糖皮质激素对不同血小板特异性自身抗体免疫性血小板减少症疗效研究

<正>免疫性血小板减少症(ITP)约占出血性疾病的30%[1]。糖皮质激素是ITP临床治疗的一线首选药物,大多数患者激素治疗预后良好,但仍有部分对激素治疗无效[2-4]。有学者在Fc受体去除小鼠中发现2种主要的抗血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa及GPⅠbα)抗体引起的ITP的病理过程有着本质的不同[3]。本研究采用改良单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(MAIPA)技术检测ITP患者体内GPⅡb/Ⅲa和GPⅠbα特异性自身抗体[4],观察表达不同抗体患者对激素治疗     

改良MAIPA与网织血小板检测对免疫性血小板减少症的诊断价值

目的:探讨血小板膜特异性抗体及网织血小板(RP)检测在免疫性血小板减少症(ITP)诊断中的意义及2者的相关性。方法:通过改良的单克隆抗体特异性俘获血小板抗原实验(MAIPA)检测90例ITP患者与20例非免疫性血小板减少患者(NITP)血浆中抗血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa和Ⅰb/Ⅸ的特异性抗体;应用流式细胞术(FCM)检测以上患者RP%值。结果:①ITP患者抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠb/Ⅸ抗体共阳性率为33.30%,单一抗GPⅡb/Ⅲa抗体为8.89%,抗GPⅠb/Ⅸ抗体为12.22%;ITP初发患者血小板膜特异性抗体阳性率为58.73%,复发患者为44.44%,2者差异无统计学意义(P0.05);糖皮质激素应用前的MAIPA实验阳性率为58.46%,高于用药后的阳性率44.00%;PLT≤30×109/L的ITP患者MAIPA的阳性率58.18%高于PLT30×109/L患者的阳性率48.75%,但2者差异无统计学意义(P0.05)。②ITP患者的RP%(5.45±5.78)与正常人(0.81±0.41)比较差异有统计学意义(P0.05),NITP患者RP%(0.89±0.06)与正常人比较差异无统计学意义(P0.05);应用糖皮质激素前92.30%ITP患者高于对照,用药后为72.00%,用药前后RP%比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:检测血小板膜特异性抗体的MAIPA实验对ITP的诊断特异性高,单一抗体检测阳性率低,通过2种特异性抗体联合检测可以提高MAIPA的敏感性。糖皮质激素的应用对抗GPⅡb/Ⅲa、抗GPⅠb/Ⅸ抗体的阳性率有影响。RP的检测对于ITP的诊断具有重要意义,该实验也可用于协助激素治疗效果的判断。     

人源化抗血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抗体库的构建及临床价值

目的筛选出抑制血小板聚集的血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa自身抗体,用噬菌体表面展示技术构建人源化抗血小板GPⅡb/Ⅲa单链噬菌体抗体(ScFv)库。方法用单克隆抗体特异性俘获血小板抗原(MAIPA)技术和血小板聚集试验筛选出血浆中含有抑制血小板聚集的血小板GPⅡb/Ⅲa自身抗体的特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者。从筛选出患者的外周血淋巴细胞中提取mRNA,用RT PCR扩增出人免疫球蛋白的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因片断,用DNA linker将VH和VL连接成ScFv基因片断。用限制性内切酶SfiⅠ/NotⅠ酶切ScFv后克隆到噬菌体载体pHEN2,然后转化大肠杆菌TG1。用辅助噬菌体M13K07援救转化后的TG1,产生ScFv。结果95例慢性ITP患者中41例(43.2%)血浆中抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体阳性,强阳性患者5例(5.3%)。2例(2.1%)明显抑制血小板聚集功能。扩增出380～400bp大小的VH和VL基因,用连接肽(Gly4Ser)3成功地连接成约780bp大小的ScFv片断。ScFv克隆到pHEN2并转化大肠杆菌TG1后,形成2.1×107个克隆。用辅助噬菌体M13K07援救TG1后产生的噬菌体抗体库滴度为1.62×1010cfu/ml。结论少数抗GPⅡb/Ⅲa自身抗体可抑制血小板聚集功能。用噬菌体表面展示技术构建了ScFv库,可用来筛选人源化抗血小板GPⅡb/ⅢaScFv。     

