碘化N-正丁基氟哌啶醇对血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞肥大的抑制作用

目的探讨碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)对血管紧张素Ⅱ(AngII)诱导心肌细胞肥大的抑制作用及其机制。方法培养大鼠心肌细胞株(H9C2细胞),测量细胞表面积和BCA法测定细胞蛋白含量作为心肌肥大指标;Western blot检测核转录因子ERK1/2及CREB蛋白表达。结果 (1)AngII(10-7mol.L-1)处理细胞48 h,心肌细胞表面积增大,蛋白含量明显增加,F2(10-8、10-7、10-6mol.L-1)剂量依赖抑制AngII介导心肌细胞表面积的增大以及蛋白含量的增加;(2)AngII(10-7mol.L-1)处理心肌细胞1 min,磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)和磷酸化CREB蛋白(p-CREB)表达即开始增加,5～10 min达最高峰,可持续活化60 min,ERK1/2和CREB蛋白总量没有变化。以AngII处理心肌细胞5 min,p-ERK1/2和p-CREB表达为标准,预先以F2(10-8、10-7、10-6mol.L-1)处理心肌细胞30 min,F2剂量依赖抑制AngII介导心肌细胞p-ERK1/2和p-CREB表达的增高。结论 F2可以抑制AngII诱导的心肌肥大,其机制可能与抑制磷酸化ERK1/2和CREB表达有关。     

丹参酮ⅡA磺酸钠对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大反应中磷酸化细胞外信号调节激酶1/2的作用

目的从细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)激活角度研究丹参酮ⅡA磺酸钠(sodium tanshinoneⅡ Asulfonate,STS)对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的心肌肥大反应中的作用。方法培养新生大鼠心肌细胞,考马斯亮蓝法测定心肌细胞蛋白含量、[3H]-亮氨酸参入法测定蛋白合成速率作为心肌肥大指标;用免疫荧光标记法和Western blot测定磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)表达。结果(1)AngⅡ(1μmol·L-1)处理24h,心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率、蛋白含量明显增加,STS能明显抑制AngⅡ介导心肌细胞[3H]-亮氨酸参入率、蛋白含量的增加;(2)AngⅡ刺激心肌细胞可见胞核内出现磷酸化ERK1/2荧光染色,丹参酮ⅡA可阻断AngⅡ引起的ERK1/2活化、入核过程;(3)用AngⅡ(1μmol·L-1)处理心肌细胞5min,磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)表达即开始增加,10min左右时最明显。以AngⅡ(1μmol·L-1)处理心肌细胞10min,磷酸化ERK1/2蛋白(p-ERK1/2)表达为标准,预先以STS(2,10,50μmol·L-1)处理心肌细胞30min,发现STS可明显抑制AngⅡ诱导的心肌细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达;(4)预先以不同浓度STS处理心肌细胞30min,发现STS对AngⅡ诱导的心肌细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达的抑制作用存在剂量依赖性。结论STS可以抑制AngⅡ诱导的心肌肥厚,其机制与抑制磷酸化ERK1/2表达有关。     

吗啡对μ阿片受体介导的ERK磷酸化的影响

目的：利用表达μ阿片受体的中国仓鼠卵巢细胞,研究吗啡急慢性处理下对细胞外信号调节激酶（ ERK）磷酸化的影响。方法免疫印迹检测磷酸化ERK水平,获取1 h急性处理的ERK磷酸化变化时程和36 h慢性处理以及纳洛酮催促下的ERK磷酸化变化。结果1μmol·L-1吗啡可以快速诱导ERK磷酸化水平短暂升高,5 min时达峰（ P〈0.01）,吗啡诱导的ERK磷酸化水平升高具有显著的浓度依赖性。10μmol·L-1吗啡慢性处理36 h后ERK磷酸化水平与对照组比较,差异无统计学意义,但纳洛酮急性催促5或10 min均导致ERK磷酸化显著下降（与对照比较,P〈0.01）。结论吗啡急慢性刺激下以及纳洛酮催促下ERK磷酸化表现出不同的变化形式,提示μ阿片受体介导下ERK相关的信号通路发生了代偿。     

