我国部分地区NDV的分子流行病学研究

新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ,ＮＤ）是由新城疫病毒（ＮＤＶ）引起的禽类的一种以呼吸道、消化道粘膜出血为典型症状的急性传染病,其病原——ＮＤＶ是副粘病毒科、副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属的成员,为有囊膜的负链ＲＮＡ病毒。ＮＤＶ基因组为单股不分节ＲＮＡ,编码六种病毒结构蛋白,其中融合蛋白（Ｆ）和血凝素－神经氨酸酶蛋白（ＨＮ）构成囊膜外表面的纤突,是ＮＤＶ的功能性糖蛋白,在致病和免疫应答过程中起重要作用［１］。由于ＮＤＶ只有一种血清型,对ＮＤＶ不同毒株的差异性分析只能采用毒力、蚀斑形成能力测定等功能性试验来进行,但分型要么太细,无规律可循;要么过于粗放,无流行病学意义,使得ＮＤＶ流行病学研究一直难以突破。 近年来,随着分子生物学技术的广泛应用,使得人们在分子水平上对病毒遗传变异机制的研究取得了长足进展,发现病毒的遗传变异与疾病的流行有着密不可分的联系,并形成了病毒分子流行病学这样一门崭新学科,也为ＮＤ的流行病学研究提供了一种先进技术。已有研究表明,ＮＤＶＦ基因的遗传变异与ＮＤＶ的变异和流行密切相关,是ＮＤＶ分子流行病学研究的首选基因。 本研究根据新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ基因编码区１－３７４位核苷酸序列计算其遗     

2011年我国部分地区猪瘟病毒分子流行病学研究

本研究对2011年我国部分地区养猪场采集的疑似猪瘟病料组织样本209份,分别用FQ-RT-PCR和RT-nPCR两种方法检测猪瘟病毒(CSFV)。结果FQ-RT-PCR检测出55份猪瘟阳性,RT-nPCR检测出53份阳性,2种方法符合率达96.3%。将53份阳性产物进行测序及同源性分析,显示这53份流行株均为2.1基因亚型。所分离的流行株与疫苗株(HCLV)和石门株(SM)的核苷酸同源性分别为79.4%~83.1%和79.4%~82.5%。研究结果表明,目前我国部分地区的养殖场仍有猪瘟病毒的存在,且以2.1亚型为主;流行株与疫苗株同源性仍高于77.4%,结合免疫攻毒试验,说明目前使用的猪瘟疫苗依然有效。     

东北地区不同宿主NDV分离株的系统发育进化分析

本研究针对我国东北地区获得高免新城疫（Newcastle disease，ND）抗体鸡群仍然发生ND的情况，对所分离的18株鸡源新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）和1株鸽源NDV的融合蛋白（F）基因（532bp或280bp）高变区片段进行扩增、克隆和测序（GenBank序列号：AY208680-AY208698）。结果表明，各分离毒株之间核苷酸同源性为83．1％～100％。各分离株间的氨基酸同源性为85．5％～100％。系统进化树分析表明，IL-12、HLJ-3与V4株同属于基因Ⅰ型；HLJ-4,JL-14为基因Ⅵ型，其余15株均为基因Ⅶ型。可见目前东北地区ND的流行是由三种不同基因型毒株，老的基因Ⅰ型、Ⅵ型，新的Ⅶ型所引发，但以基因Ⅶ型为主要流行株，这与我国其他地区和世界其他国家的ND流行情况相一致。     

宁夏地区新城疫分子流行病学特点分析

试验对2005～2006年从宁夏地区分离到的6株新城疫病毒进行遗传学特性研究,采用RT-PCR扩增了分离株F基因主要功能区片段并进行序列测定,序列分析表明6株分离株扩增片段的长度均为535bp,与预期扩增片段长度大小一致.裂解位点的氨基酸组成均为112R-R-Q-K-R-F117,具有强毒株的典型分子特征.通过构建新城疫病毒F基因的遗传进化树,表明6株宁夏分离株在分类地位上均属于基因Ⅶd亚型,与我国近年来新城疫病毒主要流行优势基因型一致,同时表明在宁夏地区至少有2个不同来源的毒株同时流行.     

