熔解曲线结合RT-PCR在餐饮食品中对5种致病菌的检测

建立快速检测餐饮食品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157:H7及副溶血性弧菌5种致病菌的实时聚合酶链式反应体系(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)。通过增菌时间的比较,调整RT-PCR反映体系中的退火温度,建立5种致病菌相同的检测体系。试验结果表明,5个目标菌达到检测灵敏度的最短增菌时间范围为2 h～8 h,5种致病菌的试验灵敏度范围为7.4×10 CFU/mL～2.4×103CFU/mL。5种目标菌的熔解温度Tm值分别为沙门氏菌87.32℃,金黄色葡萄球菌79.57℃,单核增生李斯特氏菌82.02℃,大肠埃希氏菌O157:H7 82.24℃,副溶血性弧菌87.15℃。试验建立的RT-PCR快速检测反应体系,与常规微生物检测方法相比,有效地缩短了检测时间,且灵敏度与特异性均能满足检测要求。     

4种食源性致病菌的多重PCR快速检测方法研究

为快速检测蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和沙门氏菌4种食源性致病菌,建立4重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的检测方法。针对菌株的特异性基因设计引物,选择退火温度相近,扩增条带区间不同的引物为多重聚合酶链式反应引物组,并对多重PCR的引物浓度、退火温度进行优化,确定扩增条件。结果表明,在54℃的退火温度下,4种菌可扩增长度为246、166、65、107 bp的清晰片段,其检测灵敏度为蜡样芽孢杆菌2×101CFU/mL,金黄色葡萄球菌可达1.3×102 CFU/mL,志贺氏菌可达1.3×102 CFU/mL,沙门氏菌可达1.4×102 CFU/mL。     

流式分析技术快速定量检测牛乳中大肠杆菌O157:H7

建立一种基于流式分析技术的快速定量检测牛乳中大肠杆菌O157:H7的方法。用偶联有异硫氰酸荧光素的大肠杆菌O157单克隆抗体对大肠杆菌O157:H7进行特异性标记,通过优化抗体反应条件,建立流式检测方法,然后对磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline,PBS）和人工污染牛乳样品中不同浓度的大肠杆菌O157:H7进行定量检测。本研究建立的流式检测方法的在PBS中的检测范围为2.57×103～1.12×108?CFU/mL,灵敏度达到2.57×103?CFU/mL。将所建立的流式检测方法应用于牛乳样品检测,当人工污染牛乳样品中大肠杆菌O157:H7的浓度在2.31×104～1.48×108?CFU/mL之间时,流式检测方法与平板计数方法检测结果基本一致,方法的灵敏度为2.31×104?CFU/mL,检测时间为35?min。该方法能快速、定量地检测出牛乳样品中的大肠杆菌O157:H7,在食源性致病菌的快速筛查和监控中具有重要的应用价值。     

多重PCR检测婴幼儿配方奶粉中3种食源性致病菌

为建立一种能够同时检测婴幼儿配方奶粉(Powdered Infant Formula,PIF)中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌3种食源性致病菌的多重PCR检测方法。通过单重PCR验证了9对引物的特异性,筛选出其中3对特异性好的引物建立了多重PCR体系,对其特异性和灵敏度进行评价,并将其应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测。结果表明,针对克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等3种食源性致病菌所筛选的3对引物分别能扩增出469、638和796 bp的目的条带,具有高度特异性。多重PCR检测体系的最佳退火温度为55℃,最佳Mg2+浓度为2.00 mmol/L,最佳引物浓度为400 nmol/L。在此条件下3种目的菌在102 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带。将建立的多重PCR检测体系应用于人工污染PIF中3种食源性致病菌的检测,其检出限达到103 CFU/g。本研究初步建立了一种能准确、快速、特异性的检测PIF中克罗诺杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR方法,适用于PIF中3种常见的食源性致病菌的快速检测。     

