应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分

参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光聚合酶链式反应法》,以牛的生长激素（growth hormone,GH）基因和猪的朊蛋白（prion protein,PRNP）基因2 种核基因为靶基因合成特异性引物和探针。理论推导单位质量牛肉的GH基因与猪肉PRNP基因拷贝数之比为一固定值,通过微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）方法对该固定值进行检测和验证,并以该固定值对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量检测。结果表明：该方法具有良好的准确性及可重复性;牛肉中掺杂猪肉质量分数在5%～99%范围内时,检测结果绝对误差小于1.28%,变异系数小于6.5%,猪肉成分的回收率为99.09%～102.80%;20 份牛肉制品中,4 份检出猪肉成分,其中3 份的相对含量为29.19%～98.15%,1 份为0.12%（低于本方法检出限5%）。因此,ddPCR方法可以较好地应用于牛肉制品中掺杂猪肉成分的定量检测。     

食品中羊肉源性成分微滴数字PCR定量方法的建立

为了对肉制品中羊肉源性成分进行准确定量,该研究采用微滴数字PCR(dd PCR)技术对羊肉的单拷贝基因进行定量检测,根据基因拷贝数建立肉制品中羊肉源性成分dd PCR的定量检测方法。结果表明,通过向样品中添加牛肉作为内标,建立了基于DNA拷贝数与样品质量间线性关系对羊肉源性成分进行dd PCR内标定量的方法,实现了从靶基因拷贝数到样品质量间的一步转化。该方法在检测出0. 01%的羊肉源性成分时,检测结果达0. 12 copies/μL,能够对含量5%以上的羊肉源性成分进行准确定量。通过对已知成分的混合样品和市售样品进行检测,显示该方法能够准确检出不同样品中羊肉源性成分含量。因此,该方法在肉及肉制品中羊肉源性成分检测和掺假鉴别方面具有较大应用潜力。     

应用荧光聚合酶链式反应检测冷冻羊肉卷中羊肉的含量

目的:探索应用荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法检测冷冻羊肉卷中羊肉含量。方法:以羊线粒体细胞色素B基因为羊特异性基因,线粒体12S rRNA为内参基因,应用ΔCt法对羊肉含量进行相对定量,并与称重法进行比较,分析基因拷贝数和羊肉脂肪含量对定量结果的影响。结果:荧光PCR法建立的标准曲线在羊肉含量为1%~100%时具有良好的线性关系(R~2=0.990 1)。检测7个市售冷冻羊肉卷样品,荧光PCR方法检测出的羊肉含量与称重法羊肉含量的相关系数为0.945 0(P0.001),平均绝对差异为-11.0%,95%可信区间为(-7.4%,-14.6%)。基因拷贝数不同和羊肉脂肪含量不同对内参基因扩增Ct值影响没有统计学意义(P值分别为0.072和0.206)。结论:荧光PCR法可用于快速检测冷冻羊肉卷中羊肉成分的相对定量。     

实时荧光PCR定量测定肉制品中羊源性成分

为准确定量肉制品中羊源性成分的含量,以羊单拷贝基因为扩增靶基因,设计合成羊源的引物、探针,制备羊源和脊椎动物通用基因的重组质粒以构建标准曲线,通过方程算出各自的拷贝数,根据拷贝数的比值计算样品中羊肉源成分占总肉成分的百分比含量,建立荧光定量PCR检测体系,并对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测。结果显示,该方法具有良好的特异性和灵敏度,最低检测到羊的DNA含量为0.02 ng/μL。对已知目标肉含量的混合肉样进行定量检测发现,羊肉掺入量为90%、50%时所得结果相对准确,相对标准偏差分别为5.69%和10.82%, 且不受外源物种的干扰。本试验建立的定量PCR方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现存在掺假现象。     

利用多重PCR-RFLP同时检测羊肉及掺杂其中的肉类

以纯羊肉为原料,按2%、5%和10%的重量比在羊肉中掺杂鸡肉、猪肉和鼠肉,通过基因组DNA提取试剂盒法提取DNA,利用多重多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)及限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)分析同时检测羊肉及掺杂其中的其他肉类。结果表明,通过多重PCR扩增,可以有效的检测出纯羊肉及其掺杂的鸡肉、猪肉和鼠肉,检出限为2%。     