慢性特发性血小板减少性紫癜自身抗体克隆性分析

目的 了解慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)自身抗体克隆性生成特性。方法 采用改良的单克隆抗体免疫固定特异血小板抗原(MAIPA)法检测43例慢性ITP患者血清血小板膜糖蛋白(GP)特异性IgG抗体及其重链亚型和轻链表型,采用PCR技术分析患者淋巴细胞免疫球蛋白重链基因重排。结果 43例中16例(38％)血清中至少存在一种抗GP(GPⅡb／Ⅲa、GPⅠb、GPⅠa、GPⅣ、GPⅤ)IgG抗体。73％(8／11)的血清糖蛋白特异性自身抗体表现重链限制性,仅表达一种重链亚型;80％(16／20)的糖蛋白特异性抗体仅表达一种轻链表型;6例患者的糖蛋白特异性抗体既表现为轻链限制性又表现为重链限制性。PCR分析显示,3例存在淋巴细胞重链基因重排。结论 部分慢性ITP患者GP特异性自身抗体源于寡克隆B淋巴细胞增生。     

改良间接MAIPA法对免疫性与非免疫性血小板减少的鉴别诊断价值

目的:检测慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)患者及非免疫性血小板减少症患者的抗血小板特异性抗体,评价其诊断价值。方法:建立单克隆抗体特异性俘获血小板抗原技术并加以改进(改良MAIPA法)借以检测CITP患者、慢性再生障碍性贫血(CAA)患者、肿瘤化疗后血小板减少患者抗血小板GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ的特异性抗体。结果:CITP组血小板糖GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ抗体的总阳性率高于CAA组和肿瘤化疗组,且差异有统计学意义(χ2=15.56,P<0.01和χ2=13.02,P<0.01)。结论:在CITP患者中血小板特异性抗体有较高的特异性,具有较高诊断价值,且2种抗体的功效相同。     

特发性血小板减少性紫癜患者免疫相关指标的检测及其临床意义

目的 检测特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者免疫相关指标的变化,探讨其在ITP发病机制中的作用及其临床意义.方法 应用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)、改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术(MAIPA)、流式细胞术及夹心法ELISA分别检测64例1TP患者及31例正常对照者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞、血小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GP I b/Ⅸ抗体)、T淋巴细胞亚群、网织血小板(RP)及血小板生成素(TPO)的变化.结果 ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞频数[急性ITP组患者为7.6±4.6/105个外周血单个核细胞(PBMC),慢性ITP组患者为5.3±3.0/105个PBMC]、血小板特异性抗体(抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GPI b/Ⅸ抗体)的吸光度值(急性ITP组患者为0.51±0.11、0.48±0.06,慢性ITP组患者为0.49±0.10、0.46±0.09)、CD8+T淋巴细胞百分比[(27.09±9.86)%]、RP百分比[巨核细胞增多组为(24.85±19.18)%,巨核细胞正常组为(23.89±18.90)%]明显高于正常对照组[1.3±0.5/105个PBMC,0.33±0.06,0.41±0.03,(22.08±4 54)%,(8.19±2.46)%,P值均＜0.05],其中急性ITP患者分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞高于慢性ITP患者(P＜0.05).ITP组CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比及CD4+/CD8+比值[(60.88±14.59)%、(28.41±10.55)%、1.18±0.59]均低于正常对照组[(69.89±6.43)%、(35.38±5.05)%、1.64±0.29,P值均＜0.05].ITP患者巨核细胞增多组TPO水平(72.09±41.64)明显低于ITP患者巨核细胞正常组(118.60±70.72,P＜0.05),与正常对照组(75.37±26.32)之间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 分泌GPⅡb/Ⅲa抗体B细胞、血小板特异性抗体、T淋巴细胞亚群、RP%及TPO在ITP诊断及指导定向干预治疗中有一定的意义.     

