苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白结构和功能研究进展

对目前解析的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的三维结构进行了比较分析。它们都有类似的结构,有三个结构域,结构域Ⅰ是由7个α螺旋以α5螺旋为中心形成的α螺旋束;结构域Ⅱ是由三个反平行β折叠形成的β棱柱;结构域Ⅲ是一个β"三明治"结构。对这三个结构域的Loop及氨基酸残基与杀虫活性的关系、与通道形成相关的杀虫作用机制的研究进展进行了综述。     

米曲霉磷酸果糖激酶基因克隆及序列分析

磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的重要调控酶。以酿酒米曲霉CICC2012为材料,克隆获得PFK基因pfkA(GenBank登录号:KC113503.1)。序列分析表明:pfkA序列长度为2 722bp,含有2个内含子,开放阅读框长2 358bp;PFK为785个氨基酸组成的亲水蛋白,分子量86.0kDa,等电点6.38,含有2个PFK家族指纹结构;二级结构包含42.68%的α-螺旋,14.27%的β-折叠和43.06%的无规则卷曲;同源建模三级结构PFK含有N端和C端的2个结构域,底物果糖-6-磷酸结合于N端结构域。采用进化树分析,发现米曲霉PFK与丝状真菌PFK亲缘性较近。     

麻风树油质蛋白JcOle16.6基因克隆及序列分析

分离克隆麻风树油质蛋白基因家族成员Jc Ole16.6基因的DNA序列(Gen Bank序列号为JX073622.1)。Jc Ole16.6基因全长601 bp,没有内含子,转录的Jc Ole16.6 mRNA具有468 bp的完整开放阅读框,编码含155个氨基酸残基、分子量为16.6 ku、等电点为9.99的Jc Ole16.6蛋白(Gen Bank序列号为AFP19884),属于植物油体结合蛋白油质蛋白家族的新成员。Jc Ole16.6属于稳定的两性蛋白质,具有3个结构域,即N端约30个氨基酸残基组成的含1个α-螺旋的亲水性结构域,肽链中间约78个氨基酸残基组成的含3个α-螺旋的高度疏水性跨膜结构域,C端约47个氨基酸组成的含1个α-螺旋的两亲性结构域。N端亲水性结构域和C端两亲性结构域分布于油体朝向胞浆一面,中间疏水跨膜结构域分布于油体半单位膜内,存在于中间疏水跨膜结构域中的由3个脯氨酸和1个丝氨酸组成的Pro-Knot高度保守结构域在Jc Ole16.6蛋白与油体半单位膜准确定位和稳定维持油体结构方面起着重要作用。研究结果为Jc Ole16.6基因表达调控和生理功能等研究奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒P基因的克隆及其结构与功能分析

 【目的】对小反刍兽疫病毒P基因进行克隆,并对其结构和功能的关系进行分析,为研究小反刍兽疫病毒P蛋白的功能及其在病毒增殖过程中的作用奠定基础。【方法】利用RT-PCR的方法对小反刍兽疫P基因全长进行克隆,通过生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对,利用I-TASSER进行三级结构预测,然后分析其结构和功能之间的关系。【结果】P基因和MV、CDV、RPV、DMV和PDV的P基因的相似性分别为62.9%、63.3%、64.4%、65.1%和60.4%,氨基酸的相似性分别为45.9%、46.2%、50.6%、50.3%和47.0%。三级结构表明该蛋白由3个结构域构成,中间是由多个α-螺旋构成的结构域,主要行使与L大蛋白和RNA结合的功能,两边分别是N-端和C-端结构域,C-端结构域含有3个α-螺旋,分别位于458—468aa、492—499aa和503—505aa位,主要作为N蛋白α-螺旋的结合位点。【结论】本研究成功地克隆小反刍兽疫病毒P基因,分析和预测了p蛋白的结构和功能的关系,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因DaGSTe1的克隆与表达

