A群链球菌四价重组蛋白的表达、纯化及其免疫原性

目的原核表达并纯化A群链球菌M1、3、6、18型四价重组蛋白,并检测其免疫原性。方法以克隆质粒pUC18-Strep4为模板,PCR法扩增四价重组蛋白基因,克隆至表达载体pQE30中,构建重组表达质粒,转化E.coilM15,筛选阳性克隆,IPTG诱导表达。采用Ni2+-NTA凝胶亲和层析纯化重组蛋白。以该蛋白免疫家兔,ELISA法检测血清抗体滴度;间接免疫荧光法(IFA)检测A群链球菌型特异性抗体;体外杀菌试验检测杀菌抗体活性。结果四价重组蛋白表达质粒pQE30-Strep4经双酶切和测序,证明构建正确。重组蛋白相对分子质量与预期相符,表达量约占菌体总蛋白的30%,为可溶性表达。纯化后蛋白纯度可达90%以上,并可诱导家兔产生高滴度的M1、3、6型特异性杀菌抗体。结论已成功表达了A群链球菌四价重组蛋白,纯化后的蛋白可诱导家兔产生针对A群链球菌M1、3、6三个血清型菌株的特异性杀菌抗体。     

新德里金属-β-内酰胺酶的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达新德里金属-β-内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1),并制备其多克隆抗体。方法以临床分离的产NDM-1的臭鼻克雷伯杆菌为模板,PCR扩增NDM-1基因,克隆入pET-28a载体,构建重组原核表达质粒pET-28a-NDM-1,转化E.coli BL21(DE3)pLyss,IPTG诱导表达重组蛋白。表达的重组蛋白经硫酸铵沉淀、离子交换层析、Ni亲和层析及分子筛层析纯化后,免疫日本大耳白兔,制备NDM-1多克隆抗体。抗体经硫酸铵沉淀和SPA-Sepharose亲和层析纯化后,Western blot鉴定其特异性。结果重组表达质粒pET-28a-NDM-1经PCR及测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为28 000,诱导表达的重组菌破菌上清存在较强的β-内酰胺酶活性,表明NDM-1蛋白为可溶性形式表达;最终纯化获得的NDM-1蛋白纯度高于95%;制备的NDM-1多克隆抗体能与诱导表达的重组菌胞外蛋白特异性结合。结论成功原核表达了NDM-1,并制备了其多克隆抗体,为NDM-1的快速检测提供了新的思路。     

4Aβ_(1-15)的原核表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达4Aβ1-15,并进行纯化。方法以重组质粒pcDNA3.1-s4Aβ1-15为模板,PCR扩增1-2Aβ1-15基因,并克隆至pQE30a原核表达载体中,构建重组表达质粒pQE30a-2Aβ1-15,再以其为模板,扩增2-2Aβ1-15基因,克隆入pQE30a-2Aβ1-15质粒中,构建重组原核表达质粒pQE30a-4Aβ1-15,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。结果重组表达质粒pQE30a-4Aβ1-15经双酶切和测序证明构建正确;表达的目的蛋白相对分子质量约为18 000,主要以可溶形式表达,表达量约占上清液总蛋白的40%,可与鼠抗人Aβ40单抗特异性结合;纯化后基本除去了杂蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒pQE30a-4Aβ1-15,表达并纯化了His6-4Aβ1-15融合蛋白,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

人星状病毒非结构蛋白nsP1a/3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化人星状病毒(human astrovirus,HAstV)非结构蛋白nsP1a/3,并制备多克隆抗体。方法酶切质粒nsP1a/3-pCDNA3.1,获得nsP1a/3基因,克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒nsP1a/3-pET-28a,转化大肠埃希菌BL2(DE3),IPTG诱导表达,并优化表达条件。表达的重组蛋白经Ni2+亲和层析纯化后,经腹腔免疫SD大鼠,共4次,最后1次免疫7 d后,经心脏采血,分离血清,ELISA法检测多抗效价,Western blot鉴定多抗的特异性。结果重组表达质粒nsP1a/3-pET-28a经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为22500,以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度为86.6%,浓度为1.26mg/ml;制备的多克隆抗体效价较高,可达1∶30 000,且特异性较好。结论成功地原核表达、纯化了HAstV非结构蛋白nsP1a/3,并制备了特异性良好的鼠多克隆抗体,为进一步研究nsP1a/3蛋白在病毒侵染靶细胞时的作用机制奠定了基础。     

