玉米浆粉预处理对粘质沙雷氏菌发酵产2-酮基-D-葡萄糖酸的影响

通过比较不同预处理方法获得的玉米浆粉在粘质沙雷氏菌SD136作用下产2-酮基-D-葡萄糖酸的影响,组合复配玉米浆粉,结果表明:最佳玉米浆粉复配比为玉米原浆粉和酶解玉米浆粉3∶1,2-酮基-D-葡萄糖酸产量达到(171.39±4.5) g/L,发酵时间由40 h缩短至37 h,对糖转化率达到95.22%。玉米原浆粉和酶解玉米浆粉的组合复配能够提高粘质沙雷氏菌SD136的发酵效率和2-酮基-D-葡萄糖酸的产量。     

2-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产研究进展

2-酮基-D-葡萄糖酸（2KGA）是合成食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠及D-异抗坏血酸的前体,通常采用细菌发酵的方法由D-葡萄糖转化而来。本文概述了2KGA的生物合成途径、2KGA产生菌的选育、2KGA的发酵条件、2KGA的发酵工艺、2KGA发酵产物的提取、国内2KGA发酵生产中存在的主要问题及改善对策等。     

基于Gluconobacter oxydans膜结合脱氢酶的静息细胞催化合成2-酮基-D-葡萄糖酸

基于G.oxydans DSM2003膜结合葡萄糖酸-2-脱氢酶（GA-2-DH）的催化特性,利用静息细胞催化技术合成D-异抗坏血酸（EA）的主要前体2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KGA）。利用高浓度底物自适应筛选技术,筛选到高产2-KGA菌株并对其摇瓶催化进行优化,优化后最适条件为：温度30℃,pH6.0,细胞浓度20g/L,底物浓度1100mmol/L,摇床转速250rmin,此时时空产率为24.68mmol/L/h;摇瓶优化工艺基础上在7L发酵罐中对重点影响参数（转速与底物浓度）进行了进一步优化,优化后2-KGA的时空产率提高到74mmol/L/h,并且催化细胞可有效重复利用3次。     

蜜蜂α-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质研究

本研究以蜜蜂腹部为材料,通过研磨进行组织破碎,然后硫酸铵沉淀、High Q离子交换层析、疏水作用层析和Superdex G-75凝胶层析,得到的α-葡萄糖苷酶在SDS-PAGE上呈单一蛋白质条带,分子量约为55kDa。以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物,研究酶催化反应动力学,结果表明：α-葡萄糖苷酶的最适反应pH范围为5.0～6.0,而pH稳定性范围为5.0～10.0。该α-葡萄糖苷酶的热稳定性比较差。其最适反应温度范围在35～45℃内。Zn2＋、Mg2＋、Mn2＋和Fe2＋对α-葡萄糖苷酶有激活作用。而Cu^2＋和Co^2＋对α-葡萄糖苷酶有抑制作用。酶动力学参数Km和Vmax分别为0.183mmol/L和0.085μmol/min·mg。     

一株2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)产生菌的发酵研究

分离到一株能产生2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)的菌株,经过16SrDNA测序,结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比较,鉴定为恶臭假单胞菌Pseudomonas putida,本实验室命名为P.putida KD-1。本文研究了培养基组成中不同碳源、氮源、初始玉米浆浓度、补加葡萄糖浓度、初始pH和发酵控制pH对P.putida KD-1发酵生产2KGA产量的影响。检测2KGA采用两种方法,碘量法和高效液相色谱法。实验结果显示,以6%的葡萄糖、1%玉米浆为初始浓度,补加5%葡萄糖,初始pH6.7,发酵维持pH5.5,200rpm,30℃恒温培养96h,2KGA产量可以达到55g/L。表明该菌的发酵过程具有一定优化空间,可作为日后发酵产2KGA的新菌种。     

添加柠檬酸促进粘质沙雷氏菌发酵产过氧化氢酶

在优化1株粘质沙雷氏菌发酵产过氧化氢酶(CAT)的培养基成分时发现,柠檬酸可以显著提高该菌胞内CAT的活力。结合先前报道,探究了柠檬酸促进粘质沙雷氏菌合成胞内CAT的原因。以等摩尔碳含量的柠檬酸、葡萄糖、柠檬酸与葡萄糖的混合物分别作为碳源,测定了在不同碳源发酵产CAT时粘质沙雷氏菌胞内抗氧化的相关数据。结果显示:添加柠檬酸(20g/L)后,该菌细胞内H_2O_2和羟自由基含量均比对照组(葡萄糖)高,说明柠檬酸代谢物对其产生了活性氧胁迫,进而诱导更多CAT的合成。考察了甲萘醌和百草枯(活性氧O~(2-)·的来源物)对该菌合成CAT的影响,实验结果验证了适量的活性氧能够诱导该菌合成CAT的结论。     