【目的】克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因的全长序列,并对其序列特征及不同发育时期的表达规律进行研究,以揭示谷胱甘肽S-转移酶在华山松大小蠹克服寄主抗性及物质转运过程中的分子调控机制。【方法】采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转酶基因全长cDNA序列,用实时荧光定量PCR检测该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹和雌雄成虫中的表达情况。【结果】获得cDNA全长为973bp的华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因,并命名为DaGSTe1(GenBank登录号:KJ637332),其编码一个由218个氨基酸组成的多肽,分子质量约为23.567ku,理论等电点为7.90。华山松大小蠹DaGSTe1与山松大小蠹DpGSTe1氨基酸序列的相似度最高,达94%。根据对系统发育树的分析推测,DaGSTe1属于Epsilon类谷胱甘肽S-转移酶。DaGSTe1蛋白三维结构包括一个N端结构域和一个C端结构域,其中N端结构域包括典型的4个β片层和3个α螺旋(β1α1β2α2β3β4α3),C端结构域包括5个α螺旋(α4α5α6α7α8)。DaGSTe1基因在华山松大小蠹不同发育期均有表达,其中在雄性成虫中的表达量最大,为幼虫和蛹的8倍,雌性成虫的4倍。【结论】克隆得到了华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶家族基因DaGSTe1,推测该基因具有降解寄主毒素的作用,而且参与华山松大小蠹雄性特异性激素的转运过程。     

水稻OsLEA2基因的克隆及表达分析

利用RT-PCR技术从水稻中克隆到OsLEA2的cDNA。序列分析表明,OsLEA2基因的读码框为312 bp,编码一个由103个氨基酸残基组成的蛋白,富含Ala、Lys、Glu、His、Val和Arg,不含Asn、Cys、Phe和Trp。OsLEA2蛋白的1～73位氨基酸残基形成LEA₁结构域。OsLEA2蛋白的二级结构有3个α-螺旋构象区域,没有伸展的β-片层构象,为亲水蛋白。进化树分析表明OsLEA2属于第4组LEA蛋白的4A亚组,OsLEA2与4A亚组LEA蛋白的氨基酸一致性为29%～45%。实时定量RT-PCR分析表明表明OsLEA2基因在水稻的不同生长发育时期的不同组织中都能表达,在完熟期的根和穗中,OsLEA2基因的表达明显升高。     

斑翅果蝇Orco基因的生物信息学分析

对斑翅果蝇非典型嗅觉受体(Orco)基因的理化性质、亚细胞定位、跨膜结构、信号肽、磷酸化位点、保守结构域、亲疏水性、蛋白功能、二级和三级结构及同源进化等进行分析.结果显示,斑翅果蝇Orco基因编码的蛋白质有486个氨基酸,相对分子质量为54 271.14 u,等电点为8.69.亚细胞主要定位于其他细胞器,不属于分泌蛋白;无信号肽序列,有7个跨膜结构和1个Pfam 7tm_6的结构域;Orco蛋白的二级结构中,α螺旋占50.21%,直链延伸占20.16%,β转角占8.64%,无规则卷曲占20.99%;三级结构主要由α螺旋和无规则卷曲缠绕折叠形成.     

抑制素α亚基三级结构与其他TGF-β配体的比较

抑制素A和抑制素B是由不同抑制素/激活素β亚基(βA、βB)和结构相似的α亚基组成的同源二聚体,即抑制素A(αβA)、抑制素B(αβB)。利用生物信息学技术对抑制素α亚基(INHα)进行三级结构建模,并利用ClustalW和SPDV软件比较INHα与其他转化生长因子β(TGF-β)超结构家族成员在结构和序列方面的异同。结果表明,激活素(ACT)、骨形成蛋白7(BMP7)、BMP9与typeⅡ受体结合面的核心氨基酸在INHα中不仅在多处发生了突变,而且在空间上也发生了很大位移,因此如果INHα同时与typeⅡ受体在与激活素、BMP7、BMP9的相同位置结合,那么INHα会比激活素与激活素受体ActRⅡ、ActRⅡB的亲和力低。ACT A中几个参与活化素受体样激酶4(ALK4)相互作用的氨基酸在INHα中发生了突变,ACT Aα螺旋中极性氨基酸在INHα中被非极性氨基酸所替代,且α螺旋在空间上发生了很大位移,INHα不与ALK4结合。可见,抑制素信号传导机制为:抑制素与Betaglycan高亲和力结合并与ActRⅡ、ActRⅡB、BMPRⅡ形成复合物,但不与ALK4结合,因此将它们与激活素和BMP隔离。     

