骨髓间充质干细胞成肌诱导后移植对延缓失神经肌肉萎缩的作用

目的:实验将化学和应力协同诱导后的大鼠骨髓间充质干细胞移植到失神经骨骼肌内,观察体内的成肌效应,以达到延缓失神经骨骼肌萎缩的目的.方法:实验于2007-04/10在上海交通大学医学院附属新华医院动物实验中心和中心实验室完成.①实验材料:SD大鼠由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:采用密度梯度离心法分离培养雄性SD大鼠股骨、胫骨中骨髓间充质干细胞.取第3代细胞进行化学诱导后,再进行应力诱导,于移植前1d以DAPI标记.取8周龄SD大鼠36只,随机分为对照组与实验组,18只,组.两组均切断大鼠左侧后肢坐骨神经,并造成1 cm神经缺损,形成失神经支配腓肠肌动物模型.实验组大鼠腓肠肌的内、外侧头经皮注入骨髓间充质干细胞,对照组大鼠以同样方法注入无细胞、不含胎牛血清低糖DMEM培养液.⑨实验评估:术后第4,8,12周检测大鼠双侧腓肠肌运动单位电位及纤颤电位,取双侧腓肠肌测定肌湿重,然后行苏木精-伊红染色,并作图象分析,测定肌纤维横截面积,采用BCA法测双侧腓肠肌蛋白总量.结果:①切断坐骨神经后2周大鼠腓肠肌均发生不同程度的萎缩.左侧腓肠肌运动单位电位波形逐渐变单一,时限逐渐延长,电压逐渐变小,纤颤电位的正向波逐渐增多.4、8周时实验组与对照组有差异,12周时两组无差异.②实验组骨髓间充质干细胞移植处可观察到带荧光的细胞核及肌纤维,对照组未见此现象.实验组第4,8周失神经支配腓肠肌湿重残存率、腓肠肌纤维横截面积残存率、蛋白总量残存率均明显低于对照组(P<0.01),12周时两组差异无统计学意义.结论:骨髓间充质干细胞移植到失神经骨骼肌内可明显延缓失神经支配骨骼肌的萎缩,并且这一作用只在细胞移植8周以内比较明显.     

弱激光对兔失神经肌肉萎缩的防治作用

目的:观察弱激光对失神经肌萎缩的防治作用。方法:取健康雄性家兔30只,随机分为对照组(CON组),失神经肌萎缩组(DM组)和弱激光治疗+失神经肌萎缩组(LDM组),DM和LDM组采用家兔胫神经切断后制作失神经腓肠肌肌萎缩模型,进行HE染色及免疫组化研究,检测肌湿重,肌肉横断面面积及Bcl-2表达强度的差异。结果:与DM组比较,LDM组腓肠肌湿重、肌肉横截面面积和Bcl-2表达均有明显差异(P0.05)。结论:弱激光治疗可防治失神经引起的肌肉萎缩。     

带神经血管肌束分点植入后失神经肌肉形态学改变

背景:失神经支配的肌萎缩一直是临床治疗的难点,目前仍没有突破性的研究成果。目的:观察带神经血管的肌束分点植入后对失神经支配肌肉形态学影响,探求一种失神经支配肌萎缩研究的新思路。设计、时间及地点:同体对照动物实验,于2006-07/2007-12在南京鼓楼医院手外科完成。材料:清洁级健康Wistar大白鼠30只,雌雄不限,体质量250g左右。方法:建立大鼠双下肢腓肠肌外侧头失神经支配模型。其中右侧在腓肠肌外侧头肌腹中远1/3处做两切口,用比目鱼肌作成带神经血管肌束,分点植入失神经支配肌肉内,作为实验组。左侧只切断腓肠肌外侧头肌支作为对照组。分别于术后4,8,12周取材。主要观察指标:观察肌肉外观、超微结构变化,测定肌纤维周径及截面积、胶原纤维含量。结果:①实验侧的腓肠肌饱满、有弹性、色泽好、切之出血多。对照组肌肉萎缩变细、色泽灰白、切之出血少。②各时间点实验组肌细胞周长和肌肉纤维横截面积测量值大于对照组(P均<0.01);胶原纤维含量低于对照组(P<0.01)。③实验组细胞核基本正常,肌膜光滑,肌纤维间距小,线粒体数量多、嵴完整。对照组肌肉细胞核变形、空泡化,肌膜呈乳突样改变,肌纤维明显变细,间距增大,线粒体数量少、出现空泡化及絮状化,脂滴增多。结论:带神经血管肌束分点植入法是一种延缓失神经支配肌肉萎缩的有效方法。     

