陕西榆林地区马铃薯腐烂茎线虫的特异性分子鉴定

旨在对陕西榆林8个县区马铃薯腐烂茎线虫群体进行特异性分子鉴定,明确该地区线虫病害的种群类型,为马铃薯腐烂茎线虫病的快速诊断和及时防控提供理论依据。采用通用引物rDNA1/rDNA2和特异性引物DdS1/DdS2 (A型)、DdL1/DdL2(B型)进行基因扩增、测序、序列分析并构建系统发育树,对线虫种类进行鉴定。结果显示,陕西榆林8个采样点线虫病害种类均为马铃薯腐烂茎线虫B型,并且这8个地理种群的马铃薯腐烂茎线虫具有较高的亲缘关系。     

从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法

 【目的】建立直接从多种线虫混合样品以及香蕉和红掌根组织中检测鉴定香蕉穿孔线虫的PCR方法。【方法】使用Primer Premier 5.0在香蕉穿孔线虫的ITS区设计1对特异性引物,运用PCR技术对目的线虫DNA进行特异性检测。【结果】通过对17种24个种群线虫的检测表明,所设计的引物只能从香蕉穿孔线虫种群中特异扩增出rDNA-ITS片段,产物大小为518 bp。利用该特异引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系,可以直接从香蕉穿孔线虫与短体线虫、螺旋线虫、肾状线虫、根结线虫、茎线虫、矮化线虫、纽带线虫、丝尾垫刃线虫、滑刃线虫和小杆线虫混合样品中特异扩增出目的线虫的rDNA-ITS片段,并可以分别从混合有不少于3条香蕉穿孔线虫的2 cm香蕉或红掌根组织（约0.1 g）中特异检测出目的线虫的DNA片段。【结论】本研究设计的特异性引物以及建立的DNA提取方法和PCR体系可直接从多种线虫混合的样品以及香蕉和红掌根组织中快速检测鉴定出香蕉穿孔线虫。     

甘薯腐烂茎线虫重组酶聚合酶扩增方法的建立与应用

【目的】本文以甘薯腐烂茎线虫ITS序列基因片段为靶标,建立了一种针对该线虫的RPA检测方法。【方法】RPA检测反应使用TwistAmp~? Basic Kit,分别对甘薯腐烂茎线虫群体、单条线虫以及甘薯组织或土壤中的线虫进行特异性和灵敏度检测。【结果】RPA方法可特异性鉴定甘薯腐烂茎线虫群体、单条线虫以及甘薯组织或土壤中的线虫。甘薯腐烂茎线虫基因组DNA和单条线虫的检出限分别为10~(-2 )ng/μl和1/100条,与普通PCR检测灵敏度相当。【结论】RPA技术是一种耗时短、灵敏度高、稳定性强的甘薯腐烂茎线虫分子鉴定技术。     

基于线粒体DNA-COI序列的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测

【目的】设计禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）和菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）特异性引物,建立同步快速检测这两种线虫的双重PCR体系,为中国小麦孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析10种植物寄生线虫24个群体的线粒体DNA（mtDNA）COI序列,分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物HaF8和HfF9,以及下游通用引物HafR8;通过引物浓度比和退火温度的优化,建立针对这两种CCN的双重PCR检测体系;利用该体系对中国黄淮麦区部分CCN样品进行种类鉴定。【结果】筛选并获得的特异性引物HaF8/HafR8及HfF9/HafR8,可在一步PCR反应中实现对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性检测。引物HaF8/HafR8对禾谷孢囊线虫的特异性扩增产物为200 bp,而HfF9/HafR8对菲利普孢囊线虫的特异性扩增产物为320 bp,条带区分较明显。对双重PCR检测体系的优化发现,引物HaF8、HfF9、HafR8的退火温度为58℃时,该检测体系具有较高的特异性和扩增效率;引物HaF8﹕HfF9﹕HafR8浓度比为0.24﹕0.16﹕0.4 μ·L^-1时,该检测体系能从不同供试线虫中同时特异性地检测出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫,且扩增效率较高。该检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单孢囊的检测灵敏度为1/2 000 000个孢囊,而对2龄幼虫的检测灵敏度则分别为1/640条线虫和1/1 280条线虫。对采集自中国黄淮麦区CCN病田的14份土样进行双重PCR检测,发现有8个样本只扩增出200 bp的条带,表明这些样本的CCN种类为禾谷孢囊线虫,有4个样本只扩增出320 bp的条带,表明CCN种类为菲利普孢囊线虫,2个样本同时扩增出200和320 bp两个条带,表明样品为禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的混合发生。以上结果表明,该检测体系可以成功用于两种小麦孢囊线虫田间复合侵染情况的快速诊断。【结论】基于mtDNA-COI序列开发的特异性引物以及建立的双重PCR检测体系,可用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫田间单一和混合发生样本的同步快速检测。     