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术的肉制品中鸭源性成分的定量检测

为实现肉制品中鸭源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）技术,以鸭生长激素（growth hormone,GH）基因为靶基因,建立肉制品中鸭源性成分的定量检测方法。结果表明：所建立的ddPCR方法能特异性检测鸭源性成分,灵敏性为11.1 copies/μL;根据鸭肉粉质量（mg）与DNA质量浓度（ng/μL）、DNA质量浓度（ng/μL）与鸭GH基因拷贝数浓度（copies/μL）之间的线性关系,建立鸭肉粉质量（x）与鸭GH基因拷贝数浓度（y）之间的关系式为 x =(n * y)/725.046 - n/1317.06 + 0.153;模拟混合样本中鸭肉粉质量分数5%～100%时,鸭源性成分检测的绝对误差均小于±1.52%,变异系数均小于10.38%,回收率为98.35%～125.32%;在88 份商品化肉制品中,11 份肉制品中检出鸭源性成分,检出率为12.5%,且鸭源性成分含量为18.6%～87.4%。本研究所建立的鸭源性成分ddPCR方法有较好的准确性和较强的适用性,能够应用于肉制品中鸭源性成分的定量检测。     

肉制品中羊源性成分微滴数字PCR法定量检测方法的研究

为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量,建立了微滴数字PCR定量检测系统。结果显示在一定范围内羊肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,选择DNA含量作为中间换算值,计算出羊肉的质量与拷贝数之间的关系为M_羊=0.03C+0.69。应用建立的微滴数字PCR定量检测方法对已知质量分数的羊肉模拟混合样品进行检测,发现无论在两两混合还是多肉样混合的情况下,其含量偏差最大为1.52%,具有较强的抗干扰能力。通过对市售样品的检测,显示该方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现可能存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。     

多重微滴式数字PCR定量检测市售核桃乳中核桃、大豆源性成分

目的:为市售核桃乳中核桃源及主要掺杂物种大豆两种源性成分建立准确、快速定量检测方法。方法:从植物组织(核桃、大豆)或是植物蛋白饮料(核桃乳饮料)提取核酸后,主要采用多重微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,测算单位质量核桃和大豆的目的基因拷贝数比值,建立基因拷贝数与质量之间的关系,进而利用该比例关系换算出植物蛋白饮料中核桃和大豆的投料量,以实现对植物蛋白饮料中植物源性成分的定量检测。结果:基于多重微滴式数字PCR定量检测市售产品中大豆和核桃源性组分的方法,引物探针特异性好,目标物种间无交叉反应;灵敏度高,核桃中掺杂大豆的质量检测限为0.5%,相对误差为5.6%。将单一源性5种不同质量下靶基因拷贝数之比与5种不同比例混合源性靶基因拷贝数之比通过重复3次检测,综合比较并拟合后得到单位质量下拷贝数(C_(大豆)/C_(核桃)=1.771 1)的换算比例值。在从商品超市中抽取的11份不同品牌的核桃乳中(仅含核桃一种植物源成分),多重微滴式数字PCR方法检测显示:11份样品均检出核桃源性成分,6份样品检出大豆源性成分,其中4份样品中大豆与核桃质量之比高于10%,判断存在掺杂使假;2份样品大豆与核桃质量之比低于0.2%,极低的检出量推断为工艺沾染。结论:采用多重微滴式数字PCR准确、快速的定量方法可作为鉴别核桃乳中掺杂使假问题的有效手段。     

微滴式数字PCR对肉制品中羊肉和猪肉定量分析

为了实现肉制品中羊肉和猪肉的量化研究,本文应用微滴式数字PCR对肉制品进行定量检测。通过在看家基因上设计单拷贝特异性引物,能更好的鉴别是人为因素的掺假还是在加工过程中无意的带入。根据dd PCR的结果显示,在一定范围肉质量和DNA的浓度,DNA浓度和DNA拷贝数(C)成现一定的线性关系。通过人为掺假及市售样品检测以验证此方法。以DNA浓度作为中间换算值,得到肉质量和DNA拷贝数之间的换算关系M_羊=0.12C-10.6 M_猪=0.07C+4。通过对已知掺假比例的肉样及市售样品进行检测,能够较好的得到掺假肉的质量。目前市场上存在一定的掺假现象且该检测方法具有一定市场应用前景,本文建立的微滴式数字PCR在羊肉和猪肉及其制品中的掺假检测具有较强的应用潜力,对目前混乱的肉制品掺假的市场监管提供了科学的依据。     