2005年中国新城疫病毒分子流行病学研究

采用2005年从国内不同地区、不同宿主分离到的NDV分离株，选取其中具有代表性的83株，用RT-PCR技术扩增其F基因重要的功能区片段，进一步进行序列测定。序列分析表明所扩增的目的片段长度为535bp，序列测定结果已经登陆到GenBank，登陆号为DQ439866-DQ439948。参照国内外已发表的部分毒株的F基因序列，构建了NDV的遗传进化树，分析毒株间的遗传进化关系。通过遗传进化分析表明83株NDV分离株中有65株属于基因Ⅶ型，9株属于基因Ⅱ型，5株属于基因Ⅰ型，3株属于基因Ⅵ型，1株属于基因Ⅲ型。表明我国目前ND的流行情况比较复杂，其中基因Ⅶ型新城疫病毒所引起的新城疫在国内呈流行趋势，同时也存在其它基因型的散发，从而为我国目前新城疫的防治提供了科学的参考依据。     

2012年-2015年我国部分地区禽偏肺病毒的分子流行病学分析

为了调查鸡群中禽偏肺病毒（aMPV）的流行情况,本研究从江苏、辽宁、河南、山东、河北等地有肿头症状的鸡群中取其鼻甲骨和鼻黏液进行 RT-PCR 检测,随机选取9株 PCR 阳性产物对其 F 基因进行序列测定与遗传进化分析。结果表明,280份病料中检出阳性样品142份,阳性检出率达50．7％;9个试验毒株之间 F 基因同源性为99．4％～100％,与 B 型 aMPV 代表株的同源性为97．7％～99．9％,而与 A 型、C型和 D 型 aMPV 代表株的同源性为71．9％～79．4％;由遗传进化树可见,这9株 aMPV 均属于 B 型分支。说明我国鸡群中目前存在 aMPV 感染,B 型毒株是优势流行基因型,从而为禽偏肺病毒疫苗的开发提供了流行病学资料。     

我国部分地区新城疫病毒的流行现状分析

从近年来由我国不同地区、不同宿主分离到的新城疫病毒(NDV)野外分离株中,选取其中具有代表性的16株,用RT PCR技术扩增其F基因重要的功能区片段,进一步进行克隆和序列测定.参照国内外已发表的部分毒株的F基因序列,构建了59株NDV的遗传进化树,分析其毒株间的遗传进化关系.序列分析表明,所扩增的目的片段长度为535bp,所分离的毒株在分裂位点的氨基酸顺序为112R-R-Q/R-K/R-R-F117,均相当于NDV的强毒株.通过遗传进化树分析表明,16株分离株中有13株为基因Ⅶ型NDV,说明目前基因Ⅶ型NDV所引起的新城疫在国内呈流行趋势.     

我国南方某省猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株分子流行病学分析

根据GenBank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332的基因序列设计并合成了一对针对ORF5基因的引物,通过RT-PCR方法对我国南方某省部分地区分离的14个PRRSV分离株进行扩增,获得了大约773bp的DNA片断,将目的片断与pMD18-T载体进行连接并测序。应用DNAStar分析所测序列,并与LV、VR-2332、CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2、JX-1等毒株的序列进行比较。核苷酸序列分析表明:14株病毒的与JX-1ORF5基因同源性高达99.0%～99.8%,与CH-1a、HB-1、HB-2同源性达到91.4%～94.9%,与VR-2332、BJ-4同源性达到86.1%～87.6%,与LV同源性仅为55.2%～55.7%。氨基酸序列分析表明:与JX-1同源性高达97.5%～99%;与VR-2332、CH-1a、BJ-4、HB-1、HB-2同源性达到85.6%～94.5%;与LV同源性仅为55.7%～56.2%。可知这14株病毒与JX-1遗传关系较近,可归属同一基因亚群。     

