不同冷冻方法保存同种异体关节软骨移植后的生物学活性特征

目的:观察经梯度降温、冷冻保存的同种异体关节软骨移植后的生物学活性,为临床治疗大面积关节软骨缺损提供依据。方法:实验组将经梯度降温、冷冻保存的兔膝关节半髁异体移植。同时设对照组。分别于术后8,12,24周进行关节软骨大体形态及组织学观察。结果:8周时移植关节软骨形态正常成活,软骨细胞排列尚整齐,12周时移植关节软骨恢复正常透明软骨形态,修复组织与周围融合。24周时部分关节软骨表面有退行性变,与周围关节软骨愈合良好。结论:经梯度降温、冷冻保存的同种关节软骨移植可作为修复大面积关节软骨缺损的一种治疗方法。     

不同冷冻方法保存同种异体关节软骨移植后的生物学活性特征

目的：观察经梯度降温、冷冻保存的同种异体关节软骨移植后的生物学活性，为临床治疗大面积关节软骨缺损提供依据。方法：实验组将经梯度降温、冷冻保存的兔膝关节半髁异体移植。同时设对照组。分别于术后8，12，24周进行关节软骨大体形态及组织学观察。结果：8周时移植关节软骨形态正常成活，软骨细胞排列尚整齐，12周时移植关节软骨恢复正常透明软骨形态，修复组织与周围融合。24周时部分关节软骨表面有退行性变，与周围关节软骨愈合良好。结论：经梯度降温、冷冻保存的同种关节软骨移植可作为修复大面积关节软骨缺损的一种治疗方法。     

人骨软骨组织体外冷冻保存的效果

背景:异体骨软骨移植是治疗关节软骨缺损的有效方法,然而由于移植物体外有效保存时间短,限制了临床应用以及移植物的利用效率。目的:观察梯度降温冷冻保存同种异体关节软骨的保存效果。方法:将关节软骨块经体积分数10%二甲基亚砜预处理后,应用程序冷冻仪以-1℃/min行梯度降温至-4℃,-10℃,-20℃,-40℃各30min,最后至-80℃冷冻保存。结果与结论:保存1,3,6个月及1年后检测发现,与新鲜组相比,冷冻后软骨细胞存活率、细胞活性以及浅、中、深层的蛋白多糖水平下降(P<0.05),且软骨细胞存活率、细胞活性以及浅、中、深层的蛋白多糖水平随冷冻保存时间延长而降低(P<0.05),提示冷冻保存可有效地延长骨软骨移植物存活时间。     

人骨软骨组织体外冷冻保存的效果

背景：异体骨软骨移植是治疗关节软骨缺损的有效方法,然而由于移植物体外有效保存时间短,限制了临床应用以及移植物的利用效率。目的：观察梯度降温冷冻保存同种异体关节软骨的保存效果。方法：将关节软骨块经体积分数10%二甲基亚砜预处理后,应用程序冷冻仪以-1℃/min行梯度降温至-4℃,-10℃,-20℃,-40℃各30min,最后至-80℃冷冻保存。结果与结论：保存1,3,6个月及1年后检测发现,与新鲜组相比,冷冻后软骨细胞存活率、细胞活性以及浅、中、深层的蛋白多糖水平下降（P〈0.05）,且软骨细胞存活率、细胞活性以及浅、中、深层的蛋白多糖水平随冷冻保存时间延长而降低（P〈0.05）,提示冷冻保存可有效地延长骨软骨移植物存活时间。     

玻璃化冷冻法保存关节软骨

背景：同种异体骨软骨移植技术是治疗关节软骨缺损有效的方法之一,但由于移植物保存方法不理想,明显制约着该技术的临床应用。目的：探讨玻璃化冷冻法保存关节软骨组织的可行性和优越性。方法：切取成年猪骨软骨,制成约5mm×6mm（直径×长度）大小的圆柱形骨软骨块。以新鲜软骨组为对照,分别采用0.5mol/L甘油、1mol/L二甲基亚砜、1mol/L玻璃化溶液3种方法预处理软骨块,再行冷冻法保存软骨块8周,采用组织化学染色、免疫荧光染色观察并比较软骨细胞活性的变化。结果与结论：玻璃化溶液预处理组的关节软骨细胞存活率达到74.5%,明显高于甘油和二甲基亚砜预处理组,软骨基质成分仅少量丢失。3种方法相比较,玻璃化溶液预处理后慢速梯度降温冷冻保存法可以明显提高冻存关节软骨组织的活性。     

