不同冷冻剂对鸡胚PGCs的保护效应

发育至第19期和第28期的鸡胚性腺原始生殖细胞（PGCs）分离提纯后，在DMEM中添加冷冻保护剂DMSO（二甲基亚砜）、EG（乙二醇）、蔗糖进行超低温冷冻保存，比较冷冻保护剂在单独或联合使用条件下对PGCs的冷冻保护效果，复苏后台盼蓝染色测定细胞存活率，体外接种培养、传代。结果表明：（1）第19期PGCs冷冻保存中，10％EG＋10％FBS＋0．1mol／L。蔗糖条件下细胞存活率最高为（92．20±2．18）％，且与10％DMSO＋10％FBS的存活率差异显著（P〈0．05），其余各冷冻保护液间存活率差异不显著；第28期PGCs冷冻保存中，5％DMsO＋5％EG＋10％FBS＋0．1mol／L。蔗糖条件下细胞存活率最高为（92．41±2．82）％，但各冷冻保护液间存活率差异均不显著（P〉0．05）。（2）解冻后体外培养的PGCs，在饲养层和3种细胞因子（I。IF、SCF、bFGF）的共同作用下，可持续增殖，传至第3代的PGCs，PAS染色、AKP染色均呈阳性并保持完整的二倍体核型，仍处于未分化状态。     

鸡胚原始生殖细胞(PGCs)玻璃化冷冻的研究

对发育至第19期和第28期鸡胚性腺原始生殖细胞（Primordial germ cells，PGCs），用6种玻璃化冷冻液1：10％DMS0＋10％EG＋10％PVP，Ⅱ：20％EG＋10％PVP，Ⅲ：20％DMSO＋10％PVP，Ⅳ：10％DMSO＋10％EG＋0．5mol／L Surcose，Ⅴ：20％EG＋0．5mol／LSurcose，Ⅵ：20％DMSO＋0．5mol／L Surcose进行冷冻保存。结果：第19期鸡胚PGCs玻璃化冷冻复苏后存活率，在冷冻液Ⅱ与Ⅳ之间差异不显著（P〉0．05），Ⅴ与Ⅵ之间差异显著（P〈0．05），其余各冷冻液之间差异均极显著（P〈0．01）。第28期鸡胚PGCs玻璃化冷冻复苏后存活率，在冷冻液Ⅳ与Ⅴ之间差异显著（P〈0．05），Ⅲ与Ⅳ、Ⅴ之间差异不显著（P〉0．05），Ⅱ与Ⅲ、Ⅳ之间差异不显著（P〉0．05），其余各玻璃化冷冻液之间差异均极显著（P〈0．01）。复苏后接种培养传至第2代的鸡胚PGCs细胞，PAS染色、AKP染色呈阳性并保持完整的二倍体核型。     

不同胚期分离的鸡原始生殖细胞(PGCs)遗传与培养特性比较

根据家禽原始生殖细胞(PGCs)的迁移路径,分别从孵化24h的鸡胚生殖新月(gcPGC)、2.5d的胚血(cPGC)和5.5d的生殖腺(gPGC)中分离PGCs,置于完全培养基中培养,表达干细胞标志物SSEA-1和生殖细胞特异标志物DAZL免疫荧光染色鉴定结果,表明纯化的细胞为PGCs。CCK-8法细胞增殖检测显示,BRL-3A饲养层细胞能明显促进PGCs的体外增殖,与无饲养层条件培养的PGCs间有显著性差异(P<0.05),但不同来源PGCs间无增殖速度的差异。检测这3种不同来源PGCs的集落形成能力,结果显示cPGCs的集落形成率最高,集落体积最大。real time-PCR结果显示多能性相关基因nanogv和pouV在gcPGCs中的表达量最高,而生殖相关基因dazl和cvh在cPGCs中的表达量最高。结果表明,体外培养的PGCs保持其体内遗传状况,即gcPGC的多能性最好,cPGC开始进入生殖系分化,而gPGC可能已部分进入减数分裂。而从培养特性上来看,gcPGC由于数量过少难以扩大培养,而gPGC混合的分化细胞过多,cPGC是体外培养和增殖分化研究的最佳细胞来源。     

原生殖细胞的研究进展及应用前景

原生殖细胞 (PGCs)是二倍体生物生殖细胞的前体。从PGCs分离出来的EG细胞 ,具有类似于ES细胞的生物学特性 ,PGCs可作为哺乳动物ES细胞分离克隆的一个有效替代途径。本文对PGCs的起源、迁移、增殖及其影响因素的研究进展和应用前景作一综述     