石榴蔗糖代谢相关酶SPS和INV基因家族鉴定与表达分析

蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖转化酶(INV)是蔗糖代谢的关键调控酶,在植物生长发育过程中起重要作用。本研究利用生物信息学和荧光定量PCR等分子手段,鉴定石榴SPS和INV基因家族成员,分析其理化性质、保守结构域、保守基序、二级结构、亚细胞定位、系统进化关系和表达模式。结果表明,从石榴基因组中鉴定出4个SPS基因和11个INV基因,其编码蛋白均为不稳定蛋白,具有典型的保守结构域,家族成员间特征motif数量和种类大致相同,蛋白结构高度保守;这些蛋白不均匀地分布在染色体上,均定位于叶绿体中,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。石榴SPS和INV基因家族成员间存在不同程度的亲缘关系,与巨桉同源性较高;不同SPS和INV基因在石榴果实不同发育时期的表达模式存在差异,PgINV3在9月15日(果实增大期)表达水平最高,显著高于其他时期。本研究结果对解析石榴果实中蔗糖代谢的分子机理具有重要意义。     

烟草甲气味结合蛋白与驱避配体的分子对接

[目的]本文旨在利用分子对接技术研究烟草甲气味结合蛋白与驱避配体的分子对接，以研发烟草甲新型驱避剂。[方法]利用AlphaFold2软件预测11个烟草甲气味结合蛋白(LserOBP)的三维结构，并以11个LserOBP为受体和文献报道的对烟草甲具有驱避作用的14种分子为配体，利用Autodock Vina软件进行分子对接研究。[结果]通过AlphaFold2构建的11个LserOBP的三维结构中，LserOBP2、LserOBP4、LserOBP5、LserOBP6、LserOBP8和LserOBP9与配体芦丁的结合位点位于α-螺旋形成的疏水腔中，与其他物种已解析出的OBP和配体间的结合位点相似。LserOBP1、LserOBP3、LserOBP5、LserOBP6和LserOBP8与茴香烯、对甲基苯异丙醇、3-蒈烯、肉桂酸甲酯、肉桂酸乙酯、避蚊胺、乙酸松油酯和芦丁均有较好的结合能力，这几种化合物具有开发为新型烟草甲驱避剂的应用前景。LserOBP与配体的结合能力可能与LserOBP的三维结构、配体的相对分子质量和其所含有的官能团有关。在一定的范围内，LserOBP与相对分子质量较大的...     

烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体α亚基Btα4基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR和RACE技术,对烟粉虱烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)α亚基的1个基因进行了克隆和序列分析.获得的烟粉虱nAChR α亚基基因的全长cDNA序列含有2 090 bp,其开放阅读框编码564个氨基酸.根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫乙酰胆碱受体α亚基氨基酸序列之间的相似性,将该基因命名为Btα4(GenBank注册号为EF590120).Btα4编码的α亚基含有2个结构域:N端的胞外结构域和C端的跨膜结构域,N端的胞外结构域含有2个相邻的半胱氨酸(α亚基特征序列)、15个氨基酸构成的半胱氨酸环和乙酰胆碱结合区.研究结果对于揭示烟粉虱潜在的对新烟碱类杀虫剂靶标抗性的分子机制具有重要意义.     

普城沙雷氏菌pigX基因的生物信息学分析

通过生物信息学方法对普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)G3菌株中GGDEF/EAL结构域蛋白编码基因pigX启动子区域的调控信息以及编码蛋白质的理化特性和结构特点进行了解析。利用启动子分析软件Softberry和Neural Network Promoter Prediction对pigX基因编码区上游序列进行启动子预测,利用生物信息学方法对PigX蛋白的氨基酸组成和理化特性、磷酸化和糖基化位点、跨膜结构、信号肽二级结构和保守结构域等进行预测分析。结果显示:pigX启动子区有Fur和SoxS结合位点;PigX是微亲水性的脂结合蛋白,具有信号肽和跨膜结构域、糖基化和高水平磷酸化位点,α-螺旋和无规则卷曲是其主要二级结构。生物信息学分析预测结果表明G3菌株PigX具有较高水平磷酸化位点及由α-螺旋和无规则卷曲组成的二级结构,这与预测的PigX参与铁代谢和氧化应激反应及作为Csr D同源物与CSRB家族sRNAs分子结合的功能相吻合。     

千里光脂肪酸脱氢酶(D6D)的保守基序(CSM)与功能结构域分析

Δ6-脂肪酸脱氢酶(Δ6 desaturase,D6D)是不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。以高等植物千里光为材料,通过构建全长c DNA文库克隆得到脂肪酸脱氢酶基因(D6D),明确了D6D基因的氨基酸保守基元序列(conserved sequence motif,CSM)对蛋白质功能结构域的决定作用。结果显示,千里光D6D基因由466个氨基酸残基组成;预测蛋白分子量为53.40 ku,理论等电点为8.48;进化树和序列比对结果提示3个富含His的保守基元序列(HisⅠ-片段、HisⅡ-片段、HisⅢ-片段)在不同物种中表现出高度保守性;三维结构预测结果表明,D6D基因的保守结构域以及一个类似于细胞色素(cytochrome,cyt)b5的血红素结合区是形成底物结合部位和酶催化活性中心的结构基础。     