新城疫病毒分子流行病学研究进展

新城疫在世界范围内已经引起了4次大流行,每次大流行都是由一种新基因型引起的。尽管新城疫病毒只有1个血清型,但其基因型众多。论文主要综述了新城疫病毒基因型的划分方法以及国内外不同时期新城疫的流行状况及其特点,分析了国内外流行毒株及流行趋势,目前在国内外三大家禽中主要流行基因Ⅶd亚型毒株,鸽群中主要流行基因Ⅵb亚型毒株,为我国新城疫的防控提供理论基础。此外,弱毒株在新城疫的传播中所起的作用也值得关注。     

3株鹅源新城疫病毒的分子特征和遗传发生分析

2005年分离的3株鹅源新城疫病毒毒株经毒力（MDT）检测为强毒株，鸡胚平均死亡时间为48～60h。RT—PCR扩增出了融合蛋白（F）基因，测定相应的核苷酸序列并进行遗传发生分析和酶切位点分析。对基因编码的氨基酸序列进行了推导，3个试验毒株的蛋白酶裂解激活位点附近的氨基酸序列均为112R（K）RQKR↓F117，为强毒特征序列。根据绘制的系统进化发生树和F基因上3种限制性内切酶（RE）位点分布．确定了这3个毒株均为基因Ⅶ型。以上证据表明该基因型的新城疫病毒在我国鹅群的流行占据一定优势。     

2株鸽源新城疫病毒的毒力鉴定和基因型分析

2008年从临床鸽病例中分离到2株新城疫病毒毒株,经测定,鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为48h和46h,8周龄SPF鸡静脉接种指数(IVPI)分别为2.88和2.91,一日龄雏鸡脑内接种指数(IPCI)分别为1.88和1.89,按照OIE推荐的标准均为强毒株。RT-PCR扩增出融合蛋白(F)基因片段,测序,推导的氨基酸序列中蛋白酶裂解位点附近的氨基酸序列均符合强毒特征序列。根据F蛋白的部分基因序列绘制的系统进化发生树和F基因片段中3种限制性内切酶(RE)位点分布判定这2个毒株均为基因Ⅶc型。     

四株新城疫病毒流行株F基因的遗传变异分析

设计并合成了两对寡核苷酸引物，P1和P2用于扩增新城疫病毒（NDV）全长F基因，P3和P4用于扩增NDV部分F基因。通过RT-PCR一次性扩增了NDV四平株和长春株的全长F基因和青岛株、昌黎株的部分F基因。将这些基因分别克隆后，进行了序列测定和同源率、致病性、疏水性、抗原性和系统发育等比较分析。结果表明，四平株和长春株F基因同为1762bp,编码553个氨基酸。两种F基因推导的氨基酸序列的疏水性相似，都具有3个强疏水区，但亲水性有差异，抗原表位也有明显的不同，说明四平株和长春株F蛋白的抗原性不同。4株NDV F基因序列（1-813bp)和推导的氨基酸序列（261aa)与我国台湾和国外有代表性的NDV F基因相同区域进行了比较和系统发育分析。总体上，核苷酸序列同源率在82.9%-97.5%之间，推导的氨基酸序列同源率在85.8%-97.7%之间，长春株与La Sota、Texas GB、Beaudette在同一亚群，四平株、昌黎株在同一亚群，青岛株为另一亚群。四平株、青岛株和昌黎株F蛋白裂解位点区（112-117aa)的氨基酸序列与强毒株在这一区域的序列相符，证明这3个NDV毒株是强毒株，长春株F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与弱毒株的序列相符，证明是弱毒株。     