活性氧激活的ERK1/2通路在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用

目的探讨胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在化学性缺氧损伤PC12细胞中的作用。方法应用化学性低氧模拟剂氯化钴(CoCl2)处理PC12细胞建立化学性缺氧损伤模型。应用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)比色法检测细胞存活率;罗丹明123(Rh123)染色荧光显微镜照像检测线粒体膜电位(MMP);流式细胞术检测凋亡细胞百分比;Western blot法测定caspase-3、ERK1/2和p38MAPK蛋白的表达水平。结果应用600μmol.L-1处理PC12细胞60 min可使磷酸化(p)ERK1/2的表达明显升高;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用500μmol.L-1N-乙酰半胱氨酸(NAC,为活性氧的清除剂)预处理1 h可抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用;在600μmol.L-1CoCl2处理PC12细胞前,应用10μmol.L-1U0126(ERK1/2抑制剂)预处理2 h可保护PC12细胞对抗CoCl2引起的损伤,使细胞存活率升高,凋亡细胞数目和cleaved caspase-3表达及线粒体膜电位(MMP)丢失均减少;10μmol.L-1U0126预处理还能抑制CoCl2对p-p38MAPK表达的上调作用。此外,应用20μmol.L-1SB203580(p38MAPK抑制剂)预处理能抑制CoCl2对p-ERK1/2表达的上调作用。结论活性氧激活的ERK1/2通路介导CoCl2对PC12细胞的损伤作用,并与p38MAPK通路存在相互的的激活作用。     

RISK信号通路在β_2-肾上腺素受体激动剂Clenbuterol减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

目的研究β2-肾上腺素受体激动剂clenbuterol对原代培养的心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用及其是否与激活再灌注损伤挽救激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)信号通路有关。方法将原代培养的新生Wistar大鼠乳鼠心肌细胞分为8组,1正常培养组;2缺氧/复氧(A/R)组;3clenbuterol(1μmol·L-1)+A/R;4ICI118,551(10μmol·L-1)+clenbuterol(1μmol·L-1)+A/R组;5美托洛尔metoprolol(10μmol·L-1)+clenbuterol(1μmol·L-1)+A/R组;6 metoprolol(10μmol·L-1)+A/R组;7 PD98059(20μmol·L-1)+clenbuterol(1μmol·L-1)+A/R组;8LY294002(10μmol·L-1)+clenbuterol(1μmol·L-1)+A/R组。采用MTT法测定各组细胞存活率;比色法检测心肌细胞培养液的乳酸脱氢酶(LDH)含量;Hoechst 33342荧光染色法检测细胞凋亡率;分子探针DCFH-DA检测细胞内活性氧的水平;Western blot检测心肌细胞缺氧/复氧后ERK及p-ERK1/2蛋白的表达水平。结果与A/R组比较,clenbuterol+A/R组明显增高细胞存活率,降低LDH含量,降低细胞凋亡率,ROS产生减少,p-ERK1/2蛋白表达水平增高,而选择性β2受体阻断剂ICI 118,551可取消clenbuterol的上述作用,β1受体阻断剂Metoprolol对clenbuterol的作用无影响,PI3K抑制剂LY294002和ERK1/2抑制剂PD98059可阻断clenbuterol对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。结论clenbuterol能够减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,加入选择性β2受体阻断剂ICI 118,551,PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂PD98059均使clenbuterol的保护作用取消,表明clenbuterol可通过激动β2肾上腺素受体,激活RISK信号通路发挥抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用。     

