平;流式细胞术和DNA Ladder法检测其凋亡;PI法检测细胞周期变化;Western blot法检测凋亡相关蛋白Smad 4和Mcl-1的表达.结果:转染Ubiquitin B后,HeLa细胞中Ubiquitin B mRNA的表达水平在转染24h后明显高于它在对照组细胞中的表达.与对照组相比,转染了Ubiquitin B的HeLa细胞凋亡显著增加.但Ubiquitin B的过表达对HeLa细胞的周期无明显影响.Western blot分析表明,凋亡相关蛋白Smad 4在转染Ubiquitin B 48h时表达增强,而Mcl-1表达明显减弱.结论:UbiquitinB可促进宫颈癌细胞系HeLa细胞凋亡,其机制可能是Ubiquitin B通过增强表达凋亡促进蛋白Smad 4和降解凋亡抑制蛋白Mcl-1而促进了HeLa细胞的凋亡.     

阿司匹林联用PT化疗抑制人宫颈癌细胞株HeLa增殖的研究

目的:研究阿司匹林(ASA)联用PT方案[奥沙利铂(OXA)+多西紫杉醇(DOC)]抑制人宫颈癌细胞株HeLa增殖的作用。方法:倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,MTT法检测并计算各组药物的细胞抑制率,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化及细胞凋亡率。结果:ASA可抑制HeLa细胞生长,作用24h时将肿瘤细胞聚集在G0/G1期并可诱导细胞凋亡。ASA与PT联用可显著抑制HeLa细胞增殖(P<0.05),不同时间PT增敏比依次为1.33、1.32、1.56,且联合用药诱导细胞凋亡作用显著增强。结论:ASA与PT方案协同可抑制人宫颈癌HeLa细胞株增殖,ASA有望用于宫颈癌的内科治疗。     

Genistein对人卵巢癌细胞系TC-1增殖抑制和诱导凋亡作用的研究

目的:研究植物雌激素染料木黄酮(genistein)对人卵巢癌细胞系TC-1细胞增殖的抑制作用和凋亡的诱导作用,探讨其抗癌作用的机制。方法:应用MTT法检测不同浓度genistein对TC-1细胞的生长抑制作用,电镜观察药物作用后细胞超微结构的改变,流式细胞仪检测细胞周期、定量分析凋亡,DNA琼脂糖凝胶电泳法确定凋亡。结果:TC-1细胞经不同浓度genistein处理后,细胞生长明显受到抑制,且这种抑制作用呈时间及浓度依赖性,5mg/L和10mg/L genistein作用72h后,抑制率分别达到89·84%和97·99%。genistein阻断TC-1细胞生长于G2/M期,在G0/G1前出现典型的亚二倍体凋亡峰,且凋亡呈时间依赖性。电镜观察到用药后凋亡细胞典型的形态学特征。DNA凝胶电泳可观察到细胞凋亡特异的DNA梯形带。结论:genistein对TC-1细胞生长的抑制作用呈明显的时间及浓度依赖性,并诱导其发生凋亡。     

Antiproliferative and apoptotic effects of iron chelators on human cervical carcinoma cells

OBJECTIVE: Cervical carcinoma is a human papillomavirus (HPV)-associated cancer for which treatment options still mainly rely on surgical procedures, with or without adjuvant radiotherapy and chemotherapy. As iron may participate in the pathogenesis of viral infections and cancer in several ways, the present study was designed to investigate the effect of iron chelation on HPV-16- and HPV-18-positive cervical carcinoma cell lines. METHODS: Desferrioxamine and deferiprone, two chemically unrelated iron chelators, were used to investigate the effect of iron chelation on SiHa and HeLa cells. Proliferation was investigated by cells counts, by [(3)H]thymidine uptake assay, and by immunostaining with Ki-67 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Apoptosis was determined by morphological analysis, by a TUNEL assay, and by flow cytometry detecting FITC-conjugated annexin-V. RESULTS: Desferrioxamine and deferiprone induced a time- and dose-dependent inhibition of SiHa and HeLa cell growth. The inhibition of cell growth was associated with a decrease in the expression of both stable and total PCNA and Ki-67, a proliferation marker whose expression may predict survival in uterine cervical carcinoma. TUNEL assay, flow cytometry with annexin-V-fluorescein, and morphological analysis indicated that iron chelation also induced a time- and dose-dependent apoptosis of both cell lines. This apoptotic effect was prevented by the addition of exogenous iron. CONCLUSION: These results show that iron chelation inhibits the growth and induces the apoptosis of HPV-positive carcinoma cells. This suggests that iron chelators may represent a potential therapeutic approach for the management of cervical carcinoma.     