杂色鲍组织蛋白酶L的分离纯化与性质研究

通过硫酸铵分级沉淀、SP-Sepharose阳离子交换层析、Sephacryl S-200HR凝胶过滤和Hydroxyapatite羟基磷灰石层析,从杂色鲍（Haliotis diversicolor）内脏中分离纯化了组织蛋白酶L。SDS-PAGE结果显示,纯化蛋白的分子量约为28ku。该酶最适温度37℃,最适pH5.5。当温度低于40℃,pH在5.0～6.5范围内该酶较稳定。底物特异性实验与抑制剂实验结果表明,该酶属于半胱氨酸蛋白酶。金属离子Mn2＋、Ba2＋和Mg2＋对该酶有不同程度的激活作用,而Co2＋、Cu2＋、Zn2＋、Fe2＋和Ca2＋等对该酶起抑制作用。     

产毒金葡菌和粘质沙雷氏菌在蘑菇罐头中的生长及产毒、产TECRA阳性物质的规律

本文研究了产毒金葡菌(Staphylococcus aureus)、粘质沙雷氏菌(Serrolia marcescens)的纯培养物,以及pH条件变化时,它们各自与其它细菌共存时,在蘑菇罐头中的生长及产葡萄球菌肠毒素、产TECRA阳性物质的规律。并了解热处理对肠毒素和阳性物质的效应。结果表明,金葡菌和粘质沙雷氏菌均能在蘑菇罐头中生长,并产毒/产阳性物质,但罐头汤汁的pH较有利于后者的生长和产阳性物质。在混合菌相中,金葡菌是虚弱竞争者,生长及产毒均受抑制。粘质沙雷氏菌所产阳性物质与肠毒素一样,具有一定的热抗性。     

绿色木霉耐高温葡萄糖氧化酶的特性分析

从绿色木霉（Trichoderma viride）WX24菌株发酵中分离、纯化葡萄糖氧化酶（T. viride glucose oxidase,TvGOD）,研究其酶学特性,为葡萄糖氧化酶的应用提供理论基础。将绿色木霉胞外产酶发酵液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析纯化,并研究酶学性质。由十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得TvGOD表观分子质量93 kDa,达到电泳纯。经纯化,TvGOD比活力为426.67 U/mg,纯化倍数为14.36,活力回收率19.15%。TvGOD最适pH 6.0,最适反应温度60 ℃。70 ℃以下、pH 4～7之间,TvGOD稳定性好。所测金属离子中,Na＋和K＋对酶活力无影响,Fe2＋、Cu2＋和Zn2＋有轻微抑制作用,Mg2＋和Ca2＋对TvGOD有显著激活作用,而重金属离子Hg2＋和Pb2＋几乎完全抑制酶活力;丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟和金属螯合剂乙二胺四乙酸二钠对TvGOD抑制作用较为强烈;TvGOD对表面活性剂十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100和吐温80表现出强稳定性。以葡萄糖为底物,酶Km和Vmax分别为11.62 μmol/L和8.244 mmol/（L·min）。基于TvGOD在高温、酸性下的高活性与高稳定性以及对表面活性剂的高耐受性、对底物葡萄糖高亲和性等优良特性,TvGOD很有希望在面粉加工、食品饮料、饲料及生物传感器领域以及需要在高温、高酸环境下使用的生物技术工业中应用。     

产2-酮基-D-葡萄糖酸菌Serratiasp．BK-98的分离及其培养条件优化

从土壤中分离得到一株2-酮基-D-葡萄糖酸（2-KDG）产生菌,综合16SrDNA序列和系统进化分析确定该菌属于沙雷氏菌属（Serratia）,命名为Serratiasp．BK-98。采用PIackett—Burman（PB）实验设计,从影响2-酮基-D-葡萄糖酸生物合成条件的14个因素中筛选出具有显著效应的3个因子：装液量、发酵时间和初始pH。在此基础上通过中心组合设计实验（central composite design,CCD）和响应面分析（response surface methodology,RSM）确定了装液量、发酵时间和初始DH的最适值分别为6．6mL、57．9h和5．0。在优化条件下．2-KDG的100mL摇瓶发酵产量达到了187．8g／L,100L发酵罐产量达到了192．2g／L．分别较优化前提高了142．6％和148．3％．这两个实验结果均与模型的预测值191．4g／L非常接近。     