基于反向分子对接的虫草素和三磷酸虫草素的生物活性

分别采用idTarget、Pharm Mapper在线反向分子对接软件预测虫草素和三磷酸虫草素的靶标蛋白(药效团匹配蛋白),用Ledock分子对接软件模拟虫草素、三磷酸虫草素与靶标蛋白的结合构象,用Lig Plus软件分析结合构象活性口袋内残基与配体的相互作用。反向分子对接结果表明:三磷酸虫草素与靶标蛋白的自由结合能比虫草素与靶标蛋白的自由结合能低。分子对接结果表明:与虫草素相比,三磷酸虫草素与靶标蛋白活性口袋内的氨基酸残基可形成更多的氢键,且三磷酸虫草素和靶标蛋白有较好的几何匹配,其自由结合能也较低,其结合构象更稳定。根据正向、反向分子对接结果,认为三磷酸虫草素是虫草素进入人体内发挥生物活性的主要物质。     

植物咖啡碱合成酶的生物信息学分析

采用生物信息学分析方法对 GenBank 中来源于茶树、可可、山茶等植物咖啡碱合成酶的氨基酸序列进行比对分析,就等电点、亚细胞定位、信号肽、跨膜螺旋、保守性功能结构域及基序、二级结构与三级结构等重要参数进行预测与分析。结果表明,植物咖啡碱合成酶主要定位于胞质和胞核中,含有磷酸化、酰基化和糖基化修饰位点,基于基因序列与保守结构域可被分成3种类型,其中 I 型与 II 型酶蛋白均属全α型水溶性酶蛋白,III 型酶蛋白除二级结构富含无规卷曲构件,还极有可能存在信号肽序列,但3类酶蛋白均无跨膜螺旋,三级结构预测显示,I 型、II 型酶蛋白极为相似,由α螺旋和横向β-折叠片层组成,III 型则α螺旋位于横向两端,中间由纵向β-折叠片层连接。     

荔枝蒂蛀虫卵5个化学感受蛋白的基因克隆及除虫脲对其表达的影响

目的 获得荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis 5个化学感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)基因CsinCSPs的全长序列,并解析除虫脲对其表达的影响。方法 提取荔枝蒂蛀虫卵总RNA,利用转录组测序结果和cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)获得5个CsinCSPs基因的全长序列;对序列进行生物信息学分析,用Phyre²在线软件进行同源建模,用AutoDock软件对蛋白与农药分子进行分子对接预测;用荧光定量PCR方法分析在除虫脲处理荔枝蒂蛀虫卵后这5个基因的表达情况。结果 从荔枝蒂蛀虫卵中克隆了5个CsinCSPs基因的全长序列,序列分析结果表明,这5个基因的编码蛋白具有昆虫化学结合蛋白的典型特征,其保守半胱氨酸位点排布模式均为C1-X₆-C2-X₁₈-C3-X₂-C4,并分为了包含5个α-螺旋和6个α-螺旋的2个类群。软件模板分析表明,5个CsinCSPs蛋白的三维结构均由α-螺旋、β-折叠和卷曲环组成,且与甘蓝夜蛾Mamestra brassicae CSP2的三维结构相似度最高。分子对接数据表明,5个CsinCSPs与2个菊酯类药剂分子结合亲和力最强,与除虫脲的结合力最弱。亚致死剂量除虫脲处理荔枝蒂蛀虫卵后,CsinCSP3和CsinCSP5分别在处理后6、24 h表达上调超过40余倍,48 h则表达下降。结论 化学感受蛋白CsinCSPs可能参与农药胁迫下荔枝蒂蛀虫卵的解毒过程。     