西北地区新城疫病毒分离株F基因的克隆与序列分析

从西北地区（陕西、甘肃、青海和新疆）1979～1999年发生新城疫鸡群中共分离和收集了15个毒株,经蚀斑纯化、SPF鸡胚增殖得到9株NDV分离株。致病力测定结果表明,除2株为中强毒外,其余均为强毒株。以异硫氰酸胍法提取病毒基因组RNA,RT－PCR扩增基融合蛋白（F）基因N端908bp的片段,经回收、鉴定后,克隆到pGEM-T载体上进行核苷酸序列测定。对各毒株核苷酸及推导的氨基酸进行序列和同源性的比较,结果表明所有毒株在该区段没有缺失和插入,但有多处碱基置换。各分离毒株之间同源性很高（平均96．8％）,与疫苗毒株同源性较低（82．5～85．8％）,而分离自青海省的3个毒株与其他毒株的同源性均较低（平均88．0％）。以389bp核苷酸绘制系统发育树,证实西北地区的新城疫是由基因型Ⅶc和一个新发现的基因型Ⅸ引起的。     

不同时期NDV地方株F基因的克隆及序列分析与基因型研究

利用RT-PCR技术对1998-2002年闯洛阳地区新城疫典型发病禽群中所分离到的15个毒株的F基因主要功能区片段进行了克隆和序列分析，并根据其47～435位核苷酸序列构建了系统进化树，确定了其毒力强弱和基因型。结果显示，依据核苷酸和推导的氨基酸同源性的不同，15个地方毒株可分为3群，群内各毒株同源性较高，群间差异较大，未发现有因分离禽品种不同所引起的明显的株间差异。其中第1群9株，涉及到各时间段分离的毒株和所有分离禽品种，属典型的基因Ⅶ型强毒株，高度集中于进化树的基因Ⅶ型C亚型区；第2群4株，属传统的基因Ⅵ型强毒株。分散于进化树的基因Ⅵ型区；第3群2株，属古典基因Ⅱ型的弱毒株，分散于进化树的基因Ⅱ型区。结果表明，近年来该地区流行的新城疫病毒以新的基因Ⅶ型为主，同时兼有传统的基因Ⅵ型和古老的基因Ⅱ型；并提示基因Ⅶ型各毒株在该地区流行的时间较短，株间差异不大。     

新城疫病毒分子生物学及其疫苗的研究进展

新城疫是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一,特别是对养鸡业造成重大经济损失。利用分子生物技术已研究出了很多基因工程疫苗用于预防鸡新城疫,比如基因工程活载体疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗等。近年来随着反向遗传操作技术的发展,新城疫病毒已经被开发成病毒载体,可以携带外源基因研制新城疫病毒活载体疫苗,表达IBDV和IBV的新城疫活载体疫苗已经成功研制。本文将从新城疫病毒的分子生物学及疫苗方面进行综述。     

新城疫病毒西藏分离株HN基因克隆与序列分析

为确定西藏新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)分离株HN基因结构特征及其与已知毒株的遗传相关性,本试验应用RT-PCR技术对西藏NDV分离株HN基因进行扩增,然后克隆至pMD18-T载体测序,并与国内外代表性毒株和当前疫苗株进行比对及系统发育分析。结果表明,NDV分离株HN基因片段长度为1734 bp, 编码577个氨基酸;推导的氨基酸序列均有5个糖基化位点, XZ10和XZ17有12个半胱氨酸残基,XZ20只有11个半胱氨酸残基。NDV西藏分离株HN基因与国内代表性毒株核苷酸同源性在81.1%~93.0%之间,氨基酸同源性在81.1%~93.6%之间;与疫苗株核苷酸同源性在87.8%~98.7%之间,氨基酸同源性在88.0%~98.9%之间。系统进化分析结果表明,NDV西藏分离株HN基因均属于Ⅱ型。     

传染性支气管炎病毒中国和东南亚分离株的分子流行病学

对24个鸡传染性支气管炎病毒中国和东南亚分离株的S1基因5′端(含HVRⅠ和HVRⅡ)和N基因3′端进行了扩增和序列分析，通过与公开的其他毒株序列问的比较和分析，对分离毒株的分子流行病学进行了研究。结果表明，24个分离毒株分属于美洲、亚洲和欧洲3个基因群。其中一些毒株形成一相对独立的亚洲基因群，提示IBV在亚洲已存在相当长时间；另一些毒株则可能来源于欧洲和美洲或来源于不同毒株(包括疫苗株)基因间的重组。