微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）,以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明：所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量（mg）与DNA质量浓度（ng/μL）、DNA质量浓度（ng/μL）与基因拷贝数浓度（copies/μL）之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量（x1）与基因拷贝数浓度（ y 2） 之间的关系式为： 鸡：x1=（n*y2）/273.946 - n/886.557 + 0.216; 猪：x1=（n*y2）/64.950 + n/60.644 + 0.215; 牛：x1=（n*y2）/62.839 + n/12.646 + 1.218（n为稀释倍数）;基于建立的ddPCR方法对64 份市售不同种类香肠样品进行检测,在1 份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。     

应用实时荧光PCR技术量化检测羊肉中猪源性和鸡源性成份

目的建立羊肉中猪源性成份和鸡源性成份的定量检测方法。方法以新鲜羊、猪和鸡瘦肉为样本提取DNA分子作为检测模板,针对基因组中单拷贝基因设计特异性的引物和探针,应用荧光实时定量PCR技术对模板DNA进行扩增。通过绘制扩增标准曲线和确定羊、猪和鸡的质量与DNA比值常数,对4种不同掺混比例的混合肉样进行定量分析。结果检测质量百分比的绝对误差可以控制在7%以内,量化结果基本准确。结论对于组织成份单一的样品,可以通过在基因组单拷贝基因上设计特异性的引物,利用PCR技术实现在质量水平上对食品中动物源性成份的量化分析,该技术方法的建立可以为肉类掺假的监管工作提供有力的技术支撑。     

基于COI序列的DNA微条形码技术鉴别熟肉制品中11种肉掺假的研究

建立并优化了基于COI序列的DNA微条形码技术（mini-barcoding）检测熟肉制品中11种常见肉类掺假的方法。样品经超声与真空冷冻干燥处理,提取DNA模板和PCR扩增后,目标扩增物经切胶纯化后进行克隆测序,并将测序结果提交GenBank数据库Blast比对。筛选出适合猪、牛、羊、鸡、鸭、鸽子、马、驴、鹅、兔、鼠11种肉类的扩增的通用引物COI-A,对PCR扩增条件进行优化,并建立18个掺假模式,对低经济价值肉类（猪、鸡、鸭、马、驴、鼠）的掺入的最低比例进行考察。结果表明:11种熟肉的DNA经通用引物COI-A扩增后,其扩增效率均为100%,18个掺假模式中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类的最低检出比例为5%,而掺入鸡肉的最低检出比例为10%,而鹅肉、鸽子肉和兔肉的掺假模式中最低检出比例为10%;利用本方法检测30批次市售样品,发现有18批次的熟肉制品存在掺假情况。该方法前处理简单,灵敏度合适,重现性好,可作为高经济价值熟肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。     

非标记蛋白定量方法在掺假肉鉴别中的应用

目的建立一种非标记蛋白定量法鉴别牛肉或羊肉中是否掺假。方法采用四极杆串联飞行时间高分辨质谱分析各种肉类蛋白酶解之后的样品,找到每种肉类特异的肽段,再用串联四极杆质谱测定特异肽段的定量结果,判定样本中是否有这种肉类存在。结果在测定的牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉和鸭肉样本中,均找到每种肉类的特异肽段5～7条,从每种肉中选择3条肽段进行定量分析,可以很好地鉴别出牛羊肉中掺杂的其他肉类。结论该方法操作简便,结果可靠,灵敏度高,可用于在牛肉或羊肉中掺杂其他肉类的鉴别。     