藻酸钙凝珠复合自体软骨细胞修复成年兔关节软骨缺损

背景:软骨缺损的修复一直是骨科界的难题之一,近几年发展起来的应用组织工程学技术修复软骨缺损的方法,逐渐被认为是一种有希望治疗关节软骨缺损的手段.目的:应用藻酸钙凝珠一自体软骨细胞移植修复兔膝关节软骨缺损,观察损伤近期修复情况.方法:成年新西兰大白兔30只,左膝取软骨细胞,右膝造模.采用体外培养后的第3代自体软骨细胞复合海藻酸钠凝胶,混入CaCl2溶液中制成串珠状凝珠,体外培养4周.实验组植入海藻酸钙凝珠-自体软骨细胞复合物,对照组植入不含细胞的海藻酸钙凝珠,空白组不做任何处理.结果与结论:纳入新西兰大白兔30只,除其中1只术后单侧膝关节僵硬强直外,其余均未见手术后关节活动障碍,所有动物术后无感染,无死亡.苏木精一伊红染色可见,实验组修复组织以透明软骨为主,对照组以纤维软骨修复为主,空白组修复不明显,以纤维软组织修复为主.免疫组织化学染色可见实验组修复组织以表达II型胶原为主,对照组Ⅱ型胶原免疫组化着色较淡,Ⅱ型胶原表达量少.空白组修复组织不表达Ⅱ型胶原.结果提示藻酸钙凝珠-自体软骨细胞修复软骨缺损有较好效果,表明自体软骨细胞复合藻酸钙凝珠能为软骨组织工程提供一种很好的思路.     

应用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞混合移植修复兔膝关节实验性软骨缺损区

背景：应用异体软骨细胞移植修复关节软骨缺损的研究较多,但其可引起免疫反应.由于胚胎细胞具有较低的抗原性和较强的增殖能力,期望其能为组织工程研究与应用开辟新的载体材料.目的：采用兔胚胎软骨细胞培养移植修复关节软骨缺损,并对其组织形态学进行观察.设计：随机分组观察对比实验.单位：广西医科大学组织胚胎学试验室.材料：孕4周新西兰大白兔1只;成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体质量2～2.5 kg .方法：实验于2000-12/2002-06在广西医科大学组织胚胎学试验室完成.在成兔股骨内侧髁作关节软骨缺损模型,实验组采用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞相混后,植入兔膝关节实验性软骨缺损区,对照组不做任何处理或单纯用生物蛋白胶移植修补,分别于术后4,8,12周观察关节软骨缺损修复的情况,并按改良Pineda方法对其进行组织学评分,标准为细胞形态、基质染色、表面平整、软骨厚度、宿主结合5项,0分表示正常,分值越高表示改变越严重.主要观察指标：①兔膝关节标本大体观察结果.②兔膝关节标本组织学观察结果.③关节软骨组织学半定量计分结果.④关节软骨缺损修复区进行疗效评价结果.结果：24只兔均进入结果分析.①兔膝关节标本大体观察结果：胚胎软骨细胞＋纤维蛋白封闭剂组缺损区颜色接近正常软骨,质韧弹性好,与周围软骨界限消失;纤维蛋白封闭剂组与未处理组始终未愈合,但创面略小,有白色纤维组织充填.②兔膝关节标本组织学观察结果：胚胎软骨细胞＋纤维蛋白封闭剂组优势组织为透明样软骨,深方为骨组织,表面略凸或平整,基质着色正常,与周围软骨完全结合分界不清,组织中未发现淋巴细胞浸润;纤维蛋白封闭剂组与未处理组为纤维组织,部分有残留明显的凹陷性瘢痕,与周围组织接合或部分接合.③关节软骨组织学半定量计分结果：按改良自Pineda方法,12周胚胎软骨细胞＋纤维蛋白封闭剂组评分显著低于纤维蛋白封闭剂组和未处理组[（0.50&;#177;0.76）,（7.88&;#177;1.13）,（8.13&;#177;1.36）分,P＜0.05],而单纯用纤维蛋白封闭剂修补组在4周与未处理组比较有显著性差异（P＜0.05）,在8,12周则无差异.④关节软骨缺损修复区进行疗效评价结果：12周时胚胎软骨细胞＋纤维蛋白封闭剂组完全修复8膝,纤维蛋白封闭剂组不完全修复1膝,未修复7膝,未处理组未修复8膝.结论：胚胎软骨细胞移植组所产生的修复组织接近正常软骨组织,明显优于纤维蛋白封闭剂组和未处理组,该方法作为关节软骨缺损修复是可行的.     