蒙古绵羊原始生殖细胞(PGCs)的分离培养与鉴定

本试验从绵羊胎儿的生殖嵴中分离出原始生殖细胞,经体外培养后进行了初步鉴定。为建立绵羊原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的培养体系,试验对比了不同培养条件对蒙古绵羊PGCs生长的影响,将得到的胚胎生殖细胞(EG细胞)作形态学、酶学和免疫荧光鉴定。结果表明:绵羊EG细胞集落隆起,边缘整齐,呈鸟巢状,细胞排列紧密;AKP染色为弱阳性;免疫荧光检测特异标志物Oct3/4呈弱阳性,SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-61、TRA-1-80呈强阳性。     

鸡胚19期原始生殖细胞慢速冷冻和玻璃化冷冻保存的研究

本研究对发育至第19期的鸡胚性腺原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)分离提纯后，在DMEM中添加冷冻保护剂DMSO（二甲基亚砜）、EG（乙二醇）、蔗糖、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）分别组成6种慢速冷冻保护液和6种玻璃化冷冻保护液，进行超低温冷冻保存。复苏后苔盼蓝染色测定细胞存活率，体外接种培养、传代。结果：①慢速冷冻保存中，PGCs在慢速冷冻液V（10％EG+10% FBS+0.1 mol/L蔗糖）条件下复苏后存活率最高（92.20%），且与慢速冷冻液I（10％ DMSO+10% FBS）存活率之间差异显著（P<0.05）。②玻璃化冷冻保存中，PGCs在玻璃化冷冻液I（10% DMSO+10% EG+20% FBS+10% PVP）条件下复苏后存活率最高（84.15%），且与其余5种玻璃化冷冻液下复苏后存活率之间差异均极显著（P<0.01）。③培养传至第3代的慢速冷冻复苏后PGCs细胞和培养传至第2代的玻璃化冷冻复苏后PGCs细胞，PAS染色、AKP染色呈阳性并保持完整的二倍体核型。     

五指山近交猪胚胎生殖细胞(EG)嵌合体在我国移植产仔

采集25~28日龄的五指山小型猪(WZSP)胚胎原始生殖嵴细胞(PGCs),用于 WZSP生殖细胞(EG)建系培养技术研究。研究发现:以DMEM含15%胎牛血清、0 1 mol/L巯基乙醇等为基础培养液,分别添加生长因子20 ng/mL LIF、40 ng/mL hSCF、20 ng/mL hbFGF,以STO为饲养层,进行 EG培养建系,WZSP 3 d 可出现克隆,其克隆具有出现早,生长数量多,增殖快,成熟亦早,传代率高的特点。培养 7~10 d需传代或冷冻保存。EG类细胞冷冻、解冻后尚可复苏,并传至11代。若基础培养液不添加生长因子,培养 6~10 d后亦可出现 EG克隆细胞株,但其克隆具有出现晚、数量少、增殖慢等特点。研究中还发现25~26日龄的WZSP胚胎的原始生殖嵴小、不易观察、PGCs分离较困难; 27 ~ 28 日龄的 WZSP 胚胎的原始生殖嵴体积大、易观察、便于分离并可获得多量的PGCs。同时对PGCs进行了形态学、体外分化、AKP染色鉴定等研究。2002 年 9-12 月,在中国农业科学院畜牧研究所五指山猪保种场先后从22头超排处理的大白猪供体中,于配种后(当天为 0 d)5 5~7 d实施手术法获得252枚可用胚。将123枚胚胎显微注射WZSP的EG细胞,每枚注射5~15个细胞,与未注射的 103 枚混合分别移植给9头受体,平均每头受体移植胚胎25 11±5 11枚、含注射 EG细胞胚胎 13 67±3 57 枚,其中 7 头分别     

不同因素对山羊原始生殖嵴细胞体外分离培养与克隆的影响

从本地槐山羊胎儿中,将原始生殖细胞与其生殖嵴周围组织细胞共同分离,经传代培养后获得了具有干细胞特征的山羊胚胎生殖(EG)细胞。结果表明:高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基相比较,低糖DMEM更适宜于山羊EG细胞的分离与克隆;EG细胞在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上生长效果较好,可传4代或5代,而在小鼠成纤维细胞饲养层上EG细胞仅传3代;联合添加白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能显著提高山羊EG细胞分离与克隆的效率;胎龄为30～45d的胎儿原代培养时可获得大量的细胞集落,克隆培养可传至5代,适合做山羊EG细胞的分离培养。     