对辣椒抗性基因Me3表现毒性的南方根结线虫 群体的SCAR分子标记

【目的】研究南方根结线虫（Meloidogyne incognita）Me3毒性变异群体的分子标记,用快速有效的分子方法来鉴定毒性变异的发生。【方法】以南方根结线虫的无毒群体以及抗性基因Me3毒性群体为材料,用根据南方根结线虫基因组设计的100对引物和19对来自文献的引物进行扩增,筛选出在3个种群中扩增的差异条带,设计SCAR引物,并建立多重PCR反应体系。【结果】得到了7对能在3个群体稳定扩增出差异条带的多态性引物,把其中的2个位点开发为SCAR标记,能够区分开3个线虫群体。多重PCR反应体系在无毒群体和Me3毒性群体中分别扩增出1条999 bp和1条629 bp的条带,在混合群体扩增出999和629 bp的2条带。【结论】成功开发了对Me3表现毒性的南方根结线虫变异群体的分子标记,可用多重PCR体系一次性鉴定Me3毒性变异的发生。     

昆明烤烟种植区根结线虫种类的初步鉴定

【目的】随着昆明烤烟主要栽培品种的变化,田间为害烟草的根结线虫种类亦可随之变化,为了掌握当前昆明烤烟种植区为害烤烟的根结线虫种类,对昆明烤烟种植区根结线虫种类进行了初步鉴定,以期为该区域烟草根结线虫病的防治提供理论依据。【方法】采用雌成虫会阴花纹形态特征及分子检测(SCAR特异性鉴定)方法对采自昆明烟草主产区的7县(石林县、寻甸县、禄劝县、宜良县、晋宁县、嵩明县、富民县)1市(安宁市)的26个烟草根结线虫寄主样本进行种类鉴定。【结果】有14个样本为花生根结线虫M.arenaria,5个样本为爪哇根结线虫M.javanica,4个样本为南方结线虫M.incognita,3个样本为花生根结线虫M.arenaria和爪哇根结线虫M.javanica的复合种群。【结论】本研究对为害昆明烟区根结线虫种类进行了初步鉴定。     

西藏尼木县绵羊背带属线虫形态及分子分类鉴定

【目的】2014年在西藏尼木县绵羊皱胃收集到红褐色线虫830余条,对其进行形态及分子分类鉴定。【方法】首先进行了形态学鉴定,之后提取DNA,用特异性引物扩增ITS-2基因,并进行测序,与Gen Bank中的相关序列进行了同源性比较,建立了系统发育树。【结果】西藏尼木县绵羊体内感染的寄生虫为背带属普通背带线虫Teladorsagia circumcincta。【结论】首次在西藏发现背带属普通背带线虫Teladorsagia circumcincta。家畜寄生虫分子分类学研究今后将成为西藏寄生虫病研究重要组成。     

陕西不同地区马铃薯腐烂茎线虫的分离鉴定及同源性分析

旨在鉴定陕西不同地区马铃薯腐烂茎线虫生物型,为其防治提供理论依据。对陕西不同地区马铃薯腐烂茎线虫进行分离,对其形态进行观察并测量特征值,通过茎线虫线粒体COⅠ通用引物、ITS区通用引物及A、 B生物型的特异性引物对不同地区采集马铃薯腐烂茎线虫进行PCR检测及序列分析,利用MEGA6.0进行系统发育树构建及种群同源性分析。结果表明,陕北地区腐烂茎线虫的生物型为B型,关中地区为A型。形态特征值数据显示雌成虫体长、体宽均大于雄成虫,A型的体长、体宽均大于B型。系统发育树结果显示,陕北不同地区的B型马铃薯腐烂茎线虫聚为一支,合阳、兴平的A型马铃薯腐烂茎线虫聚为一支,与分子鉴定结果相一致。     