同种异体骨软骨柱移植治疗关节软骨缺损

背景:同种异体骨软骨移植修复关节软骨损伤可以解决自体骨软骨来源有限的问题,但存在免疫排斥问题.目的:观察以深低温保护剂保护的同种异体骨软骨柱移植修复兔关节软骨缺损的效果,并与自体关节软骨移植作比较.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2008 05/10在武汉协和医院骨科实验室完成.材料:24只成年健康新西兰兔中8只用于异体骨软骨柱的制备,16只随机分成同种异体移植组和自体移植组,每组8只.方法:使用横穿钉套筒提取兔股骨内侧髁骨软骨柱,将骨软骨柱在4℃条件下放入盛有10%二甲基亚砜的冻存管中2 h,将冻存管移入程序冷冻仪内以1℃/min速率降至-75℃,放入-196℃液氮罐底部保存3周备用.用横穿钉钻头在兔左膝关节股骨内侧髁垂直于软骨面制造缺损,缺损深4 mm,直径4.45 mm,自体移植组取右膝关节内侧髁骨软骨柱植入到左侧膝关节相应缺损处,异体移植组将经过程序性深低温冷冻保存的同种异体骨软骨柱移植到相应缺损处.主要观察指标:术后12周观察兔关节活动度、修复组织的质地等情况.以苏木精-伊红染色观察关节软骨组织的病理变化,以半定量改良Wakitani score法进行评估.以免疫组织化学染色观察Ⅱ型胶原分泌情况.结果:两组实验动物关节活动度正常.异体移植组移植处关节软骨面较光整,与周围正常关节软骨高度一致,结合紧密,颜色接近,与自体移植组相似.两组移植后,兔关节缺损处被透明软骨覆盖,潮线整齐,细胞排列有序,分泌大量基质,异体移植组移植处软骨深层及软骨下骨处可见微小裂隙,未见淋巴细胞和浆细胞浸润.同种自体与异体骨软骨移植组Wakitaniscore评分结果无统计学差异,总分接近,修复软骨Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均强阳性.结论:冷冻同种异体骨软骨柱移植可修复全层小面积关节软骨缺损,术后近期软骨细胞存活,可分泌软骨基质,未见明显排斥反应,与自体骨软骨柱修复的兔关节软骨缺损在组织学上相近.     