昆明白小鼠胚胎生殖细胞的分离与培养

以昆明白品系小鼠胎儿生殖嵴为材料，以不同的培养液分离培养胚胎生殖细胞（EG cells），发现小鼠胎儿肝细胞条件培养液的效果好于未添加白血病抑制因子（LIF）的基础培养液，而差于添加了1000IU／mL LIF的基础培养液。同时，试验对比了从不同胎龄胎儿分离培养原始生殖细胞（PGCs）的情况，鉴定了EG细胞的生物学特性；EG细胞经体外培养，可以分化为神经样细胞、上皮样细胞和简单类胚体。     

鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存和体外培养

采用Ficoll密度梯度离心,提取第19期(孵化72h)鸡受精蛋性腺中的原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs),用不同的冷冻保护液对PGCs采用提纯后直接冷冻保存和在培养体系中培养24h后再进行冷冻保存,7d后复苏,用台盼蓝染色检测其存活率,并用PAS染色对冷冻后的PGCs进行特异性鉴定。复苏后的PGCs在培养体系中培养5d后,更换为培养体系继续培养,进行体外分化试验。结果如下分离后直接进行冷冻保存的PGCs复苏后存活率最高为(85.93±1.24)%;复苏后的PGCs在培养体系中培养48h后进行了PAS染色鉴定,结果PGCs呈PAS阳性(细胞核不着色,细胞质呈红色),表明PGCs的染色特性没有因冷冻保存和体外培养而发生改变;复苏后的PGCs在培养体系中培养可形成细胞克隆,当把PGCs更换到培养体系培养5d后,PGCs克隆有的仍保持克隆状态,但体积缩小,克隆中细胞排列紧密,颜色较深,有的克隆由鸟巢状变为不规则形,且在克隆周围形成类神经细胞样细胞。而经体外培养后再进行冷冻保存的PGCs,复苏后存活率最高为(42.26±1.36)%。     

猪原始生殖嵴细胞(PGCs)建系因素的研究

从五指山猪(WSZP)近交系第8～13代培育群中，先后选用21头5～10月龄青年母猪，分别于授精后25～30d采集胎儿106个，进行原始生殖嵴(PGCs)细胞分离、培养等建系技术研究。以DMEM F10(1:1)为基础培养液，按添加或不添加生长因子，将培养液分为A、B、C3种，并以STO细胞作饲养层，在38℃、5.0％CO2和湿润的气相中进行培养建系。结果获得胚胎生殖嵴细胞(EG)细胞系6个细胞株，其中1个EG细胞株传至11代、2个传至5代、1个传至4代、2个传至3代冻存。并进行了AKP染色、体外分化、冷冻-解冻复苏和嵌合体制作等鉴定研究。研究发现：不同胚龄对EG细胞建系具有一定影响，不同培养液对EG细胞建系效果不同，STO细胞饲养层的质量是建株、传代、冷冻-解冻复苏的关键因素之一。EG细胞系的初步建立，为今后筛选进入种系的EG细胞系、实施体外基因操作提供了可能。     

鸡胚原始生殖细胞诱导分化为神经元样细胞的研究

原始生殖细胞（Primordial Germ Cells：PGCs）是指能够发育为性细胞的前体细胞,可作为胚胎干细胞（ES）分离与克隆的一种新型材料,其形态、表面标志、体内外分化潜能及体外培养条件均类似于胚胎干细胞.体外培养过程中,在培养液中加入一定的诱导分化剂,PGCs细胞将发生定向分化.长期以来神经系统损伤和神经退行性病变是临床上难以解决的问题,由于原始生殖细胞具有发育全能性,可以在体外通过对其进行定向诱导,得到特定类型的细胞,这将使原始生殖细胞成为今后细胞替代疗法和组织器官移植的来源.本试验采用不同的诱导剂对PGCs进行诱导,以探讨PGCs细胞向神经细胞分化的适宜条件.     

从原始生殖细胞分离和克隆兔的胚胎生殖细胞

研究采用 1 4～ 1 8d兔胎儿的生殖嵴及周围组织与其同源成纤维细胞共培养 ,低糖DMEM +1 0 %NBS +1 0 %FCS +1 0ng/mLLIF +1 0ng/mLSCF+0 1mol/Lβ 巯基乙醇 +1 0 0U/mL青霉素 +80U/mL链霉素作培养基 ,分离出兔原始生殖细胞 (PGC) ,克隆并多次传代。从原始生殖细胞 (PGC)中获得胚胎生殖细胞 (EG)细胞集落 ,1 4d胎儿原代观察到类EG细胞集落 ,传至 4代后丢失。 1 6d胎儿的类EG只传 2代 ,1 8d胎儿没有得到EG细胞集落。EG细胞具有干细胞的诸多特征 ,呈典型的团块状聚集生长 ,碱性磷酸酶 (AKP)染色呈阳性 ,在衰老饲养层的培养基中生长形成类胚体、上皮细胞、神经细胞和成纤维细胞等     