ERK1/2信号通路在角质细胞生长因子-2诱导角膜基质细胞增殖中的作用

目的观察角质细胞生长因子(keratinocyte growthfactor-2,KGF-2)对角膜基质细胞的增殖作用及ERK1/2信号在角膜基质细胞增殖中的调控作用,探讨KGF-2对角膜基质细胞增殖的可能机制。方法体外培养角膜基质细胞,MTT法检测细胞增殖,Western blot检测磷酸化ERK1/2表达水平。结果 KGF-2在1～100 mg·L-1对角膜基质细胞有明显的促进增殖作用且呈现剂量-效应关系;100 mg·L-1 KGF-2处理角膜基质细胞,5、15、30 min后ERK1/2磷酸化表达水平明显升高,60、90、120、180 min后ERK1/2磷酸化表达水平逐渐减弱;20μmol.L-1 ERK1/2抑制剂PD98059可抑制KGF-2对角膜基质细胞的促增殖作用。结论 KGF-2激活ERK1/2信号通路,提高细胞增殖率,可被抑制剂PD98059阻断;ERK1/2信号通路调控角膜基质细胞的增殖,在角膜基质细胞损伤中发挥作用。     

Tenuifoliside A基于ERK通路保护皮质酮损伤C6细胞作用研究

目的探讨远志寡糖酯成分Tenuifoliside A(TFSA)对皮质酮诱导大鼠神经胶质瘤细胞(C6)损伤的保护作用及其分子机制。方法建立以0.8 mmol.L-1的皮质酮作用于C6细胞48h的损伤模型;用皮质酮预处理C6细胞30 min后加入30、10和3μmol.L-1的TFSA,共同作用48 h,CCK试剂盒检测TFSA对皮质酮诱导C6细胞损伤的存活率;荧光显微镜观察C6细胞Hoechst 33258染核后凋亡形态变化;Western blot检测C6细胞内ERK及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达;Caspase检测试剂盒检测C6细胞内Caspase激酶活力的变化。结果与正常对照组比,0.8 mmol.L-1的皮质酮对C6细胞有明显的损伤作用,其细胞存活率降低至69.58%(与正常组相比,P<0.01);细胞核形态改变,出现凋亡小体;胞内ERK蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显降低(与正常组相比,P<0.01),Caspase-3激酶的活力增加(P<0.01)。与模型组相比,各剂量组的TFSA均有不同程度对抗皮质酮损伤的作用,细胞存活率明显提高至84.48%(与模型组相比,P<0.01),同时细胞核形态有明显改善;细胞内的ERK蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2表达量明显增加(P<0.01);Caspase-3激酶活力明显降低。结论 TFSA对皮质酮诱导损伤的C6细胞具有保护作用,其机制可能与TFSA能激活C6细胞内ERK通路,提高抗凋亡蛋白Bcl-2表达,降低Caspase-3激酶活性有关。     

川芎嗪抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用

目的探讨川芎嗪对大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMCs)增殖的影响。方法采用酶消化法和改良组织块法培养原代大鼠气道平滑肌细胞。MTT法检测血小板源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)与川芎嗪共同处理的大鼠ASMCsA490的吸光度值,以观察川芎嗪对PDGF诱导的细胞增殖的抑制作用。Western blot检测ERK1/2及p-ERK1/2蛋白表达水平。结果 MTT法检测,与各对照组比较,给予12.5、25、50、100和200μmol.L-1浓度川芎嗪处理6、12、24、36和48h后,各浓度组川芎嗪处理的细胞平均抑制率均增加,P<0.05,其中以200μmol.L-1在48h时效果最明显,P<0.01。川芎嗪(200μmol.L-1)与PDGF(20pg·L-1)共同处理30min和60min后,p-ERK1/2蛋白表达水平均明显降低。结论川芎嗪对增殖的ASMCs有抑制作用,可能与抑制ERK1/2的信号通路活化有关。     