实时荧光PCR鉴定婴幼儿配方食品中克罗诺杆菌的研究

目的 建立一种能够快速准确鉴定克罗诺杆菌的实时荧光聚合酶链式反应（PCR）方法,并对食品样品和人工污染样品进行克罗诺杆菌检验。方法 根据克罗诺杆菌DNA旋转酶B亚基（gyrB）基因保守区序列设计引物和探针。通过特异性试验、绝对灵敏度、相对灵敏性试验、抗干扰试验对所建立方法进行方法学验证。采用人工污染样品增菌液进行方法灵敏度试验。结果 本研究建立的方法能够特异性扩增7种克罗诺杆菌,但对与其亲缘关系较近的其他肠杆菌及食品中较为常见的其他致病菌均无扩增,表明本研究建立的方法具有很好的特异性和抗干扰能力。采用阪崎克罗诺杆菌验证绝对灵敏度达1～10 pg,相对灵敏度可以达到103 CFU/mL。在基因组水平和培养物水平均具有很好的抗干扰能力。人工污染样品在36℃增菌24 h后检测灵敏度可以达到100 CFU/mL。结论本研究所建立的实时荧光PCR方法对婴幼儿配方食品样品中的克罗诺杆菌的检测具有快速、特异、灵敏和稳定的特点,可以为传统婴幼儿配方食品中的克罗诺杆菌的检验提供技术参考。     

一步法快速检测食品中大肠菌群

目的 建立一步法快速检测食品中大肠菌群的方法。方法 食品参照GB 4789.3-2016进行前处理后, 放入到大肠菌群检测试剂盒的样品制备瓶内, 振摇制成样品匀液。将样品匀液1 mL加入到检测瓶中, 配套使用在食源性致病菌同步检测仪中培养检测。结果 在市场上购买3份样品用该方法检测, 并同GB 4789.3-2016检测结果对比, 2种方法吻合率高, 且本方法大肠菌群检测限能够达到10 CFU/g或mL, 70~480 min内可获得检测结果。结论 该方法可以实现对大肠菌群的快速检测, 且操作简便, 结果准确, 为食品卫生质量监管提供参考。     

婴幼儿配方乳粉和发酵乳中沙门氏菌检验方法的比对研究

目的 对比美国FDA/BAM、ISO 6579-2017和GB4789.4-2016沙门氏菌检验方法的检出限、灵敏度,筛选出针对婴幼儿配方乳粉、发酵乳产品以及环境样品中沙门氏菌污染最灵敏的检测方法。方法 对20种血清型沙门氏菌进行平行检测,对比美国FDA/BAM、ISO 6579-2017和GB4789.4-2016沙门氏菌检验方法的检出限、灵敏度。使用不同基质(婴幼儿配方奶粉、酸奶样品和环境样品)人工染菌样品,对三个方法的样品适用性进行比较与评价。结果 三个标准方法的检出限为10_^-1-10_⁰CFU/样品。FDA/BAM方法、ISO 6579-2017方法、GB 4789.4-2016方法在10_¹CFU/样品染菌水平灵敏度均为100%;10_⁰CFU/样品染菌水平,灵敏度为95%、90%、90%;10_^-1CFU/样品染菌水平,灵敏度为65%、50%、45%。对三类人工污染沙门菌的样品,FDA/BAM方法的检出率显著高于ISO和GB4789方法(P＜0.05),ISO和GB4789方法检出率无显著性差异(P>0.05)。结论 三种方法检出限一致 ,均可以有效检测食品中沙门氏菌。染菌浓度低于10_⁰CFU/样品时, FDA/BAM方法的灵敏度显著高于ISO和GB4789方法。不同基质人工污染沙门氏菌样品对比,FDA/BAM方法的检出率显著高于ISO6579-2017方法和GB4789.4-2016方法。     

实时荧光核酸恒温扩增技术检测食品中金黄色葡萄球菌的方法评价

目的 以传统国标培养法作为参比方法, 评价实时荧光核酸恒温扩增检测(real-time simultaneous amplification and testing, SAT)方法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力。方法 依据 GB 4789.10—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》对SAT法检测食品中金黄色葡萄球菌的能力进行评价。分别检测纯培养物、人工污染样品以及实际样品来评价试剂盒的灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率和准确度, 同时采取2种方法的显著性差异分析, 确定最终结果。结果 SAT法灵敏度为100, 纯培养物检出限为103 CFU/mL, 人工污染检出限灵敏度为103 CFU/mL, 假阴性率为0、假阳性率为2.9%; 金黄色葡萄球菌的特异性符合要求。结论 SAT检测方法灵敏度高、特异性好, 假阳性率、假阴性率、准确度等检测结果全部达标, 并且检测时间短, 适用于食品中金黄色葡萄球菌的快速检测。     