小麦孢囊线虫江苏群体的形态学与分子特征鉴定

【目的】明确小麦禾谷类作物孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）江苏群体的种类组成及群体间遗传变异情况,为抗病品种的选育、利用以及病害综合防治提供依据。【方法】对江苏省的13个代表性CCN群体进行孢囊、阴门锥和2龄幼虫的形态观察和形态测计并与相似种进行比较;PCR扩增上述群体的rDNA-ITS区并克隆测序,构建基于ITS序列的系统发育进化树。【结果】通过形态观察和形态测计值的比较,所测定的江苏群体均与已报道的禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）中国群体的测计值相接近;系统进化关系分析显示CCN江苏群体、国内其它地区以及国外禾谷孢囊线虫群体均处于同一大的进化分子簇,且国内和国外群体分别处于不同的进化分支。【结论】所测定的13个江苏省CCN代表性群体均为禾谷孢囊线虫,各群体间形态及ITS序列变异较小,江苏省目前尚未发现菲利普孢囊线虫（H. filipjevi）。     

云南省马铃薯孢囊线虫种类鉴定

【目的】明确在云南省马铃薯产区部分种植地发现的马铃薯孢囊线虫(Globodera spp.)的种类,为制定病害防治措施提供依据。【方法】田间观察植株地上部症状及根部为害症状,采集根际土壤和受害根系作为样本并从中分离孢囊线虫,采用形态学和分子生物学方法进行种类鉴定。【结果】形态鉴定表明：线虫孢囊和2龄幼虫(the second stage juvenile,J2)的形态特征及测量值与国际报道描述的马铃薯金线虫(G. rostochiensis)一致。分子鉴定表明：该线虫28S rDNA-D2/D3区PCR扩增产物为784 bp,核酸序列与NCBI数据库中登录的马铃薯金线虫相似度为99.11%～100.00%;其mtDNA-cox1区扩增产物为447 bp,序列与NCBI数据库中登录的马铃薯金线虫相似度为99.28%～99.33%。系统进化树分析表明：该线虫28S rDNA-D2/D3区序列和mtDNAcox1区序列均以100%的支持率与马铃薯金线虫聚于同一分支。经马铃薯金线虫特异性引物ITS5/PITSr3鉴定,该线虫能扩增出约430 bp的条带,与已报道的马铃薯金线虫一致。【结论】确定...     

甘肃省胡萝卜根结线虫病病原鉴定

为了明确根结线虫种类，采用形态学和分子生物学方法，对甘肃省临洮县胡萝卜上的根结线虫进行鉴定，并测定其致病性。结果表明，该群体雌虫虫体梨形或柠檬形，乳白色，口针粗壮，中食道球近圆形。雌虫会阴花纹呈卵圆形，背弓较平缓，肛门处有刻点。雄虫虫体细长，尾部钝圆，交合刺针状，成对。2龄幼虫虫体细长，呈蠕虫形，唇区无明显缢缩，口针发达，口针基部球小而圆，尾部透明区明显，尾尖钝圆。利用特异性引物Mh-R/Mh-F扩增得到大小为462 bp的特异性片段，与北方根结线虫（Meloidogyne hapla）一致。基于根结线虫属rDNA ITS和28S-rDNA D2D3区序列构建系统发育树，发现该群体均与北方根结线虫序列聚为一支。将该线虫接种胡萝卜，其症状与田间发病症状一致，35 d后分离线虫，其形态特征与北方根结线虫相符。综上，形态学特征结合分子生物学方法，将该病原鉴定为北方根结线虫（M.hapla），这是甘肃省首次报道北方根结线虫危害胡萝卜类蔬菜作物。     

皇竹草竞争抑制入侵植物假臭草的潜力

【目的】探索安全有效控制华南地区危害严重的入侵杂草假臭草Praxelis clematidea的方法,检验皇竹草Pennisetum hydridum是否具有竞争抑制乃至替代控制假臭草的潜力。【方法】设置一系列不同比例皇竹草与假臭草的混种盆栽试验,测定2种植物的竞争指数及形态特征。【结果】假臭草的竞争平衡指数为-0.97～-0.40,在所有比例的混种处理中均小于0,说明皇竹草始终处于竞争优势地位。皇竹草的单株生物量随着假臭草的种植比例增加而增加,从最低48.98 g增加至最高161.66 g;假臭草与皇竹草混种限制了假臭草的茎、叶的发育和生长,导致混种处理的假臭草单株总叶面积比单种假臭草减少43.4%～68.2%、单株总茎长减少49.4%～63.6%、单株分枝数减少46.1%～71.6%。【结论】皇竹草对假臭草有竞争抑制作用,具有替代控制假臭草的潜力。     