应用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞混合移植修复兔膝关节实验性软骨缺损区

背景应用异体软骨细胞移植修复关节软骨缺损的研究较多,但其可引起免疫反应.由于胚胎细胞具有较低的抗原性和较强的增殖能力,期望其能为组织工程研究与应用开辟新的载体材料.目的采用兔胚胎软骨细胞培养移植修复关节软骨缺损,并对其组织形态学进行观察.设计随机分组观察对比实验.单位广西医科大学组织胚胎学试验室.材料孕4周新西兰大白兔1只;成年新西兰大白兔24只,雌雄不限,体质量2～2.5 kg .方法实验于2000-12/2002-06在广西医科大学组织胚胎学试验室完成.在成兔股骨内侧髁作关节软骨缺损模型,实验组采用生物蛋白胶与胚胎软骨细胞相混后,植入兔膝关节实验性软骨缺损区,对照组不做任何处理或单纯用生物蛋白胶移植修补,分别于术后4,8,12周观察关节软骨缺损修复的情况,并按改良Pineda方法对其进行组织学评分,标准为细胞形态、基质染色、表面平整、软骨厚度、宿主结合5项,0分表示正常,分值越高表示改变越严重.主要观察指标①兔膝关节标本大体观察结果.②兔膝关节标本组织学观察结果.③关节软骨组织学半定量计分结果.④关节软骨缺损修复区进行疗效评价结果.结果24只兔均进入结果分析.①兔膝关节标本大体观察结果胚胎软骨细胞+纤维蛋白封闭剂组缺损区颜色接近正常软骨,质韧弹性好,与周围软骨界限消失;纤维蛋白封闭剂组与未处理组始终未愈合,但创面略小,有白色纤维组织充填.②兔膝关节标本组织学观察结果胚胎软骨细胞+纤维蛋白封闭剂组优势组织为透明样软骨,深方为骨组织,表面略凸或平整,基质着色正常,与周围软骨完全结合分界不清,组织中未发现淋巴细胞浸润;纤维蛋白封闭剂组与未处理组为纤维组织,部分有残留明显的凹陷性瘢痕,与周围组织接合或部分接合.③关节软骨组织学半定量计分结果按改良自Pineda方法,12周胚胎软骨细胞+纤维蛋白封闭剂组评分显著低于纤维蛋白封闭剂组和未处理组[(0.50±0.76),(7.88±1.13),(8.13±1.36)分,P＜0.05],而单纯用纤维蛋白封闭剂修补组在4周与未处理组比较有显著性差异(P＜0.05),在8,12周则无差异.④关节软骨缺损修复区进行疗效评价结果12周时胚胎软骨细胞+纤维蛋白封闭剂组完全修复8膝,纤维蛋白封闭剂组不完全修复1膝,未修复7膝,未处理组未修复8膝.结论胚胎软骨细胞移植组所产生的修复组织接近正常软骨组织,明显优于纤维蛋白封闭剂组和未处理组,该方法作为关节软骨缺损修复是可行的.     

自体骨负载软骨细胞修复兔关节骨软骨缺损

目的:观察原代单层培养的自体软骨细胞包埋于骨与骨膜之间修复关节骨软骨缺损的可行性,探索一种关节内骨软骨缺损或单纯软骨缺损的修复方法。方法:实验于2003-05/2006-10在安徽医科大学完成。实验分组:取4周龄健康新西兰大白兔27只,体质量460～520g,随机摸球法分为自体骨 软骨细胞 骨膜移植组、自体骨 骨膜移植组、骨膜移植组,每组9只。实验方法:取自体骨 软骨细胞 骨膜移植组兔子膝关节的软骨消化成软骨细胞并在体外原代单层培养近2周;每只兔子的双侧膝关节股骨滑车部造成3mm×4mm×4mm的骨软骨缺损,在自体骨 软骨细胞 骨膜移植组各取两块3mm×4mm的髂骨洗去血细胞,充填软骨下骨缺损,松质面向关节腔,骨膜覆盖,软骨细胞与纤维蛋白凝胶混合物注入腔隙内;自体骨 骨膜移植组不注射软骨细胞;骨膜移植组用骨膜修复。实验评估:分别在4,8,12周进行大体和苏木精-伊红染色、蕃红花”O“染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学进行形态学以及透射电镜超微结构观察软骨的生长情况,并按照O’Driscoll,Keeley and Salter评分标准,对各组进行半定量评分,组间比较采用q检验。结果:纳入新西兰大白兔27只,均进入结果分析。①3组软骨的生长情况:自体骨 软骨细胞 骨膜移植组软骨缺损被修复,外观与周围正常软骨没有明显区别,组织学检测为透明软骨或类透明软骨,软骨下骨修复完善;自体骨 骨膜移植组缺损表面被纤维软骨修复,12周出现明显退变;骨膜移植组缺损被纤维组织及骨样组织修复,对应的髌骨软骨出现磨损的创痕。②3组不同时间点组织学评分:自体骨 软骨细胞 骨膜移植组、自体骨 骨膜移植组、骨膜移植组4周分别是(10.83±4.40),(9.33±3.93),(5.83±1.94)分;8周:(15.17±4.71),(10.83±3.06),(6.67±1.51)分;12周:(15.83±4.58),(8.17±2.79),(3.83±0.75)分。在第8,12周,3组之间差异有显著性意义(P<0.01)。结论:自体骨复合纤维蛋白凝胶负载软骨细胞修复关节骨软骨缺损,可在重建软骨下骨的同时形成透明或类透明软骨表面。     