多重实时荧光串联PCR技术高通量检测生蚝中9种致病菌

大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌、产气荚膜梭菌、单增李斯特菌和创伤弧菌是贝类食品中常见的食源性致病菌。该文通过设计特异性引物,优化反应参数以建立多重实时荧光串联PCR(multiplexed tandem PCR,MT-PCR)方法,进一步评估方法的特异性和灵敏度,并用于检测生蚝样品。优化后的MT-PCR方法与常规qPCR具有相同定量能力,可同时检测上述9种致病菌。在对混合菌液的检测中,MT-PCR方法的检测灵敏度最低可达10² CFU/mL,且此法对其中6种致病菌的检测灵敏度高于qPCR。应用该技术检测人工染菌的生蚝样品,检测灵敏度为10²～10³CFU/g。该研究建立的MT-PCR方法可实现高通量、快速准确地检测生蚝中这9种常见的食源性致病菌,对保障食品安全和评估食源性致病菌污染风险具有重要意义。     

可视化环介导恒温扩增法检测蔬菜产地环境灌溉水源中沙门氏菌

目的建立可视化环介导恒温扩增体系(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测灌溉水源中沙门氏菌的分析方法。方法以沙门氏菌侵袭蛋白A(invA)基因序列设计特异性LAMP检测引物,优化LAMP反应体系和反应条件后,通过特异性实验、灵敏度实验对LAMP检测方法进行测试,并与国标检测方法对比检测人工污染的灌溉水源样品,验证该方法的准确性。结果灵敏度实验结果显示本LAMP检测方法最低检出限为7 CFU/25μL,特异性实验结果显示本LAMP检测方法具有良好的特异性,干扰菌株对本LAMP检测方法无影响。该方法在与国家标准检测方法对比,检测人工污染的灌溉水源样品时具有相同的准确性,检测灵敏度为1×10^2 CFU/mL。结论本研究建立了快速、准确、灵敏的恒温扩增体系,可以应用于灌溉水源中沙门氏菌的快速检测。     

单增李斯特菌RT-LAMP快速检测方法的建立

建立一种可快速检测单增李斯特菌的反转录-环介导等温扩增方法。针对单增李斯特菌的李氏溶血素基因(hly)设计多组引物,经引物筛选和配比优化,建立检测单增李斯特菌的实时荧光RT-LAMP方法,并通过菌株特异性、灵敏度和人工污染脱脂乳样品中的检出限对该方法进行评价。该方法特异性良好, 26株菌株中仅三株单增李斯特菌检出阳性;检测灵敏度高,对单增李斯特菌的菌悬液灵敏度为10~1 CFU/mL,是RT-qPCR方法检测灵敏度的10倍。人工污染样品直接检测的检出限为10~3 CFU/mL,而对样品增菌16 h后,单增李斯特菌的检出限提高到10~0 CFU/25 mL。所建立的RT-LAMP方法可以快速、准确地检测单增李斯特菌,操作简便,适合应急和现场监测使用。     

三种鱼类链球菌三重实时荧光PCR方法的建立

对3种链球菌基因序列的分析,设计了3条Taq Man探针,并选择3种无相互干扰的荧光基团进行标记。建立了三重实时荧光PCR的检测方法,同时对建立的方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性评价,并且与传统培养法进行了比较。结果显示,试验建立的方法能特异扩增出3种链球菌的标准阳性菌株;3种链球菌之间没有交叉反应;S.agalactiae的检测灵敏度约为1.52×10~1 CFU/mL;S.dysgalactiae的检测灵敏度约为1.33×10~2 CFU/mL;S.milleri的检测灵敏度约为1.76×10~1 CFU/mL;3种链球菌检测反应的CV值均小于5%;对采集的287份样品进行检测,共计检出5份S.agalactiae阳性样品、3份S.dysgalactiae阳性样品和1份S.milleri阳性样品与传统细菌分离鉴定的方法检测结果一致。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。     