黏质沙雷氏菌胞外几丁质酶的纯化及特性

黏质沙雷氏菌几丁质酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAE-琼脂糖凝胶阴离子交换层析和苯基-琼脂糖凝胶疏水层析,得到电泳纯的几丁质酶和几丁质结合蛋白CBP21。该几丁质酶和CBP21分子质量分别约为58 ku和21 ku,CBP21对该几丁质酶水解几丁质增效明显。几丁质酶反应最适温度为50℃,最适pH约为6.5～7.0。该酶在55℃以下、pH 4.5～8.0范围内稳定。酶的Km值为0.22 mg/mL,Vm为1.26μmol/(min.mg)。金属离子K+、Sn2+、Mn2+对酶有一定激活作用,而Pb2+、Hg2+和Cu2+则强烈抑制其活性。该几丁质酶的糖基含量约为3.3%。EDTA和2-ME可分别提高酶活力65%和105%。H2O2强烈抑制酶活力,提示其活性中心可能存在硫氢基。     

重组水稻 α-半乳糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

对重组水稻α- 半乳糖苷酶的分离纯化及其酶学性质进行研究。结果表明：该重组酶分子质量约为59kD;最适酶反应温度为45℃,最适pH 值为5.0;酶活力在0～20℃,pH4.0～7.0 最为稳定;酶学动力学常数Km 为0.78mmol/L,Vmax 为10.16mmol/(mg·min)。多数的金属离子和有机离子对酶催化作用没有影响,Hg2+、Ag+及－ SH 基团抑制剂p-chloromercuribenzoic acid(pCMB)对酶活性有强烈抑制作用。     

毕赤酵母液态木聚糖酶的酶学特性研究

研究了毕赤酵母液态木聚糖酶的部分酶学特性,包括其最适温度、最适pH、温度稳定性和热失活动力学、pH稳定性和pH失活动力学,以及金属离子、有机溶剂对毕赤酵母液态木聚糖酶酶活特性的影响。结果表明,毕赤酵母液态木聚糖酶的最适温度为55℃、最适pH为pH5.6;温度为25℃时,pH5.6-6.4该液态木聚糖酶失活速率缓慢。毕赤酵母液态木聚糖酶在50℃以下在150 min内比较稳定的,70℃在30 min内几乎全部失活。Cu2+,Zn2+,Fe3+表现为不同程度的抑制作用。Mn2+,Mg2+对木聚糖有激活作用。乙醇和甘油对毕赤酵母液态木聚糖酶有轻微的抑制作用,蔗糖和Vc对毕赤酵母液态木聚糖酶有不同程度的激活作用。     

高产单宁酶泡盛曲霉Aspergillus awamori FUYN206的筛选及所产胞外单宁酶的稳定性研究

首次从云南红茶中分离筛选到1株高产单宁酶的真菌菌株Aspergillus awamor,其在pH5.0、30℃培养72h后所产胞外单宁酶活力达162.84U/mL。酶活稳定性研究表明,该菌株所产胞外单宁酶在储存4和12周后仍保存98.02%和90.49%的酶活力;所产胞外单宁酶最适酶促反应温度为40℃,且耐高温性能优越,90℃水浴1h仍保留有88%的酶活;pH3.0～6.5范围内酶活均较稳定,酶促反应最适pH5.5;K+、Ag+、Zn2+等金属离子能促进胞外单宁酶酶促反应,而Na+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ba2+等金属离子在不同程度上抑制酶促反应,其中Co2+、Cu2+的抑制作用最强。     

用于高果糖浆制备的宛氏拟青霉嗜热嗜酸菊粉酶酶学特性分析

为实现酶法水解菊糖制备高果糖浆,从宛氏拟青霉（Paecilomyces variotii）XS27发酵液中分离纯化菊粉酶,并对其酶学特性进行研究。发酵液经过硫酸铵盐析、透析、DEAE-Sepharose Fast Flow层析、Sephacry S-100分子筛过滤层析,得到电泳纯的菊粉酶,比活力327.4 U/mg,纯化倍数37.85。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳测得菊粉酶为单一亚基的酶蛋白,分子质量62.0 kDa。菊粉酶能在较宽的pH值范围（3.5～6.5）内保持高活性,最适作用pH 4.0。在温度40～65 ℃之间,酶活力较高,最适作用温度为60 ℃。薄层色谱分析显示菊粉酶水解菊糖最终产物为果糖。以菊糖为底物,酶的Km和Vmax分别为5.93 μmol/L和75.18 μmol/（L·min）。Mg2＋、Mn2＋、Ca2＋对酶有显著激活作用,Ba2＋、Ni2＋和Hg2＋对酶有一定抑制作用。β-巯基乙醇、二硫苏糖醇和乙二胺四乙酸对酶有抑制作用,表面活性剂（十二烷基硫酸钠、Tween 80和Trition X100）以及乙醇对酶活力没有影响。从宛氏拟青霉XS27发酵液中分离纯化的菊粉酶在强酸高热的环境下具有强活性和稳定性,对表面活性剂乙醇有高耐受性,适合于果葡糖浆的工业化生产。     