应用液态及凝胶态生物载体材料负载同种异体软骨细胞修复全厚关节软骨缺损

背景:应用固态载体作为细胞支架,修复关节软骨缺损,已有成功经验。尝试将液态载体或凝胶态载体材料复合细胞后注入动物体内,观察该方法的可行性。目的:探讨液态载体或凝胶态载体材料氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载同种异体软骨细胞修复全厚关节软骨的可行性。设计:对照实验。单位:威海市立医院骨科,山东省创伤骨科研究所。材料:实验于2001-11/2003-09在山东省创伤骨科研究所实验室进行。健康成年新西兰大白兔36只,体质量2.5～4.5kg,雌雄不限。编号后根据缺损处注入物质的成分随机数字法分成4组,即氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2软骨细胞组、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2组、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组、空白对照组,每组9只。方法:36只大白兔分组后造关节软骨缺损模型,取同种新西兰大白兔关节软骨细胞,体外培养扩增后与20%氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2混合,移植到缺损处进行修复。各移植组缺损处分别注入氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2、氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组。空白对照组:缺损处不做任何处理。移植后4,8,12周对缺损的修复情况进行大体、光镜组织学评估和电镜观察。据Wakitani评分标准,采用盲法对修复质量作出评价。主要观察指标:①软骨缺损修复程度。②软骨细胞的性质形态,基质中胶原性质、数量及排列方式。结果:①移植的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞中的软骨细胞能很好地生长,4周时,缺损区完全填充。8,12周再生组织与周围正常软骨组织外观相似,界限模糊。组织学检查:形成透明软骨,缺损处被修复。②电镜下:8,12周,修复组织中可见多数成熟的透明软骨细胞及其周围排列不规则的、纤细的、均匀的和无周期性的Ⅱ型胶原。空白对照组仅见纤维修复,再生组织缺乏弹性,表面粗糙,不规则。③修复质量评分:氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载软骨细胞组和各组相比在各个时期差异均存在显著性,氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2组和氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞组与对照组相比在各个时期差异均存在显著性[4周:(3.93±1.91),(4.56±1.07),(4.78±1.09),(8.44±1.13)分;8周:(2.80±1.45),(3.24±1.00),(3.33±1.00),(8.44±1.13)分;12周:(2.22±1.10),(3.01±0.69),(3.00±0.71),(9.00±0.87)分,P<0.001],但两组之间在各个时期无显著的差异(P>0.05)。结论:氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物结合重组人骨形态蛋白2负载同种异体软骨细胞移植能以透明软骨的方式成功修复兔膝股骨髁软骨缺损,并优于单纯的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物负载重组人骨形态蛋白2或单纯的氧化聚乙烯和氧化聚丙烯复合物软骨细胞的移植。     

The effects of using vitrified chondrocyte sheets on pain alleviation and articular cartilage repair