干燥型荧光PCR试剂盒检测食源性致病菌研究

目的研究干燥型荧光PCR试剂盒检测副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌3种食源性致病菌的灵敏度、特异性和检测人工污染样品情况。方法目标菌和非目标菌接种至血平板, 36℃培养过夜,目标菌比浊至0.5 McF(麦氏单位), 10倍连续稀释后提取DNA,进行灵敏度研究;非目标菌直接提取DNA后检测,进行特异性研究;用高、中、低3个浓度目标菌液人工污染食品样品,按国标方法培养后用干燥型荧光PCR试剂盒检测。结果副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的最低检测浓度分别为140、380和7900 CFU/mL。3种目标菌人工污染食品样品的最低检测浓度分别为1.2 CFU/25 g、5.1CFU/25 g、10 CFU/25 g。每种试剂盒仅对目标菌株的检测结果呈阳性,非目标菌株均呈阴性。结论新型干燥型荧光PCR检测试剂盒具有较好的灵敏度和良好的特异性,适用于食品中副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7和单增李斯特菌的检测。     

可视化跨越式滚环等温扩增技术检测食品中沙门氏菌

建立一种新型的核酸体外等温扩增方法--可视化跨越式滚环等温扩增技术(SRCA)检测沙门氏菌。根据沙门氏菌stn基因序列设计引物,进行特异性验证。测定该技术的灵敏度以及人工污染鸡肉样品的检出限。通过检测多种实际食品样品,评价SRCA方法的敏感性、特异性和符合率。研究结果表明:所有沙门氏菌呈阳性结果,非沙门氏菌呈阴性结果,说明引物特异性良好。SRCA方法检测沙门氏菌DNA的灵敏度为5.6×10~0fg/μL,检出限为3.8×10~1CFU/mL;PCR方法的灵敏度为5.6×10~2fg/μL,检出限为3.8×10~3CFU/mL。该方法检测30个实际样品的检出率为13.33%,并与GB 4789.4-2016方法进行比较,其敏感性、特异性和符合率分别为100%,96.30%和96.67%。结论:可视化跨越式滚环等温扩增技术具有操作简便,特异性强,灵敏度高,检出限低,检测成本低,对试验设备要求低等优点,适用于基层单位对食品中沙门氏菌的快速检测。     

食品接触材料中3种致病菌的多重荧光PCR检测

建立并优化食品接触材料中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌3种致病菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,评价此方法的特异性和灵敏度,并模拟阳性样品进行检测。结果显示,该方法特异性良好,检测灵敏度均能达到10~3 CFU/mL,为食品接触材料的微生物检测提供技术保障。     

重大活动食品安全保障中沙门氏菌现场检测方法的建立

目的 针对重大活动食品安全保障工作对于现场检测的时间短和设备简单的要求及供应食品的类型,建立经加热处理和未经加热处理食品的沙门氏菌检测方法。方法 将重组酶聚合酶等温扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)与侧流免疫层析法(lateral flow immunoassay, LFS)结合,建立RPA-LFS方法对切片水果样品进行检测,再加上叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)处理,建立PMA-RPA-LFS方法,对熟肉制品进行检测。并通过检测人工污染样品及实际样品验证方法的适用性。结果 RPA-LFS的沙门氏菌纯菌检出限为2.0×10¹ CFU/mL,新鲜水果基质检出限为2.0×10¹ CFU/g。对人工污染样品和实际样品的检测结果与GB4789.4—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》方法的结果一致。PMA-RPA-LFS的PMA处理方法为0.1%脱氧胆酸钠37℃处理20 min,加入10μg/mL PMA,室温避光孵育10 min,曝光15 mi...     