中草药日本鸢尾内生真菌的分离及其初步鉴定

目的 分析日本鸢尾（Iris japonica）内生真菌的类群分布。方法 通过菌落形态特征、显微镜下的孢子观察及基于ITS序列分析的分子生物学鉴定分析日本鸢尾各部位内生真菌的类群组成。结果 从日本鸢尾的根茎叶中共分离得到5种内生真菌。根中分离得到的内生真菌为橘青霉（Penicillium citrinum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）,茎中为小新壳梭孢菌（Neofusicoccum parvum）,叶中为橘青霉（Penicillium citrinum）、肉色隔孢伏革菌（Peniophora incarnata）、首都叶点霉（Phyllosticta capitalensis）。结论 自日本鸢尾分离获得5种内生真菌,其分布具有一定的组织特异性,可为药用植物内生真菌的开发和利用提供一定基础。     

Diagnosis and characterization of the ribosomal DNA-ITS of potato rot nematode (Ditylenchus destructor) populations from Chinese medicinal herbs

The potato rot nematode (Ditylenchus destructor) is a very economically important nematode in agronomic and horticultural plants worldwide. In this study, 43 populations of D. destructor were collected from different hosts across China, including 37 populations from Chinese herbal medicine plants. Obtained sequences of ITS-rDNA and D2–D3 of 28S-rDNA genes of D. destructor were compared and analyzed. Nine types of significant length variations in ITS sequences were observed among all populations. The differences in ITS1 length were mainly caused by the presence of repetitive elements with substantial base substitutions. Reconstructions of ITS1 secondary structures showed that the minisatellites formed a stem structure. Ten haplotypes were observed in all populations based on mutations and variations of helix H9. Among them, 3 known haplotypes (A–C) were found in 7 populations isolated from potato, sweet potato, and Codonopsis pilosula, and 7 unique haplotypes were found in other 36 populations collected from C. pilosula and Angelica sinensis compared with 7 haplotypes (A–G) according to Subbotin’ system. These unique haplotypes were different from haplotypes A–G, and we named them as haplotypes H–N. The present results showed that a total of 14 haplotypes (A–N) of ITS-rDNA have been found in D. destructor. Phylogenetic analyses of ITS-rDNA and D2–D3 showed that all populations of D. destructor were clustered into two major clades: one clade only containing haplotype A from sweet potato and the other containing haplotypes B–N from other plants. For further verification, PCR-ITS-RFLP profiles were conducted on 7 new haplotypes. Collectively, our study suggests that D. destructor populations on Chinese medicinal materials are very different from those on other hosts and this work provides a paradigm for relevant researches.     

基于种特异性线粒体细胞色素氧化酶I引物快速鉴定茄二十八星瓢虫和马铃薯瓢虫

【目的】茄二十八星瓢虫Henosepilachna vigintioctopunctata和马铃薯瓢虫Henosepilachna vigintioctomaculata都是茄科作物上的重要害虫,对茄科作物造成极大的经济损失。这2种瓢虫由于外形非常相似,无法通过体表特征区分,因此很有必要开发一种准确且快速的区分方法。【方法】基于这2种瓢虫线粒体细胞色素氧化酶I(Mitochondrial cytochrome oxidase I, mtCOI)的物种特异性,利用种特异性(Species-specific,SS)PCR引物建立了一种分子鉴定技术,即以茄二十八星瓢虫和马铃薯瓢虫之间的mtCOI基因序列变异为基础,设计了2对SS-mtCOI引物Hvp和Hvm。【结果】用这2对引物进行PCR扩增,均出现物种特异性扩增现象。在不同的DNA质量浓度下对该SS-mt COI引物进行敏感性检测,结果表明,Hvp引物在茄二十八星瓢虫DNA质量浓度为3.13 mg/L时仍可检测到扩增条带,Hvm引物在马铃薯瓢虫DNA浓度为2.43 mg/L时仍能检测到扩增条带。此外,Hvp和Hvm引物也能准确鉴定马铃薯瓢...     

Pb2+对甘肃纹党种子萌发和幼苗生理特性的影响

以甘肃道地中药材纹党(Codonopsis pilosula)为对象，通过室内培养试验，研究不同浓度10^-6、10^-5、10^-4、10^-3 mol/L Pb²⁺处理对纹党种子萌发、幼苗生长以及生理特性的影响，为探究Pb²⁺污染对纹党品质的影响提供依据。结果表明，Pb²⁺对纹党种子吸胀过程中相对吸水量的增加有抑制作用，随着Pb²⁺浓度的提高，党参种子的萌发率、萌发指数、幼苗生长及根尖微核和有丝分裂率变化，表现出先升高后降低的趋势；低浓度的Pb²⁺处理能够促进叶绿素的形成，高浓度则抑制叶绿素形成；可溶性糖、游离脯氨酸和丙二醛含量，随Pb²⁺浓度的升高而增加；Pb²⁺对SOD、POD和CAT活性有较强的抑制作用。可见，生物测定结果大多达到显著差异水平。     