T he effect of using vitrified–thawed chondrocyte sheets on articular cartilage repair was examined because the methods for storing chondrocyte sheets are essential for allogeneic chondrocyte sheet transplantation. Six Japanese white rabbits were used as sources of articular chondrocytes and synovial cells. Chondrocytes were harvested from the femur, and synovial cells were harvested from inside the knee joints. After coculture of the chondrocytes with synovial cells, triple‐layered chondrocyte sheets were fabricated. Eighteen rabbits were used, with six rabbits in each of three groups: osteochondral defect only (control, group A); chondrocyte sheets (group B); and vitrified–thawed chondrocyte sheets (group C). An osteochondral defect was created on the femur. After transplantation, the weight distribution ratio of the undamaged and damaged limbs was measured as a pain‐alleviating effect. The rabbits were euthanized at 12 weeks, and the transplanted tissues were evaluated for histology (Safranin O staining and immunostaining) using the International Cartilage Repair Society grading system. For both evaluations, significant differences were observed between groups A and B, and between groups A and C (p < 0.05). No significant differences were observed between groups B and C. Thus, pain‐alleviating effects and tissue repair were achieved using vitrified–thawed chondrocyte sheets. Copyright © 2017 John Wiley & Sons, Ltd.     

自体非负重区软骨替代负重区软骨修复关节软骨缺损的实验研究

目的:探讨自体骨软骨移植取材的新方法。方法 :选用健康成年大耳白兔32只 ,用楔形带厚层骨的骨软骨移植方法 ,取自体非负重区软骨替代负重区软骨进行修复试验。结果 :移植的软骨与受区牢固愈合 ,关节间隙正常 ,关节活动度正常 ,新生软骨为透明软骨。3H -胸腺嘧啶掺入法测试 :软骨细胞活性无明显降低。结论 :自体非负重区软骨替代负重区软骨修复关节软骨缺损疗效肯定 ,在关节软骨移植取材方面提供了新方法。     

脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养关节腔内的成软骨活性

背景：将骨髓间充质干细胞附着到支架材料上再植入关节软骨缺损处,细胞不但不消失,而且可形成新的软骨。目的：观察同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养在关节内的成软骨活性。方法：在54只青紫蓝兔单侧膝关节制作关节软骨全层缺损模型,随机分组：实验组在缺损处植入自体骨髓间充质干细胞与同种异体脱钙骨基质复合物,对照组缺损处仅植入同种异体脱钙骨基质,空白对照组未植入任何物质。结果与结论：植入后12周,实验组缺损处修复组织呈软骨样,表面光滑平坦,与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟,修复组织与软骨下骨结合牢固;修复组织的细胞为透明软骨样细胞,柱状排列,Ⅱ型胶原染色阳性,与周围软骨及软骨下骨整合良好,且实验组组织学评分优于对照组和空白对照组（P〈0.01）。对照组缺损处修复组织呈纤维样,与周围软骨未结合,空白对照组缺损区无修复组织,两组均无Ⅱ型胶原染色阳性表达。表明同种异体脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞共培养后植入膝关节可形成软骨样组织,有效修复关节软骨缺损。     

自体脂肪间充质干细胞复合人脐带Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损

背景:脐带Wharton胶富含透明质酸,糖胺多糖及胶原等,成分与天然软骨细胞外基质类似,因此由人脐带提取的Wharton胶很可能是一种较为理想的软骨组织工程支架材料。目的:评价自体脂肪间充质干细胞复合人脐带Wharton胶支架修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法:将终浓度为1010L-1、成软骨方向诱导后的兔自体脂肪间充质干细胞与人脐带Wharton胶支架复合,继续培养1周构建组织工程软骨,对兔膝关节全层软骨缺损进行修复(实验组),并与单纯支架修复的对照组及空白组进行比较。术后3个月对修复组织行大体观察、组织学检测、糖胺多糖、总胶原定量检测及生物力学测定。结果与结论:实验组的缺损多为透明软骨修复,对照组以纤维组织修复为主,空白组无明显组织修复。提示脂肪间充质干细胞作为软骨组织工程种子细胞具有可行性;实验构建的组织工程软骨能有效的修复关节软骨缺损,人脐带Wharton胶可作为软骨组织工程良好的支架材料。     