NS-398对宫颈癌HeLa细胞的生长抑制及诱导凋亡作用的研究

目的研究环氧合酶-2(COX-2)选择性抑制剂NS-398对宫颈癌细胞的作用及其作用机制,探讨NS-398在宫颈癌治疗中的可能性。方法用不同浓度NS-398作用于人宫颈癌HeLa细胞,CCK-8法检测NS-398对HeLa细胞增殖的影响;流式细胞仪PI染色法检测细胞周期改变;AnnexinⅤ-FITC/PI双标法检测细胞早期凋亡。结果 NS-398对人宫颈癌HeLa细胞的增殖具有明显抑制作用。其抑制率随着药物浓度的增高而增加,随着药物作用时间的延长而显著增高。与对照组比较,NS-398处理组G1期细胞明显减少,而S期细胞明显增多,两组比较,差异有统计学意义(P0.05);NS-398作用24h后,在10μmol/L组的HeLa细胞凋亡率为5.60%;20μmol/L组凋亡率为12.89%,而40μmol/L组的凋亡率高达27.03%,对照组HeLa细胞无凋亡。结论 NS-398对宫颈癌细胞具有明显的抑制作用,且呈剂量和时间依赖性。其对宫颈癌细胞的作用可能与诱导癌细胞凋亡有关。     

宫颈癌细胞TRAIL死亡受体和诱骗受体表达的研究

目的:检测宫颈癌细胞HeLa表面TRAIL死亡受体(DR4、DR5)及诱骗受体(DcR1、DcR2)的表达差异,研究HeLa细胞系对TRAIL蛋白诱导的凋亡敏感程度。方法:应用MTT法检测TRAIL蛋白对人宫颈癌细胞HeLa的诱导凋亡率,分析宫颈癌细胞对TRAIL蛋白的敏感程度;应用逆转录聚合酶链反应技术(RTPCR)、流式细胞术,检测人宫颈癌细胞HeLa表面TRAIL受体DR4、DR5、DcR1、DcR2mRNA和蛋白的表达,分析宫颈癌细胞表面死亡受体DR4、DR5与诱骗受体DcR1、DcR2表达的相对程度。结果:HeLa细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡反应有较高的敏感性,在较低浓度(100ng/ml)TRAIL的作用下,即有接近50%的细胞杀伤率。HeLa细胞表面DR4、DR5受体mRNA的表达明显高于DcR1、DcR2受体,差异有显著性(P<0.01),DR4、DR5受体之间及DcR1、DcR2受体之间表达差异无显著性(P>0.01)。HeLa细胞表面DcR1,DcR2受体蛋白的表达率(17.7%、5.3%)明显较DR4,DR5受体表达率(99.9%、97.8%)低(P<0.01)。结论:宫颈癌细胞HeLa对TRAIL诱导的细胞凋亡反应有较高的敏感性,而且DcR1、DcR2在宫颈癌细胞表面的表达程度相对低于DR4、DR5,将TRAIL用于治疗宫颈癌具有潜在的应用前景。     