缓激肽诱导胶质瘤细胞内cAMP反应元件结合蛋白磷酸化的实验研究

目的观察缓激肽作用下,大鼠C6胶质瘤细胞中转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element bind-ing protein,CREB)磷酸化的动态变化,并探讨其可能的意义。方法应用免疫细胞化学和Western blot方法,观察1μmol.L-1缓激肽作用C6胶质瘤细胞在不同时相点(0,5,10,15,20,30min)CREB磷酸化的动态变化。结果1μmol.L-1缓激肽作用C6胶质瘤细胞的5到30min的各时相点均能检测到CREB的磷酸化(P<0.01),其中以15min的磷酸化最强(P<0.01)。结论缓激肽可促进大鼠C6胶质瘤细胞中转录因子CREB的磷酸化,此作用可能与其促进血肿瘤屏障的选择性开放有关。     

新藤黄酸诱导人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡以及对p-p38和p-ERK1/2蛋白的影响

目的探讨新藤黄酸对人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡的作用以及对磷酸化p38、p-ERK1/2蛋白的影响。方法倒置显微镜观察新藤黄酸不同时间和不同浓度处理CNE-1细胞形态变化;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度新藤黄酸(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0和8.0μmol.L-1)处理24 h、48 h和72 h对人鼻咽癌细胞CNE-1增殖的抑制作用;新藤黄酸作用CNE-1细胞24 h后的IC50为2.34μmol.L-1,再结合倒置显微镜观察的结果故选用2.0μmol.L-1作为药物作用浓度。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,并应用透射电子显微镜检测细胞凋亡形态改变及线粒体损伤;Western blot检测p-p38、p38、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白和线粒体凋亡相关蛋白Cytochrome C和Caspase-3蛋白的表达。结果新藤黄酸对人鼻咽癌细胞CNE-1生长和增殖有抑制作用,并随着新藤黄酸浓度的增加或作用时间的延长细胞活力明显下降。通过电镜可见2.0μmol.L-1新藤黄酸作用CNE-1细胞后细胞体积皱缩变圆,细胞核发生典型核染色质固缩等细胞凋亡形态学的变化;与control组相比包括对线粒体的损伤。Western blot表明p-p38蛋白表达有所上调,特别是在短时间(120 min)内,p-ERK1/2蛋白表达呈现时间依赖性下降;而p38和ERK1/2表达则基本不变。Cytochrome C和Caspase-3蛋白表达也呈现时间依赖性增加。结论新藤黄酸能诱导人鼻咽癌细胞CNE-1凋亡,增强Cytochrome C和Caspase-3蛋白表达,同时对p-p38和p-ERK1/2蛋白也有影响。     

基于CREB通路研究3,6’-二芥子酰基蔗糖的神经保护分子机制

目的 3,6’-二芥子酰基蔗糖(DISS)是远志中的寡糖酯类成分,通过研究DISS对人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的增殖作用和对环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)通路的影响,探究其发挥神经保护作用的分子机制。方法采用四甲基噻唑蓝(MTT)法测定SH-SY5Y细胞生长曲线,筛选最佳种板密度和给药时间,并检测不同浓度DISS对细胞增殖的影响;采用Western blotting法检测细胞给予DISS后不同时间点CREB、磷酸化CREB(p-CREB)和脑源性神经生长因子(BDNF)的表达水平;给予调节CREB活性的相关上游通路拮抗剂U0126(MEK拮抗剂)、H89(PKA拮抗剂)、KN93(CaMK拮抗剂)拮抗CREB上游通路,并给予DISS保护,用Western blotting法检测DISS对拮抗前后细胞内CREB,p-CREB,BDNF蛋白表达的影响。结果 SH-SY5Y最佳中板密度为2×108L-1,DISS(60μmol·L-1,30μmol·L-1)对SH-SY5Y细胞具有明显的促增殖作用(P<0.05);与正常细胞相比,DISS给药15 min时可显著增加细胞内p-CREB,BDNF的表达(P<0.05);DISS可明显增加拮抗后SH-SY5Y细胞内CREB,p-CREB,BDNF的表达水平(P<0.05)。结论 DISS可以调节CREB活性并促进下游BDNF等相关因子的表达,其神经保护作用的机制可能与活化Ca2+/CaM/CaMK-CREB-BDNF信号通路有关。     