基于实时荧光PCR对肉制品中羊肉的精确定量

该研究将实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescence quantitative PCR,rPCR)与微滴式数字PCR技术(micro-droplet digital PCR,ddPCR)相结合,利用ddPCR建立拷贝数和羊肉质量的函数关系,确立了基于rPCR定量检测羊肉含量的方法。特异性实验结果表明,除绵羊和山羊外,非目标物种DNA未出现特异性扩增;灵敏度实验结果表明,该方法的最低检出限为0.01 ng/μL;通过对已知成分的混合样品和市售样品的检测表明,该方法能够对含量在5%以上的羊肉进行准确定量。因此,该方法在肉制品中羊肉含量检测和掺假鉴别方面具有较好应用潜力。     

近红外光谱技术在肉类定性鉴别中的研究进展

近红外光谱技术作为新型的快速绿色检测技术,在肉类工业中得到了广泛的应用。本文综述了近红外光谱技术在肉类定性鉴别中的研究进展,主要包括在肉的等级鉴别、品种鉴别、物种鉴别以及产地溯源、饲喂方式中的鉴别研究。肉的等级一般人工分为RFN、PFN、PSE、RSE四类,近红外光谱对肉的等级鉴别正确率在80%以上;对于同一物种不同品种肉的研究主要是在猪肉、牛肉上,主要通过多元定量校正方法或判别分析法来鉴别同一物种不同品种、不同年龄阶段的肉,且鉴别正确率大于95%;在不同物种之间的鉴别主要应用于鉴别猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉等不同物种以及掺假肉,鉴别正确率在90%以上;在产地溯源、不同饲喂方式之间的鉴别,能够正确鉴别牧草和浓缩料饲喂的羔羊、母羊和人工饲喂的羔羊、不同地区的牛肉以及羊肉的产地溯源等,鉴别正确率大于83%。综上所述,近红外光谱在肉类定性鉴别中可行。     

2013年苏州地区肉及其制品掺假情况调查

了解苏州地区肉及其制品的掺假情况,通过对肉类种源与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品,为加强食品标签管理提供依据。方法 运用自建的动物源性食品种源判定Taqman实时荧光PCR检测体系对苏州地区的肉及其制品进行种源判定,与标签明示肉源进行比对,鉴别摻假食品。结果 本次调查共检验涉及32个生产单位的90份样品,总不符合率为25.6%(23/90)。检测的44份牛肉及其制品中有12份与标签不符,8份用猪肉部分替代牛肉,1份以鸭肉部分代替牛肉进行销售;此外有3份不含有牛肉成分,存在猪、鸡、鸭源性肉类之外的肉类成分。共检测羊肉及其制品16份,有2份用鸭肉代替羊肉出售,3份羊肉样品中掺入了部分猪成分,其中1份样品还存在单个样品掺杂两种外源肉类的现象(猪源性和鸭源性)。检测猪肉及其制品19份,其中2份样品含有标签未注明的鸡肉成分。在所检测的11份混合肉类样品中有4份成分与标签不符,主要是以廉价的鸡肉取代/部分取代相对高价的牛肉和猪肉。结论 肉制品掺假情况明显,用猪肉、鸭肉部分代替牛肉和羊肉仍是主要的掺假手段,牛肉掺假样品主要是熟制牛肉制品,而火锅食用羊肉卷样品则是羊肉掺假高危品,开展肉制品摻假检测对规范肉制品市场具有积极意义。此外,3份未知种源成分的牛肉样品提示在现有检测基础上还需扩大检测范围,防患于未然。     

Acceptability of Flavor, Texture, and Appearance in Mutton Processed Meat Products Made by Smoking, Curing, Spicing, Adding Starter Cultures and Modifying Fat Source

Mutton meat was tested as the main ingredient, in different processed meat items to obtain prototype products lacking objectionable mutton off-flavors. Four consumer-preference sensory panel sessions were conducted to rate these products against beef or pork controls. Sensory panel results indicated that compared to texture and appearance parameters, flavor had more effect on overall acceptability of these products. Objectionable mutton flavor was apparently reduced by: (1) reducing mutton fat to a level of 10% or less, and (2) using spices, smoking, and/or curing.     

实时荧光PCR定量检测肉制品中猪源性成分

为了准确可靠地对肉制品中猪源性成分进行定量检测,通过生物信息学方法筛选到猪细胞核单拷贝基因(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 2-like,CACA).以CACA基因为扩增靶标,设计了特异性引物、TaqMan探针,建立了基于实时荧光定量PCR...