可遗传性表达人乳头瘤病毒18型E6发夹状RNA干扰质粒对宫颈癌细胞生长特性的影响

目的:探讨稳定转染可遗传性表达HPV18E6shRNA质粒对HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞株生长特性的影响。方法:实验组为稳定转染表达HPV18E6shRNA的pE6-1shRNA质粒和含E6基因突变点的pE6-2shRNA质粒的宫颈癌Hela细胞株,对照组为稳定转染pSUPER空质粒和未转染质粒的宫颈癌HeLa细胞株。MTS测各组细胞的生长曲线,流式细胞仪检测各组细胞周期的变化和增殖指数;软琼脂细胞培养分析各组细胞集落形成能力。结果:MTS显示pE6-1shRNA组较pE6-2shRNA、空质粒pSUPER组及未转染组的HeLa细胞增殖率低,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测,pE6-1shRNA组G0-G1期细胞数较pE6-2shRNA组增加了12.5%,较未转染的HeLa细胞组增加了13·3%(均P<0.05);pE6-1shRNA组进入S期的细胞数较pE6-2shRNA组减少了9·4%,较未转染的HeLa细胞组减少了8.5%(均P<0.05),G2-M期细胞数在各组差异无显著性(P>0.05)。转染pE6-1shRNA组细胞增殖指数23.7%;而pE6-2shRNA组细胞增殖指数36.1%,未转染组细胞增殖指数36.9%。细胞软琼脂培养2周,pE6-1shRNA组的HeLa细胞的克隆形成率4.2%,较未转染组的HeLa细胞克隆形成率7.2%低(P<0·05,χ2=5.56),也低于转染pE6-2shRNA和pSUPER组(P>0.05)。结论:稳定转染可遗传性表达HPV18E6shRNA质粒的宫颈癌HeLa细胞,其细胞增殖周期和细胞生长受到抑制。     

Survivin gene RNA interference inhibits proliferation, induces apoptosis, and enhances radiosensitivity in HeLa cells

OBJECTIVE: Survivin is a new member of the inhibitors of apoptosis (IAPs) family. It is upregulated in various malignancies including human cervical carcinomas. Reduction of this molecule has resulted in chemosensitization, but it is uncertain whether it can lead to radiosensitization. We observed the effect of survivin gene RNA interference (RNAi) on the proliferation, apoptosis, and radiosensitivity of the human cervical carcinoma cells HeLa. STUDY DESIGN: Human cervical carcinoma cells (HeLa) were transfected with the specific siRNA expression vector (pSilencer2.1-s2) designed to target survivin mRNA. A corresponding site-mutated vector was constructed as a negative control (pSilencer2.1-NC). The expression of survivin mRNA and its protein among the stable transfected cells and the untransfected ones was detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting respectively. The cell growth was examined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay. The cell cycle distribution and cell apoptosis were measured by flow cytometry. The changes in cell radiosensitivity were observed by clonogenic survival assay. RESULTS: Three stable transfected cell lines: HeLa-s2 (with pSilencer2.1-s2), HeLa-NC (with pSilencer2.1-NC), and HeLa-U6 neo (with empty vector pSilencer2.1-U6 neo) were established. The expression levels of survivin gene mRNA and protein in HeLa-s2 were significantly lower than in HeLa-NC, HeLa-U6 neo, and those untransfected HeLa cells. The expression inhibitory rates were 62.8% and 60.1%. The cell proliferation of HeLa-s2 was inhibited, and the highest inhibitory rate was 57.8+/-2.1%. The changes in cell cycle distribution in HeLa-s2 compared with the other three cell lines were obvious, many cells were blocked in the G(0)/G(1) phase 72.7+/-3.1% (P<0.05), reduced sharply in the G(2)/M phase (5.1+/-2.9)% (P<0.05), and also the apoptotic rate was 29.2+/-1.4%, obviously increasing (P<0.05). At the same dose of radiation, the cloning efficiency of HeLa-s2 declined notably (P<0.05); the cell survival curve showed a significant decrease in D(0) and D(q), which were 3.15 and 1.21, respectively (P<0.05), and the radiation enhancement ratios were 2.01 (a ratio of D(0)) and 1.77 (a ratio of D(q)). CONCLUSIONS: Survivin gene RNAi not only could inhibit the proliferation of human cervical carcinoma cells (HeLa), but also could significantly enhance the radiosensitivity of those cells through the reduction of its mRNA and protein. Therefore, an RNAi-targeted survivin gene strategy would be a potential approach to radiosensitization therapy in human cervical carcinomas.