ERK1/2在胶质瘤中的表达及意义

目的 探讨细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在人脑胶质瘤中的表达及其与胶质瘤的发生发展的关系.方法 收集具有明确病理分级的胶质瘤标本48例,WHO I～Ⅱ级15例,Ⅲ级21例,Ⅳ级12例;另取8例正常脑组织作正常对照.用免疫组织化学染色检测ERK1/2和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)表达水平.结果 在胶质瘤组织中,ERK1/2和p-ERK1/2表达均增高,且与胶质瘤恶性程度呈正相关;在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中,ERK1/2和p-ERK1/2表达水平显著强于I、Ⅱ级胶质瘤.结论 ERK1/2在胶质瘤组织中表达水平与胶质瘤的恶性程度有关.     

甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用

观察甘松新酮对缺糖缺氧损伤原代培养神经元的保护作用。采用孕14天小鼠胚胎皮层制备原代培养神经元;MTT法确定甘松新酮对原代培养神经细胞的安全剂量,并观察其对缺糖缺氧神经元的保护作用;采用Western blotting法观察药物对缺糖缺氧损伤神经元以及正常培养神经元蛋白激酶A(PKA)和细胞外信号调节激酶(ERK)通路关键蛋白表达的影响。结果显示,甘松新酮(50和100μmol·L-1)能够增加缺糖缺氧损伤神经元的存活率(P<0.01,与OGD组比较);同时,能增加缺糖缺氧神经元PKA、小分子G蛋白Ras的相关蛋白1(Rap1)、丝裂原激活的蛋白激酶的激酶1(MEK1)及磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)的表达,且此作用呈剂量依赖趋势。对正常培养神经元研究结果显示,甘松新酮(50、100和200μmol·L-1)也能增加其PKA、Rap1、MEK1及p-ERK1/2的表达(P<0.01)。以上结果表明,甘松新酮对缺糖缺氧损伤的原代培养神经元有明确保护作用,该作用可能与药物激活PKA和ERK通路有关。     

ERK1/2信号通路介导丙泊酚对H_2O_2诱发的心肌细胞损伤保护作用

目的研究丙泊酚对H2O2诱发的心肌细胞损伤的保护作用及其作用机制。方法采用胰酶消化法获取大鼠胎鼠心肌细胞,以H2O2损伤心肌细胞获得心肌缺血再灌注损伤实验模型;加入不同浓度丙泊酚(12.5、25、50μmol·L-1),MTT法检测细胞存活率;用硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法分别测定各组细胞培养液中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;流式细胞术检测细胞凋亡水平;Western blotting检测细胞中ERK1/2、Bcl-2及Bax的表达。结果丙泊酚(12.5、25、50μmol·L-1)能抑制由H2O2导致的细胞死亡(P<0.01);减少MDA的产生(P<0.01),提高SOD活性(P<0.01);25、50μmol·L-1丙泊酚能抑制由H2O2导致的细胞凋亡(P<0.05);25μmol·L-1丙泊酚作用于细胞后能激活ERK1/2磷酸化,增加Bcl-2且减少Bax的表达。结论丙泊酚通过激活ERK1/2磷酸化对H2O2诱发的心肌细胞损伤起到保护作用。     

雌激素受体α在六氟双酚A诱导细胞外调节蛋白激酶激活中的作用研究

目的研究六氟双酚A(bisphenol AF,BPAF)诱导T47D乳腺癌细胞中细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)激活的分子机制,探讨雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)在BPAF诱导ERK激活过程中的作用。方法通过蛋白免疫印迹实验(Western Blot)检测ERK磷酸化水平,研究BPAF对ERK磷酸化的诱导作用。运用表达ERαshRNA的慢病毒感染细胞,下调表达ERα,研究ERα在BPAF激活ERK过程中的作用。结果Western Blot结果显示,BPAF在浓度为50 nmol/L时即可诱导ERK磷酸化水平显著升高(P0.05),并且随着剂量的升高呈现出剂量-效应关系。当BPAF浓度达到1μmol/L时ERK磷酸化水平达到最高(P0.05)。BPAF诱导ERK激活时间效应实验中,BPAF处理细胞5~60 min时,ERK磷酸化水平均显著升高(P0.05),在BPAF处理细胞15 min时,ERK磷酸化水平达到最高。在运用表达ERαshRNA的慢病毒感染细胞后,ERα的表达水平显著降低(P0.05)。与正常细胞相比,在下调表达ERα的细胞中,BPAF对ERK磷酸化的诱导作用显著降低(P0.05)。结论 BPAF能够诱导ERK磷酸化,并且呈现剂量-效应关系。ERα在BPAF诱导的ERK激活过程中起到重要作用。     