玄参叶的形态解剖学研究

目的 为玄参叶的开发利用和质量控制提供科学依据。方法 按生药学常规方法对玄参叶进行形态解剖学研究,其中组织切片采用徒手切片和石蜡切片相结合的方法,叶表面制片采用撕取表皮的方法,叶表面扫描电镜观察采用脱水、干燥、喷金后常规扫描的方法,组织、叶表面、粉末图均采用显微拍摄。结果 找出了玄参叶的性状和显微鉴别特征。结论 此研究可作为鉴定玄参叶的依据。     

醒斑银弄蝶Carterocephalus alcina Evans, 1939与其近似种(鳞翅目: 弄蝶科: 链弄蝶亚科)的关系

目的 探讨醒斑银弄蝶Carterocephalus alcina Evans, 1939与其近似种的关系。方法 广泛采集醒斑银弄蝶及其近似种样本,基于形态特征、COI条形码及地理分布进行关系分析。结果 黄斑银弄蝶C. alcinoides Lee, 1962应是醒斑银弄蝶C. alcina的个体变异,故为其新异名;产自北京的2个银弄蝶标本与其近似种间的最小平均遗传距离为3.9%,在系统树上独立成支,前翅中室基部和后翅前缘中部有斑且后翅M_1-2室斑延伸至外缘,为其独有;醒斑银弄蝶、北京支系、银弄蝶C. palaemon和黄翅银弄蝶C. silvicola呈高度支持的单系支。结论 黄斑银弄蝶是醒斑银弄蝶的新异名;产自北京的近似于醒斑银弄蝶的种群是一个新种,即长斑银弄蝶Carterocephalus longimaculatus Hou, Fan & Li sp. nov.。     

不同生长条件下铁皮石斛内生细菌多样性及活性菌株的筛选

目的 比较和分析野生与人工栽培铁皮石斛Dendrobium officinale 内生细菌分布特点,筛选有较强定殖能力的活性菌株,为促进野生铁皮石斛驯化、提高药材品质奠定基础。方法 采用组织块分离法分离铁皮石斛根、茎、叶各部位的内生细菌,利用16S rDNA序列和系统发育树对分离菌株进行分析鉴定,体外筛选具有解磷、解钾、固氮、产铁载体、产IAA、拮抗病原菌的促生活性菌株,回接后再分离,观察内生细菌在组培苗中的定殖动态。结果 从铁皮石斛中分离到285株内生细菌,其中,217株分离自野生铁皮石斛,归类于3门9属,以芽孢杆菌属Bacillus和不动杆菌属Acinetobacter为优势菌群存在于根、茎、叶中,其菌株数分别占总分离菌株数的79.26%和8.76%;68株内生细菌分离自人工栽培铁皮石斛,归类于1门3属,以伯克霍尔德菌属Burkholderia和埃希菌属Escherichia为优势菌群存在于根、茎中,其菌株数分别占总分离菌株数的54.41%和30.88%。泛菌属Pantoea在野生和人工栽培铁皮石斛中均有分布。野生铁皮石斛内生细菌的物种数(9)和多样性指数(0.85)明显高于人工栽培铁皮石斛(物种数为3,多样性指数为0.61)。活性筛选共获得38株菌株,占筛选菌株的45%,4株野生铁皮石斛的活性内生细菌中有3株在人工组培苗具有较好的定殖性。结论 野生与人工栽培铁皮石斛内生细菌的类群结构和生物多样性具有明显差异,铁皮石斛内生细菌蕴含丰富的促生潜力。     

籽用乌桕优良单株遗传分子标记及亲缘关系分析

乌桕[Sapium sebiferum(L.)Roxb.]是我国极富经济价值的优良树种。在前期安徽籽用乌桕良种选育的基础上,进一步采用ISSR分子标记方法,对优良单株的遗传分子标记及亲缘关系进行分析。结果表明,筛选的10条引物在6种供试材料中均能稳定、清晰的扩增出条带,6个样品遗传多样性丰富,初步建立了5个乌桕优良单株的遗传分子标记。进一步聚类分析表明,形态学表现性状相近的乌桕优良单株,在分子生物学上的亲缘关系也较近,合适的引物能将品质优劣的籽用乌桕品种区分开来,表明用ISSR分子标记来鉴定乌桕优良品系的方法是可行的。