猪ACACA基因及其编码蛋白质的生物信息学分析

为从分子水平研究猪脂肪合成过程,对脂肪合成关键酶乙酰辅酶A羧化酶-α基因(ACACA)进行分析。采用生物信息学的方法,查找猪ACACA基因的ORF框,对基因CDS序列的限制性酶切位点进行分析,并对其编码蛋白质的理化性质、二级结构、三级结构、拓扑结构、结构功能域进行预测分析。结果表明,猪ACACA基因CDS区全长7 041 bp,其编码蛋白质含2 346个氨基酸。二级结构以α螺旋与无规则卷曲为主,局部出现β转角,三级结构显示结果与二级结构预测结果相符。该蛋白质为亲水性蛋白质,N端无信号肽,为非分泌蛋白质;不含跨膜结构区,未定位于膜内,预测其为膜外区蛋白质;亚细胞定位结果显示该蛋白质为非细胞器蛋白质,是胞质蛋白质的可能性最大;功能域分析发现该蛋白质序列含有BC结构域、CT结构域、CPSase大亚基N端结构域、ATP-grasp折叠结构域、生物素基/硫辛酰基结合域等及一些蛋白质基序。该结果将为进一步研究猪ACACA基因与脂肪合成的关系提供基础资料。     

蔓花生AP2基因家族的生物信息学分析

AP2作为一类植物转录因子,在花的发育和营养器官的形成过程中都起着非常重要的作用。旨在对蔓花生(Arachis duranensis)AP2蛋白的理化性质及分子进化关系等进行详细的生物信息学分析。结果表明,蔓花生AP2基因家族成员编码蛋白亚细胞定位预测均在细胞核中,有11个成员的理论等电点小于7,推测该家族蛋白多为酸性蛋白,有8个成员存在2个保守结构域;该家族成员均无信号肽;除了Aradu.SE6Q0与Aradu.42K79成员中存在跨膜现象外,其他成员鲜少出现跨膜现象。亲疏水性预测结果表明,蔓花生AP2基因家族编码蛋白的亲疏水性系数均小于0,推测其为亲水蛋白;磷酸化位点主要集中在丝氨酸上;其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。研究还得出,蔓花生AP2基因家族编码蛋白的主要保守基序是Motif1、Motif2和Motif4;Motif3、Motif4都含有YRG结构域,Motif5含有RAYD结构域;构建的系统发育树也有力地说明了AP2基因家族的进化程度。     

石金钱龟板来源的寡肽与环氧合酶-2相互作用机制

为探究石金钱龟板来源的寡肽KNGP能否作为COX-2（环氧合酶-2）的新型抑制剂，通过紫外分光光度法测定石金钱龟板肽YPTP、合成肽段KNGP和RG的IC₅₀值，利用内源荧光、同步荧光、三维荧光光谱和ANS（1-苯胺基-8-萘磺酸）荧光探针法分析KNGP对COX-2的疏水性影响，利用分子对接方法分析KNGP与COX-2间的相互作用方式。结果显示，YPTP、KNGP和RG的IC₅₀值分别为0.609、0.046和0.056 mg/mL，KNGP的IC₅₀值低于阳性药布洛芬（IC₅₀=0.217 mg/mL），说明KNGP对COX-2具有显著的抑制潜力。内源荧光结果显示KNGP对COX-2的作用为静态猝灭且有单一作用位点，同时热力学参数计算结果显示，KNGP和COX-2的结合过程中疏水作用是主要驱动力，且KNGP和COX-2结合的是由熵驱动的自发过程。同步荧光、三维荧光光谱和荧光探针结果显示COX-2中的酪氨酸与色氨酸的疏水环境发生变化，且其表面的疏水性减弱。KNGP与COX-2的分子对接显示，KNGP分子主要通过NH基团、C=O结构、吲哚和咪唑结构与COX-2活性中心的氨基酸残基形成氢键和疏水相互作用，并通过形成静电作用增强结合的稳定性。以上结果表明， KNGP能与COX-2的单一位点通过氢键和疏水相互作用结合形成复合物，并改变酶的二级结构来抑制其活性。     

鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测

用DNA Club分析软件推导出鲫血清转铁蛋白序列,并对该序列进行分析。推导的蛋白质长度为807个氨基酸,MW约为90 kD。其中半胱氨酸43个,可以组成21对二硫键。疏水性和二级结构几率分析表明：有2个非常相似的结构域分别存在于1～390和390-807区域。旋管结构和螺旋结构的分布区域,均分别集中在上述2个区段中,同样位于2个结构域中,结构也非常类似。证实了Tf由2个同源性较高的结构域(N结构域和C结构域)组成。Tf的三级结构呈“V”字形,每个结构域又各自分为3个小的结构小区(即N1、N2、N3和C1、C2、C3)。2个糖基位于N1和C1区,呈“Y”字型结构;铁链位于N2和C2区;受体结合位点R1和R2位于N3和C3区。