杂优-2平菇漆酶的分离纯化及酶学性质

将杂优-2平菇菌丝进行液体培养,发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE（diethylaminoethyl）-Sepharose fastflow层析和Superdex-200 prep grade层析等方法纯化,获得了电泳纯的杂优-2平菇漆酶,并对纯化的漆酶进行了部分酶学性质研究。结果显示,杂优-2平菇漆酶比活力为115 U/mg,分子质量约为244.0 kD,亚基分子质量约为85.6 kD。最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55 ℃,在pH 6.0～8.0及40～55 ℃范围内稳定性较好;最适条件下,以2,2’-联氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）为底物的Km值为2.1 mmol/L,最大反应速率（vmax）为0.117 μmol/（min·L）。Fe2＋、抗坏血酸对该酶活性具有完全抑制作用,乙二胺四乙酸、Ag＋、Mg2＋、Li＋对该酶活性影响较小;草酸、甲醇、正丁醇、K＋、Ca2＋、Ba2＋、Zn2＋、Cd2＋、Pb2＋、Mn2＋、Co2＋对该酶活性有不同程度的抑制作用;Cu2＋激活作用不明显;尿素、乙醇、异丙醇对该酶活性具有激活作用。     

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae Ma83)几丁质酶的纯化及性质

由金龟子绿僵茵Ma83菌株产生的几丁质酶经硫酸铵盐盐析,Sephadex G-100柱层析,DEAE-纤维素柱层析分离纯化后,得到SDS-PAGE均一样品.酶的最适反应温度为50℃,半失活温度为65℃;酶的最适反应pH值为5.0,酶在pH4.0～7.0范围内较稳定.Ag+、Co2+、K+、Mg2+对Ma83几丁质酶有激活作用,而Hg2+、Zn2+、Pb2+对几丁质酶活力有抑制作用.经计算Ma83菌株几丁质酶对胶体几丁质的Km值为1.05 mg/mL.     

不同因素对松花粉中脂肪酶活力的影响

为研究松花粉中脂肪酶的最适反应条件,考察了温度(℃)、pH、底物、金属离子等因素对其酶活的影响。通过脂肪酶的催化水解作用,以95%乙醇终止反应,测定其酸价,进而求得酶活,并选择出脂肪酶的最适反应条件。结果表明,最佳反应条件为:温度35℃,pH7.4,底物为三丁酸甘油酯,Ca2+、Fe3+、Mg2+、Fe2+会提高脂肪酶活力。     

鸭卵清溶菌酶的分离纯化及性质

通过硫酸铵的分级沉淀、CM-Sepharose阳离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等步骤,从鸭卵清中获得电泳纯的溶菌酶,该酶的比活力达到33687.26U/mg,纯化倍数为109.44,回收率为28.00%。测得该酶分子质量约为14.82kD,对溶壁微球菌的最适反应温度为50℃,最适pH值为7,且在50℃以下及pH5～9有较好的稳定性,同时在最适条件下测得其Km值为0.0864mg/mL。Fe2+、Mg2+、Mn2+等金属离子对该酶有较强的抑制作用,而Zn2+、Cu2+、Co2+对该酶有一定的激活作用。     

一株产α-淀粉酶菌株的分离筛选、鉴定及酶学性质研究

为了更加经济、更高产量的分离出高纯酶,该实验从富含淀粉的土壤中筛选出1株高产淀粉酶的菌株LZ-10,通过菌落形态观察、生理生化特性实验、16S rDNA序列和gyrB基因序列分析对其进行鉴定。采用硫酸铵盐析,DEAE-52阴离子交换纤维素纯化,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测蛋白分子质量。结果表明,菌株LZ-10鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。纯化后的淀粉酶比活力为59.91 U/mg,纯化倍数为4.53,回收率为60.5%,分子质量为55.4 kDa。对其酶学性质进行研究,得出菌株LZ-10所产淀粉酶最大酶活力为41.6 U/mL,最适作用温度为50 ℃,在50～70 ℃温度环境下其稳定性较高;最适pH值为7.0,在pH=5.0～7.0的环境条件下稳定性较高;Ca2+、Mg2+、Na+、K+对淀粉酶有激活作用;乙二胺四乙酸（EDTA）、Fe2+、Zn2+对淀粉酶有抑制作用。