玻璃化法保存兔关节软骨的实验研究

目的观察玻璃化法保存兔关节软骨的效果。方法选取10只大白兔,软骨标本取材后,低温冷冻组5只和玻璃化保存组5只,分别通过台盼蓝拒染法检测兔关节关节软骨细胞存活率和MTT法测软骨细胞相对活性。结果玻璃化保存组兔关节关节软骨细胞存活率和软骨细胞相对活性均优于低温冷冻组,差异均有显著性(P<0.05)。结论玻璃化法保存兔软骨,软骨存活率高,软骨修复区的组织更接近正常软骨。     

Characterization of costal cartilage and its suitability as a cell source for articular cartilage tissue engineering

Costal cartilage is a promising donor source of chondrocytes to alleviate cell scarcity in articular cartilage tissue engineering. Limited knowledge exists, however, on costal cartilage characteristics. This study describes the characterization of costal cartilage and articular cartilage properties and compares neocartilage engineered with costal chondrocytes to native articular cartilage, all within a sheep model. Specifically, we (a) quantitatively characterized the properties of costal cartilage in comparison to patellofemoral articular cartilage, and (b) evaluated the quality of neocartilage derived from costal chondrocytes for potential use in articular cartilage regeneration. Ovine costal and articular cartilages from various topographical locations were characterized mechanically, biochemically, and histologically. Costal cartilage was stiffer in compression but softer and weaker in tension than articular cartilage. These differences were attributed to high amounts of glycosaminoglycans and mineralization and a low amount of collagen in costal cartilage. Compared to articular cartilage, costal cartilage was more densely populated with chondrocytes, rendering it an excellent chondrocyte source. In terms of tissue engineering, using the self‐assembling process, costal chondrocytes formed articular cartilage‐like neocartilage. Quantitatively compared via a functionality index, neocartilage achieved 55% of the medial condyle cartilage mechanical and biochemical properties. This characterization study highlighted the differences between costal and articular cartilages in native forms and demonstrated that costal cartilage is a valuable source of chondrocytes suitable for articular cartilage regeneration strategies.     

骨髓基质细胞源性软骨细胞复合聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物修复兔关节软骨缺损

背景:作为软骨组织工程的基质材料在体内降解过快或过慢,影响组织再生及塑形改建,是长期困扰学者们的难题之一.目的:在体外将骨髓基质细胞扩增、诱导为软骨细胞后,探讨以聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物为载体修复兔关节软骨缺损的可行性.设计、时间及地点:同体对比观察实验,于2002-06/2008-06分别在解放军第四军医大学全军骨科研究所及解放军空军总医院中心实验室完成.材料:选取2月龄新西兰兔36只,自双侧股骨转子处抽取骨髓4-6 mL,行原代及传代培养,传代培养时培养液中含骨形态发生蛋白2(100 μg/L),培养瓶底预涂高分子透明质酸诱导为软骨细胞.调整第3代细胞浓度为2.0×10~(10)L~(-1),与聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物共培养24 h,即制成聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞复合物.方法:在36只兔髌股关节股骨髁部造成直径4mm,深达髓腔的缺损,在右侧36个膝关节植入聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞复合物,为实验组,左侧18膝植入聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物,为单纯载体组,另18膝造成缺损后作为空白对照.主要观察指标:术后4,8.12,24周取材,行大体及组织学观察,组织学评分.结果:单纯载体组与空白对照组在各时间点大体及组织学表现相似,故一并描述,统称为对照组.24周时实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织,色泽与正常软骨相似,质韧,表面平整,与正常软骨界限消失,表面细胞平行于关节面,深层细胞排列紊乱,有柱状排列的趋势,基质异染广泛,软骨下骨形成及潮线恢复正常,与周围正常软骨连接良好.对照组缺损边缘细胞呈团块状增生,底部为纤维组织.组织学评分经统计学分析,24,12周分别与8,4周时比较差异具有显著性意义(P<0.01),各时间点实验组与对照组比较差异具有显著性意义(P<0.01).结论:用骨形态发生蛋白2和高分子透明质酸成功地在体外将骨髓基质细胞诱导为软骨细胞;聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物在新生软骨形成的同时,逐渐降解吸收,是组织工程修复关节软骨缺损适宜的支架材料.     