流式微球技术检测血小板膜糖蛋白自身抗体的方法建立及临床价值

目的:建立流式微球技术检测血小板膜表面糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/IX)特异性自身抗体的方法,并评价其对特发性血小板减少性紫癜(ITP)的诊断价值及临床意义。方法:应用抗人血小板GPⅡb/Ⅲa(CD41a)、GPⅠb/IX(CD42b)单抗包被微球,将血小板从待测血液样本中分离并裂解,血小板裂解后与包被好的微球共同孵育,加入PE标记的羊抗人IgG多克隆抗体,上机检测,流式细胞仪分析ITP组和非免疫性血小板减少组患者自身抗体表达情况。将所测样本的平均荧光强度值(MFI)与正常对照(3个不同正常人血样)MFI的均值进行比较,计算其比率。结果:ITP组该比率均值及范围:GPⅡb/Ⅲa:6.52(0.22～30.20),GPⅠb/IX:6.13(0.56～22.00);非免疫性血小板减少组为:GPⅡb/Ⅲa:1.20(0.32～3.04),GPⅠb/IX:1.302(0.33～3.56);正常对照组比率均值及范围为:GPⅡb/Ⅲa:0.96(0.23～2.28),GPⅠb/IX:0.97(0.22～2.13)。ITP组2种自身抗体荧光强度比率明显高于非免疫性血小板减少组和正常对照组(均P<0.01)。以正常对照...     

ITP血小板特异性抗体和T淋巴细胞亚群及NK细胞变化的意义探讨

目的：检测特发性血小板减少性紫癜（ITP）患者抗血小板膜糖蛋白（GPⅡb／Ⅲa、GPⅠb／Ⅸ）特异性抗体表达、T淋巴细胞亚群及NK细胞的变化,探讨相关因素在ITP发病机制中的作用。方法：应用改良血小板抗原单克隆抗体固相化检测技术（MAIPA）、流式细胞术分别检测52例ITP和24例正常对照组抗血小板膜糖蛋白（GPⅡb／Ⅲa、GPⅠb／Ⅸ）特异性抗体表达、T淋巴细胞亚群及NK细胞变化。结果：ITP组的血小板计数明显低于正常对照组（P〈0．05）;抗GPⅡb／Ⅲa及GPⅠb／Ⅸ抗体A值均高于正常对照组（P〈0．05）;相关分析表明ITP组血小板计数与两种特异性抗体水平均呈负相关关系;在T淋巴细胞亚群变化中,ITP组CD3^＋T淋巴细胞百分比、CD4^＋T淋巴细胞百分比及CD4^＋／CD8^＋的比值均明显低于正常对照组（P〈0．05）,CD8^＋T淋巴细胞百分比则显著高于正常对照组（P〈0．05）;NK细胞百分比明显低于正常对照组（P〈0．05）。结论：血小板特异性抗体及T淋巴细胞亚群的变化可较好地反映ITP这一病理过程,对提高诊断水平及指导临床有一定的实用价值。     

TH亚群细胞因子在儿童ITP发病中的变化及作用

目的：探讨TH亚群细胞因子在儿童特发性血小板减少性紫癜（ITP）发病中的变化及作用。方法：采用定量夹心酶联免疫测定技术检测40例ITP患儿血清中的TH1型细胞因子IL－2、IFN－γ和TH2型细胞因子IL－4、IL－10的变化，采用改良的血小板抗原单抗特异性固相化法（MAIPA）测定这些患儿血清中抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPⅠ/Ⅰx自身抗体。结果：（1）与正常健康儿童相比，ITP患儿TH2型细胞因子IL－4和IL－10显著升高（P＜0．05和0．01），而TH1型细胞因子IL－2和IFN－γ显著降低（P＜0．05和0．01），慢性ITP患儿的TH1型和TH2型细胞因子变化较急性患儿更为显著。（2）ITP患儿血清抗GPⅡb/Ⅲa和抗GPIb/Ix抗体的阳性率分别为67．5％和57．5％，抗体滴度与患儿外周血小板计数呈负相关（P＜0．01），抗体阳性患儿的TH1型和TH2型细胞因子变化较抗体阴性患儿更为显著（P＜0．05）。结论：儿童ITP发病中存在TH亚群平衡的偏离，表现为TH2型细胞因子功能亢进和TH1型细胞因子功能不足，从而出现体液免疫功能增强，B细胞过度活化，产生多种抗血小板自身抗体，导致血小板破坏而减少。     