羟基红花黄色素A对氧化低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的探讨羟基红花黄色素A(HSYA)抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和丝裂原活化蛋白激酶磷酯酶-1(MKP-1)基因转录及蛋白表达之间的关系。方法 HSYA 10μmol.L-1和ox-LDL 35 mg.L-1与VSMC共培育48 h,MTT检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞周期,逆转录PCR(RT-PCR)观察ERK1/2和MKP-1基因表达,Western印迹法观察ERK1/2和MKP-1蛋白表达。结果与ox-LDL 35 mg.L-1模型组比较,加入HSYA 10μmol.L-1组细胞存活率明显下降,G0/G1期细胞明显增多,ERK1 mRNA表达下降了42.2%(P<0.01),MKP-1 mRNA显著增加了86.9%(P<0.01),p-ERK1/2蛋白表达降低了39.9%(P<0.01),MKP-1蛋白表达增加了80.6%(P<0.01);加入PD98059 10μmol.L-1组,细胞存活率明显降低了58.3%(P<0.01),G0/G1期细胞明显增多(P<0.01),ERK1 mRNA表达下降了45.9%(P<0.01);p-ERK1/2蛋白表达下降了45.9%(P<0.01);PD98059 10μmol.L-1+HSYA 10μmol.L-1同时加入,细胞生存率下降了61.9%(P<0.01),G0/G1期细胞明显增多(P<0.01),ERK1 mRNA表达进一步减少(P<0.01),MKP-1 mRNA增加了110%(P<0.01),p-ERK1/2蛋白表达下降了51.2%(P<0.01),MKP-1蛋白表达增加了62.4%(P<0.01)。结论 HSYA通过增强MKP-1蛋白表达、降低p-ERK1/2蛋白活性和抑制细胞周期运转的机制抑制VSMC增殖。     

柚皮素对Aβ25-35损伤PC12细胞丝裂原激活蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶通路的调控效应研究

目的探讨柚皮素对体外培养的Aβ_25-35损伤PC12细胞的保护作用及相关信号通路的调控机制。方法将生长至对数期的PC12细胞接种于培养瓶培养24 h,弃掉旧培养液后,随机分为空白组(培养液)、模型组(150μmol·L-1 Aβ_25-35)、实验组-1(4×10-1 μmol·L-1柚皮素+150μmol·L-1 Aβ_25-35)和实验组-2(10μmol·L-1 U0126+4×10-1 μmol·L-1柚皮素+150μmol·L-1 Aβ_25-35),使每组细胞浓度为20μmol·L-1(除空白组),给药24 h后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法检测各组细胞B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸-3(Caspase-3)和磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(p-ERK1/2)的蛋白表达量。结果空白组、模型组、实验组-1、实验组-2的细胞总凋亡率分别为(4.13±0.55)%,(34.70±1.66)%,(11.26±0.77)%,(23.52±0.80)%;Bax蛋白表达量分别是0.24±0.06,0.76±0.03,0.21±0.02,0.68±0.04;Bcl-2蛋白表达量0.61±0.04,0.20±0.04,0.55±0.03,0.34±0.02;Caspase-3蛋白表达量0.13±0.03,0.40±0.03,0.21±0.04,0.31±0.02;p-ERK1/2蛋白表达量0.86±0.03,0.48±0.06,0.78±0.04,0.50±0.07。模型组与空白组、实验组与模型组和实验组-2与实验组-1比较,上述指标差异均有统计学意义(P<0.01)。结论柚皮素可通过丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular-signal regulated protein kinase, ERK)信号通路改变Bax、Caspase-3、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表达量,抑制细胞凋亡,对Aβ_25-35损伤的PC12细胞有保护作用。     