骨关节炎软骨细胞中血管内皮生长因子和缺氧诱导因子1α的表达及外源性透明质酸钠作用的实验研究

目的研究家兔Hulth模型骨关节炎(OA)软骨中血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达,和透明质酸(HA)的干预作用。方法采用Hulth法建立家兔骨关节炎模型,分为正常组(A组)、造模组(B组)和造模给药组(C组),进行软骨Mankin评分和免疫组织化学染色法检测软骨细胞中VEGF、HIF-1α表达。结果A组软骨细胞中VEGF和HIF-1α存在低度表达,B组和C组出现不同程度的OA软骨病变,软骨细胞中VEGF和HIF-1α表达增加;4周和8周时VEGF免疫组化阳性细胞百分数(细胞分数)差别有显著性(P<0.05);4周和8周造模组和造模给药组比较Mankin评分、VEGF细胞分数差别有显著性(P<0.05);各实验组中VEGF细胞分数和Mankin评分呈正相关(相关系数分别为r=0.891,0.917;P<0.01)。结论Hulth模型中软骨细胞VEGF和HIF-1α表达上调,关节内注射透明质酸钠延缓OA进程,同时VEGF表达水平降低。     

透明质酸钠对兔创伤性骨关节炎软骨诱导一氧化氮合酶mRNA表达的干预

背景各种关节损伤、关节手术后导致的创伤性骨关节炎较为常见,关节腔注射透明质酸钠已被视为一种治疗骨关节炎的有效手段.目的以前交叉韧带切断的方法建立兔创伤性骨关节炎模型,观察关节腔注射透明质酸钠对其关节软骨中诱导型一氧化氮合酶mRNA表达水平的影响.设计随机对照动物实验.单位武汉大学人民医院骨科.材料实验于2003-04/12在武汉大学人民医院骨科实验室完成.选取清洁级5～6月龄大耳白兔16只,随机数字表法分为透明质酸钠注射组、生理盐水对照组,8只/组.透明质酸钠(上海建华精细生物制品有限公司提供,国药准字2000第366095号).方法①两组均建立创伤性骨关节炎模型.每只兔以氯胺酮1.0 mg/kg体质量麻醉,单侧膝关节行前交叉韧带切断造模.②术后第5周,透明质酸钠注射组患膝关节腔注射质量浓度为10 g/L的透明质酸钠0.3 mL,1次/周,连续5周.生理盐水对照组注射等量生理盐水.③术后10周处死,观察两组股骨内髁关节软骨的大体形态学(0分关节面光滑,色泽正常;1分关节面粗糙,有小的裂隙,色泽灰暗;2分关节面糜烂,软骨缺损达软骨表层或中层;3分关节面溃疡形成,缺损达软骨深层;4分软骨剥脱,软骨下骨质暴露)和组织学病理变化,采用反转录聚合酶链反应方法检测软骨诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达情况.主要观察指标①两组股骨髁关节面标本大体观察结果.②两组股骨内髁软骨光镜组织学观察结果.③两组软骨诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达.结果实验选取清洁级大耳白兔16只,全部进入结果分析.①两组股骨髁关节面标本大体观察结果解剖显微镜下观察股骨髁关节面病理变化,透明质酸钠注射组软骨退变程度较生理盐水对照组明显减轻.②两组股骨内髁软骨光镜组织学观察结果透明质酸钠注射组见软骨膜变性脱落,表层软骨细胞变性、坏死、排列紊乱,形成糜烂;生理盐水对照组见软骨细胞变性、坏死,排列紊乱,溃疡病变达软骨深层,并见新生的毛细血管和成纤维细胞增生,溃疡底部见纤维组织增生.③两组软骨诱导型一氧化氮合酶mRNA的表达透明质酸钠注射组软骨诱导型一氧化氮合酶mRNA表达量均值为1.09±0.18,生理盐水对照组的表达量均值为1.26±0.23,两组基本相似(P＞0.05).结论关节腔注射透明质酸钠对早期骨关节炎软骨具有修复和保护作用,能有效减轻早期创伤性骨关节炎关节软骨的退变,对诱导型一氧化氮合酶的表达没有下调作用.