失神经骨骼肌萎缩中泛素蛋白连接酶Murf1和核转录因子NF-κB表达与被动运动干预

背景：蛋白质分解是延缓肌萎缩发生的关键环节,在慢性病性、制动性肌萎缩中泛素蛋白连接酶Murf1和核转录因子NF-κB的表达增加,被动运动已被证实可以有效抑制肌萎缩的发生。目的：探讨泛素蛋白连接酶Murf1和核转录因子NF-κB在大鼠失神经肌萎缩中不同时段的表达,以及被动运动对失神经骨骼肌Murf1和NF-κB表达的影响。方法：假手术组大鼠不切断右下肢坐骨神经,失神经组、失神经被动运动组大鼠切断右下肢坐骨神经。术后1d起,将失神经被动运动组大鼠置于自制的网夹内,拉出右后肢,抓住趾部,与脊柱呈45°向后外方牵拉,至右后肢完全伸直,再将右后肢推向身体,使之完全屈曲紧贴身体,每天训练2次,每次屈伸运动300下,3min/次,直至切取标本之日。干预2,14,28d后,采用RT-PCR与WesternBlot技术分别检测Murf1,NF-κBmRNA和蛋白质的表达。结果与结论：与假手术组比较,各时间点失神经组Murf1,NF-κBmRNA及蛋白的表达均明显增加（P〈0.05）;与失神经组比较,各时间点失神经被动运动组Murf1及NF-κBmRNA的表达均显著降低（P〈0.01）。失神经支配后肌湿质量比明显下降,被动运动14d时肌湿质量比明显高于失神经组（P〈0.05）。失神经腓肠肌中Murf1,NF-κBmRNA和蛋白的表达与肌湿质量呈负相关（r=-0.795,P〈0.01;r=-0.834,P〈0.01）,提示被动运动可能通过降低Murf1和NF-κB的表达发挥肌萎缩防治作用。     

脐带间充质干细胞移植可延缓大鼠失神经肌肉的萎缩

背景：周围神经断伤后生长缓慢,失神经支配的肌肉萎缩及运动终板纤维化,导致肢体功能不可逆障碍。脐带间充质干细胞已经广泛应用于多学科研究,但应用于周围神经损伤中延缓大鼠失神经肌肉萎缩鲜有报道。目的：观察异种异基因脐带间充干细胞移植于大鼠离断坐骨神经断端,延缓失神经肌肉萎缩的效果。 方法：新鲜脐带采集于健康足月产妇,分离鉴定脐带间充质干细胞。制备大鼠坐骨神经SunderlandⅣ度损伤模型,去神经束5 mm,神经外膜修复,5 mm小间隙移植脐带间充质干细胞模型,对照组仅在小间隙内注入同体积生理盐水。测定大鼠坐骨神经功能指数,小腿三头肌湿质量,坐骨神经干潜伏期、动作电位传导速度、波幅,以及骨骼肌纤维横截面积维持率。 结果与结论：造模后4,8及12周,脐带间充质干细胞组大鼠坐骨神经功能指数、右侧小腿三头肌湿质量及骨骼肌纤维横截面积维持率均显著高于对照组（P〈0.05）。造模后12周肌电图显示,脐带间充质干细胞组大鼠坐骨神经干潜伏期显著低于对照组,动作电位传导速度及波幅显著高于生理盐水对照组（P ＆lt;0.001）。提示脐带间充质干细胞移植于大鼠离断的坐骨神经断端,可促进神经生长,延缓失神经肌肉萎缩,维持失神经肌肉形态及功能。     