榄香烯阻碍大鼠胶质瘤C6细胞ERK信号通路中Hsp90/Raf-1分子复合体的形成

目的探讨莪术提取物榄香烯抑制胶质瘤细胞体外增殖的机制。方法采用细胞计数、免疫共沉淀、Western印迹等方法,分别检测不同浓度、不同作用时间榄香烯对C6胶质瘤细胞的增殖影响、对C6细胞中与Raf-1结合形成分子复合体的Hsp90水平的影响、对C6细胞Hsp90、Raf-1、ERK蛋白质表达的影响。结果榄香烯对大鼠C6胶质瘤细胞具有明显的抑制增殖作用,该增殖抑制效应呈剂量、时间依赖性。榄香烯可明显下调C6细胞中与Raf-1结合的Hsp90水平及C6细胞的磷酸化Raf-1、ERK表达,但不影响总Hsp90的表达水平。结论榄香烯能有效抑制胶质瘤细胞的体外增殖,破坏Hsp90的分子伴侣功能,阻碍Hsp90/Raf-1复合体的形成,使Raf-1不能被活化,最终下调胶质瘤细胞赖以生存的Raf/MEK/ERK通路,这可能是榄香烯抑制C6细胞增殖的机制。     

代森锰锌对PC-12细胞凋亡的影响

目的探讨代森锰锌对PC-12细胞凋亡的影响及其机制。方法 采用体外细胞培养方法,PC-12细胞加入代森锰锌0,1,10,30,60和120μmol.L-1,培养24h后,应用WST-8法检测PC-12细胞增殖;PC-12细胞中加入代森锰锌0,1,30和120μmol.L-1,培养24h后,流式细胞术FITC-AnnexinⅤ/PI双染检测细胞凋亡率;Hoechst33258染色及倒置荧光显微镜观察细胞形态学改变;Western印迹法检测Bcl-2和Bax的表达以及ERK蛋白磷酸化水平。结果与正常对照组相比,随着代森锰锌浓度增加,代森锰锌组晚期凋亡率升高,呈浓度依赖关系,IC50为49.95μmol.L-1。代森锰锌120μmol.L-1组细胞晚期凋亡率为(90±4)%(P<0.05);Hoechst33258染色可见细胞核膨大、染色质边集浓染等凋亡特征;与正常对照组相比,Bcl-2逐渐降低,Bax和p-ERK1/2表达增高(P<0.05),代森锰锌120μmol.L-1组p-ERK1/2积分吸光度分别为128.0±2.5和178.4±4.0。结论代森锰锌能够诱导PC-12细胞凋亡,ERK信号通路可能在此过程中发挥作用。     

三丁基锡对人羊膜细胞ERK通路和G2/M期调控蛋白的影响北大核心CSCD

目的研究三丁基锡(Tributyltin,TBT)对正常人羊膜FL细胞ERK通路及周期相关蛋白的影响。方法 FL细胞分别以剂量1、2、3、4和6μmol/L TBT染毒,免疫印迹法检测ERK通路和周期蛋白表达及磷酸化水平的变化。结果 TBT下调Raf表达,促使下游激酶MEK1/2,ERK1/2以及转录因子c-Myc脱磷酸后失活,抑制ERK通路;同时细胞周期磷酸酶Cdc25C表达下调,激酶Cdc2 Tyr-15位点磷酸化水平升高。结论 ERK通路的抑制可能是TBT发挥细胞毒性作用的重要因素,其机制主要是通过调控Cdc25C,致使G2/M关键激酶Cdc2活性下调,细胞发生G2/M期阻滞,最终诱导凋亡。