抗血小板抗体在系统性红斑狼疮血小板减少患者中临床意义的研究

目的 明确抗血小板抗体在系统性红斑狼疮(SLE)血小板减少患者中的临床意义.方法 采用改良抗原捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测抗血小板抗体(抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ、GPⅠa/Ⅱa、GPⅣ抗体),分别比较治疗前SLE血小板减少与SLE非血小板减少患者抗血小板抗体的阳性率、SLE血小板减少患者治疗前后抗血小板抗体的阳性率、SLE血小板减少治疗前患者病情与抗血小板抗体的关联性.统计方法采用秩和检验和x2检验.结果 治疗前SLE血小板减少组抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GP Ⅰb,Ⅸ抗体阳性率分别为50%、67%.非血小板减少组阳性率分别为11%、28%,2组间阳性率差异有统计学意义(P＜0.05);治疗后SLE血小板减少组抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GP Ⅰb/Ⅸ抗体阳性率分别为6%、28%,较治疗前显著降低(P＜0.05);SLE血小板减少组治疗前抗GPⅡb/Ⅲa抗体、抗GP Ⅰb/Ⅸ抗体之间显著关联,该2种抗体均与SLEDAI评分有显著关联性,与抗核抗体、抗双链DNA(dsDNA)抗体、抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)则无显著关联;各组间未检测出抗GPⅣ和GPⅠa/Ⅱa抗体.结论 抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ抗体在病情活动SLE血小板减少患者中表达显著升高,与SLE血小板减少病情发生发展和转归相关.

Abstract：

Objective To evaluate the clinical significance of antiplatelet antibody in patients with systemic lupus erythematosus complicated with thrombocytopenia.Methods Antiplatelet antibody (anti-GP Ⅱb/Ⅲa antibody, anti-GP Ⅰb/Ⅸ antibody, anti-GP Ⅰa/Ⅱ a antibody, anti-GP Ⅳ antibody) were detected by modified antigen capture ELISA. The positive rate of antiplatelet antibody between SLE complicated with thrombocytopenia group and without thrombocytopenia group before therapy were compared,and the positive rate of antiplatelet antibody before therapy and after therapy in SLE complicated with thrombocytopenia were compared,and the relevance between antiplatelet antibody and conditions in SLE complicated with thrombocytopenia were analyzed. Rank test and Chi square test were used for statistical analysis. Results The positive rate of anti-GP Ⅱb/Ⅲa antibody and anti-GP Ⅰb/Ⅸ antibody in SLE complicated with thrombocytopenia group before therapy was 50% and 67% respectively, however,the positive rate in SLE without thrombocytopenia group before therapy was 11% and 28% respectively,there was significant difference between the two groups (P＜0.05) and the positive rate of anti-GP Ⅱb/Ⅲa antibody and anti-GP Ⅰb/Ⅸ antibody in SLE complicated with thrombocytopenia group after therapy was 6% and 28% respectively, which was significantly lower than those before therapy (P＜0.05). In SLE complicated with thrombocytopenia group before therapy, there was significant relevance between anti-GP Ⅱb/Ⅲ a antibody and anti-GP[b/Ⅸ antibody, and there was significant relevance between these two antibodies and SLEDAI score,but no significant relevance between these two antibodies and ANA,dsDNA, ANCA. Neither anti-GPⅣ antibody nor anti-GP Ⅰ a/Ⅱ a antibody was detected in patients of this study. Conclusion The positive rate of antiplatelet antibody (anti-GP Ⅱb/Ⅲ a antibody, anti-GP Ⅰb/Ⅸ antibody) is significantly higher in patients with active systemic lupus erythematosus complicated with thrombocytopenia,and these two antibodies are significantly associated with clinical outcomes.