新生牛睾丸生殖细胞体外培养

实验探讨牛雄性生殖干细胞的培养体系,以期为牛精原干细胞多能性的维持和诱导分化成精子的深入研究奠定基础。为此,从新生犊牛睾丸组织中分离纯化牛雄性生殖干细胞,并在LIF和EGF等不同条件下培养,观察新生牛睾丸生殖细胞在体外的生长行为。结果表明:体外培养新生牛睾丸生殖细胞能得到包括EG细胞集落在内的多种细胞集落,LIF,EGF促进EG细胞集落形成。EG细胞集落接种于无分化抑制剂的环境下培养,3 d后细胞开始分化,1周后分化为多种细胞。     

山羊PGCs用于分离与克隆类ES细胞

选择健康成年本地白山羊，自然发情，配种后44d取胎儿，以传统的原始生殖细胞（PGCs)分离与克隆的方法和PGCs与其胎儿生殖嵴周围组织细胞共同培养的方法获得类胚胎干细胞（类ES细胞），并对山羊类ES细胞在不同饲养层上进行培养。结果表明，采用传统方法与共培养的方法并添加细胞因子均能分离获得类ES细胞。分离获得的类ES细胞在同源（山羊）胎儿细胞饲养层上生长效果较好，可传4代或5代，而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上类ES细胞仅传3代。另外，共培养不添加细胞因子组仅获1个ES细胞集落，传代后丢失。     

原生殖细胞生成的干细胞可形成生殖嵌合体Colin L.Stewart等

胚胎干细胞(ES)做为将目的基因导入生殖腺的新途径而引起了人们的极大兴趣,ES细胞也为哺乳动物发育的生化和分子基础提供了丰富的材料,现今所有ES细胞均来自囊胚内细胞团。从恶性畸胚瘤和性腺瘤细胞分离的胚胎瘤细胞(EC)只有极少数能形成生殖腺嵌合体。原生殖细胞(PGC)在合适的培养条件下,形成的多能细胞称EG细胞。EG细胞具有和ES及EC细胞相似的形态和发育特征,在体外分化广泛,但不清楚它们在体内能否形成体细胞系,是否具有发育的全能性和能否形成有功能的配子。     

鸡胚胎原始生殖细胞的体外培养

旨在对影响鸡胚胎原始生殖细胞（PGCs）体外培养、传代过程的各种影响因素进行探讨。将分离到的19期鸡胚胎生殖腺的PGCs在以鸡胚成纤维细胞（CEF）为饲养层，添加细胞因子的培养体系中进行培养、传代。经冷冻保存的PGCs在添加细胞因子的培养体系中能增殖，并具有分化能力。从细胞形态、集落形态、增殖生长能力、核型检测、碱性磷酸酶测定等方面对培养过程中的鸡胚胎PGCs进行检测。结果表明，采用传至3代的CEF为饲养层，多次离散法进行传代所获得的5代鸡胚胎PGCs不但能有效维持PGCs的未分化状态和正常二倍体核型，也具有其作为多能性胚胎干细胞的一系列特征。     

哺乳动物PGCs用于多能性干细胞培养的研究进展

综述了哺乳动物原始生殖细胞（PGCs)研究进展；归纳了PGCs用于多能干细胞培养的影响因素，阐述了PGCs用于干细胞培养研究中存在的问题及其前景。     

不同时期鸡胚原始生殖细胞的分离及存活时间的研究

采用Ficoll密度梯度离心，提取第14期(孵化53h)血液、第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)性腺中的PGCs．以比较这3个时期的PGCs在相同的体外培养条件下存活时间的差别。培养基为TCM-199，添加10％的小牛血清，不添加其他的细胞因子，培养后采用台盼蓝染色，以比较其在这种培养液中存活时间的差别。结果发现，第14期提取的PGCs存活时间最短，第19期的最长，第28期的介于两者之间。     

水牛原生殖细胞核移植的研究

以水牛原生殖细胞（PGCs）为核供体,成熟水牛卵母细胞为受体,采用电融合法和胞质内直接注核法对水牛PGCs的核移植进行了研究。从水牛胎儿的生殖嵴或生殖腺分离得到PGCs,在胎儿成纤维细胞饲养层上传代培养后,进行核移植。结果显示,当采用电融合法时,PGCs核移植的融合率、分裂率、囊胚率和总囊胚率均显著高于胎儿成纤维细胞（P〈0．05）;当采用直接注核法进行核移植时,PGCs的核移植囊胚率显著高于胎儿成纤维细胞（P〈0．05）。但分裂率差异不显著（P〉0．05）。结果表明,水牛PGCs细胞是理想的核移植供体细胞。