实时荧光重组酶聚合酶扩增检测大肠埃希氏菌O157

目的建立实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测大肠埃希氏菌O157的分析方法。方法根据大肠埃希氏菌O157的rfbE基因(S83460.1),设计特异性引物和exo探针,分别进行引物探针筛选和特异性、灵敏度以及稳定性探究,并对人工污染样品和实际样品进行检测,验证本研究方法的实用性。结果本方法在37℃恒温20 min内可完成对大肠埃希氏菌O157的定性检测,目的 DNA的检测限为0.01ng/μL,目的菌的检测限为10~3CFU/mL。在稳定性实验中,选择从100～0.001 ng/μL的10倍梯度稀释的目的 DNA进行每个浓度8个平行的测试, 0.01 ng/μL及以上浓度的DNA的8个平行均可稳定检出。对于大肠埃希氏菌O157的初始污染量为4 CFU/25 g的牛奶和鸡肉人工污染样品,增菌9 h后,可检出其中的目的菌。用本方法和国标方法 GB 4789.36-2016同时检测20份实际样品,结果一致。结论该方法快速、简便,可作为一种常温下大肠埃希氏菌O157的快速检测手段,应用于基层实验室或现场检测。     

5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术

将5种致泻大肠埃希氏菌的毒力基因保守序列进行设计并合成了引物和探针,建立的多重实时荧光PCR4种试剂盒可以同时检测5种致泻大肠埃希氏菌。结果表明:4种试剂盒的12对毒力基因通过5种致泻大肠埃希氏菌的标准储备菌株均得到验证;并且12对毒力基因只对对应的致泻大肠埃希氏菌特异性起作用,对常见的食源性致病菌都无扩增曲线;escV、bfpB、stx1、ipaH和invE基因的检出限是10CFU/mL,aggR基因的检出限是10~2 CFU/mL,astA和pic基因的检出限是10~3 CFU/mL,而stx_2A、ipaH和stIb基因菌液浓度10CFU/mL时,均可观察到明显的"S"型扩增曲线,且线形较好;并且对抽查和委托检验的肉类、奶和动物腹泻物以及人工污染样品等40份样品进行检测,共检出11份阳性样本,与GB 4789.6—2016标准检测结果相一致,表明建立的4种试剂盒方法具有良好的实用性。     

H-NS基因作为靶基因的荧光定量PCR快速检测海产品中的副溶血性弧菌

目的:建立一种利用SYBR Green I荧光PCR反应快速、准确、便捷检测副溶血性弧菌的方法。方法:根据副溶血性弧菌的H-NS基因的保守区域设计引物,利用副溶血性弧菌的标准菌株以及12株其他种属的常见致病菌对引物的特异性和灵敏度进行评价。基于该基因利用SYBR Green I荧光PCR检测方法建立标准曲线,确定该检测方法的灵敏度。对用不同浓度的菌液污染的灭菌过的蚬子样品进行检测,确定该方法的的可行性。最后用该方法检测30份蚬子样品,并与国标GB4789.7-2013检测结果进行比较。结果:用H-NS基因作为靶基因检测副溶血性弧菌的SYBR Green I荧光PCR检测方法,建立的标准曲线的相关系数为0.998,检测灵敏度为7.3×10 CFU/m L。人工污染蚬子的检出限为6.7×102CFU/m L。对蚬子样品的检测结果为30份样品中有4份含有副溶血性弧菌,与国家标准方法 (GB4789.7-2013)的检测结果具有一致性。结论:表明该方法可以用于副溶血性弧菌的快速检测。     

反转录-环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌

建立了反转录-环介导等温扩增技术的志贺氏菌快速检测方法。针对志贺氏菌特异保守基因ipa H设计多套引物,建立优化了的反应体系,并评价其准确性、特异性、灵敏度。以人工污染脱脂乳样品比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度。结果表明,在65℃等温条件下,RT-LAMP反应可在30 min内完成。在活菌/损伤菌模型中,该方法表现出比国标法更好的准确性。在23株细菌标准菌株中仅对4株志贺氏菌有特异性检出。志贺氏菌RNA模板的检测灵敏度为7 fg/μL。人工污染脱脂乳样品检测灵敏度达到40 CFU/g,比RT-PCR方法高出2个数量级。表明所建立的志贺氏菌RT-LAMP扩增方法可以准确的检测志贺氏菌,同时具有快速、特异、灵敏的优势,可用于志贺氏菌的快速筛查和现场监控。