神经干细胞移植联合脑源性神经营养因子局部注射对老年性痴呆鼠海马线粒体膜电位及行为学的影响

背景：移植神经干细胞的分化受移植部位微环境、各种生长及细胞因子的影响。目的：实验拟观察神经干细胞移植与脑源性神经营养因子联合应用列老年性痴呆鼠行为学恢复及海马线粒体膜的影响。设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2006-09／2007-09在重庆医科大学动物实验室及细胞实验室完成。材料：神经干细胞来源于新生1d龄SD大鼠。Y迷宫筛选对电击敏感并逃避迅速的三四月龄健康雄性SD大鼠，随机分成4组：正常对照组、神经干细胞组、脑源性神经营养因子组、联合组移植，每组10只。方法：分离培养大鼠神经干细胞。参照包新民等的大鼠脑立体定位图谱制备老年性痴呆大鼠模型。造模后，神经干细胞组双侧海马区注射神经千细胞，脑源性神经营养因子组双侧海马区注射脑源性神经营养因子，联合移植组注射神经干细胞同时持续恻脑室注射脑源性神经营养因子。主要观察指标：用分子生物学检测老年性痴呆大鼠海马线粒体膜电位的变化，行Y迷宫试验观察大鼠行为学中学习记忆能力。结果：联合移植组老年性痴呆大鼠海马线粒体膜电位明显升高，并高于神经干细胞组、脑源性神经营养因子（P〈0．05），与正常对照组比较无明显差异。脑源性神经营养因子组、神经干细胞组学习记忆能力虽有明显恢复，但与联合移植组和正常对照组比较还有定的距离（P〈0．05）。结论：神经干细胞与脑源性神经营养因子联合应用能能稳定海马线粒体功能，从而抑制神经细胞凋亡，能改善老年性痴呆箭的学习记忆功能障碍。     

神经生长因子对失神经支配大鼠骨小梁形态计量的影响

目的：通过骨形态计量学方法研究神经生长因子(NGF)对大鼠失神经支配后骨结构变化的影响，探讨NGF对神经源性骨质疏松的意义。方法：雄性SD大鼠随机分为对照组和失神经组，切断失神经组大鼠股骨神经造成失神经支配模型，然后分为失神经支配对照和NGF注射失神经支配组。30天后取股骨进行骨计量学检查。结果：大鼠失神经支配后于腓肠肌两侧注射NGF30天后，与未注射组相比具有较高的小梁骨量，提示局部予以NGF治疗可明显减轻失神经支配后大鼠骨质疏松的程度。结论：NGF在神经性瘫痪后的康复治疗中具有积极意义。     

差速贴壁法体外培养失神经骨骼肌肌源性干细胞的生物学特性

目的：探讨失神经过程中的肌源性干细胞的生物学特性，掌握其分离、培养及鉴定方法，了解其生长规律并进行体内定位。 方法：实验于2004-01／2005—10华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科完成。选取清洁级3周龄昆明种小鼠5只，切断小鼠双侧坐骨神经．造成失神经损伤模型。采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化法及差速贴壁法分离细胞获取小鼠肌源性干细胞，进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态，通过生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力，利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。 结果：①失神经骨骼肌内肌源性干细胞生长特性：失神经骨骼肌肌源性干细胞原代培养时细胞贴壁及生长较慢，1个月后才进行传代。传代培养3d后部分细胞呈梭形，成簇状生长。7-10d后大部分为梭形和多形状，细胞间相互出现成片融合，此后细胞生长速度放慢。②失神经骨骼肌肌源性干细胞生长曲线的绘制：细胞培养前3d细胞生长慢，3d后生长明显加快．7d后生长明显放慢，进入平台期。③失神经骨骼肌内肌源性干细胞的表型鉴定：细胞质CD34和Sca-1染色均呈阳性，细胞核大。④失神经骨骼肌内肌源性干细胞的体内定位：CD34和Sea-1阳性细胞位于肌细胞和基底膜之间，细胞小，细胞数量较少。 结论：采用差速贴壁法可从失神经骨骼肌内分离出肌源性干细胞，体外培养的肌源性干细胞具有良好的增殖能力，适用于组织工程和基因治疗。     

低频电刺激对坐骨神经损伤大鼠不同类型骨骼肌萎缩及内源性胰岛素样生长因子1表达的影响

背景：低频电刺激可以缓解骨骼肌的萎缩,但对肌纤维类型的影响尚不清楚,同时内源性胰岛素样生长因子1在萎缩后的肌纤维中的表达与电刺激的关系尚无公识。目的：观察低频电刺激对坐骨神经损伤大鼠不同类型骨骼肌纤维萎缩情况及内源性胰岛素样生长因子1表达的影响。方法：将健康雄性SD大鼠随机分为3组,切断模型组和电刺激组大鼠左侧坐骨神经制备失神经支配模型,适应5d后,对电刺激组大鼠损伤侧腓肠肌施以2Hz的电刺激,2次/d,每次持续20min,正常组和模型组常规饲养。30d后,取大鼠腓肠肌腹部,检测其肌纤维直径和数量;免疫组织化学法检测肌组织中胰岛素样生长因子1的水平。结果与结论：失神经支配后,大鼠腓肠肌Ⅰ、Ⅱ型肌纤维直径减小,Ⅰ型肌纤维数比例增大。与模型组比较,电刺激组大鼠腓肠肌Ⅰ、Ⅱ型肌纤维直径有所增大,尤以Ⅰ型肌纤维直径增大更明显（P〈0.05）。同时,电刺激组大鼠腓肠肌中胰岛素样生长因子1的表达也明显高于模型组（P〈0.05）。提示,2Hz的电刺激可促进胰岛素样生长因子1的表达,减轻Ⅰ型肌纤维的萎缩。     

酸性成纤维细胞生长因子预防失神经支配肌运动终板退变的酶组织化学变化

目的：观察大鼠右侧腓总神经损伤局部植入酸性成纤维细胞生长因子纤维蛋白凝胶载体后的形态学及酶组织化学的变化。 方法：实验于2005-07／10在南方医科大学珠江医院完成。①选取清洁级SD大鼠30只，随机分为3组：酸性成纤维细胞生长因子＋纤维蛋白凝胶载体组、单纯纤维蛋白凝胶载体组、空白对照组，10只／组。②各组大鼠全麻状态下均切断右侧腓总神经，距神经入肌点约1cm处。酸性成纤维细胞生长因子＋纤维蛋白凝胶载体组缝合神经外膜，失神经支配的胫前肌神经区周围的肌间隙植入圆柱形复合物（含酸性成纤维细胞生长因子25μg，纤维蛋白凝胶载体7．5mg）；单纯纤维蛋白凝胶载体组缝合神经外膜，失神经支配的胫前肌神经区周围的肌间隙单纯植入纤维蛋白凝胶载体7．5mg；空白对照组缝合神经外膜但不给药。③各组大鼠全麻下对称显露双侧胫前肌，行右侧（处理侧）与左侧（正常侧）对比．观察右侧胫前肌外观变化情况，并记录各组右侧胫前肌湿质量。6周后取材进行酶组织化学指标检测。 结果：实验选取SD大鼠30只，全部进入结果分析。①各组胫前肌大体形态学观察结果：酸性成纤维细胞生长因子＋纤维蛋白凝胶载体组两侧胫前肌对称且无明显肌萎缩，肌张力正常；单纯纤维蛋白凝胶载体组及空白对照组右侧胫前肌均明显萎缩，肌肉硬度增加，肌张力下降。②各组肌肉湿质量检测结果的比较：与单纯纤维蛋白凝胶载体组、空白对照组比较，酸性成纤维细胞生长因子＋纤维蛋白凝胶载体组肌肉湿质量明显增大（0．82，0．81，1．26，P〈0．001）。③各组乙酰胆碱酯酶活性检测结果：酸性成纤维细胞生长因子＋纤维蛋白凝胶载体组乙酰胆碱酯酶活性强，接近于正常侧，染色均匀，运动终板结构规则；单纯纤维蛋白凝胶载体组及空白对照组乙酰胆碱酯酶活性弱，染色不均，运动终板结构松散、周边不规则。 结论：酸性成纤维细胞生长因子纤维蛋白凝胶载体可有效保护失神经支配肌运动终板，防止肌肉萎缩。