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

目的原核表达美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(North American genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus,NA-PRRSV)N蛋白,并制备多克隆抗体。方法以NA-PRRSV QH-08毒株的RNA为模板,扩增N蛋白编码片段,克隆入原核表达载体p ET30a(+),构建重组表达质粒pET30a-NA-PRRSV-N,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6 h。采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化表达的重组蛋白,复性后的重组N蛋白与弗氏佐剂混合乳化,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,制备兔抗NA-PRRSV-N蛋白多克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验检测多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测血清抗体效价。结果经PCR、双酶切和测序鉴定,重组表达质粒p ET30a-NA-PRRSV-N构建正确;重组N蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为24 000,纯度可达95%以上,可与NA-PRRSV阳性猪血清发生特异性反应;制备的多克隆抗体能够识别重组N蛋白和全病毒抗原,抗体效价1∶25 600,显著高于商品化疫苗组。结论成功在大肠埃希菌中表达了NA-PRRSV N蛋白,并制备了其多克隆抗体,为NA-PRRSV检测方法的建立奠定了基础。     

重组幽门螺旋杆菌黏附素A的可溶性表达、纯化及其免疫学性质分析

目的 通过分子克隆、蛋白表达及纯化等技术获得重组幽门螺旋杆菌黏附素A(recombinant H. pylori adhesin A,rHpaA)，免疫BALB/c小鼠，制备anti-HpaA多克隆抗体后，分析其抗体特异性。方法 利用Phyre2和DNAstar生物信息学软件分析rHpaA的三维结构及抗原性质；通过PCR长片段DNA合成技术获得黏附素HpaA基因，插入质粒pCzn1中，制备重组质粒pCzn1-rHpaA，转化E. coli Arctic Express(DE3)，经IPTG诱导表达、Ni-IDA亲和层析纯化后，获得rHpaA蛋白，Western blot鉴定其反应原性。将rHpaA辅以弗氏佐剂免疫雄性BALB/c小鼠，共6只，制备antiHpaA多克隆抗体，ELISA法鉴定其抗体特异性。结果 rHpaA具有较好的三维结构及抗原性质。双酶切鉴定及基因测序证明，重组质粒pCzn1-rHpaA含有完全正确的HpaA基因序列。重组菌株pCzn1-rHpaA/Arctic Express可溶性表达目的蛋白rHpaA，约占上清总蛋白的68.3%，纯度达98.1%。rHpaA可与an...     

狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白密码子优化、原核表达及多克隆抗体的制备

目的对狂犬病病毒CTN-1株基质蛋白(matrix protein,MP)密码子进行优化,原核表达重组蛋白,并制备多克隆抗体。方法通过GenBank查找狂犬病病毒CTN-1株M蛋白编码序列并体外合成,将目的序列插入原核表达载体pET-28b,构建重组质粒pET-28b-M,转入大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达M蛋白,经亲和层析和复性后,免疫豚鼠制备多克隆抗体,Western blot和间接ELISA检测多抗的免疫反应性以及效价。结果成功构建了pET-28b-M重组原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达,经亲和层析及透析获得纯化的重组M蛋白,制备的多克隆抗体可与M蛋白发生特异性结合,效价达1∶21 870。结论成功优化表达了狂犬病病毒CTN-1株M蛋白,制备了高效价的多克隆抗体,为后续M蛋白生物学分析以及新型狂犬病疫苗的研究奠定了基础。     

脂蛋白相关磷脂酶A2的原核表达及多克隆抗体的制备

目的构建人脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2,LP-PLA2)基因重组原核表达质粒,表达重组蛋白,制备人LP-PLA2多克隆抗体。方法从分化的THP-1细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增LP-PLA2全长编码基因,插入原核表达载体pCold TF中,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG低温(15℃)诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Sepharose 6FF亲和层析及DEAE-Sephadex离子交换层析后,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot法检测多抗的反应原性。结果重组表达质粒pCold TF-LP-PLA2经双酶切及测序证实构建正确;TF-LP-PLA2获得可溶性表达,相对分子质量约为93 000;纯化的重组蛋白纯度可达90%,可与市售兔抗人LP-PLA2抗体反应;制备的抗血清效价达1∶5.12×106以上,反应原性良好。结论已成功原核表达了重组LP-PLA2蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为下一步制备单克隆抗体及建立LP-PLA2免疫检测方法奠定了基础。     

肺炎链球菌热休克蛋白ClpE多克隆抗体的制备及其亚细胞定位

目的制备肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)热休克蛋白(heat shock protein,HSP)ClpE多克隆抗体,并确定ClpE在S.pn表面的亚细胞定位。方法应用PCR法从S.pn D39中扩增clpE基因全长片段,克隆入原核表达载体pET28a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,间接ELISA法测定抗体效价,Western blot法鉴定抗体的特异性。ELISA法分析ClpE在S.pn表面的亚细胞定位。结果重组表达质粒经PCR、双酶切和测序证实构建正确;表达的重组ClpE蛋白相对分子质量约83 000,表达量约占全菌总蛋白的60%,主要以可溶性上清形式存在;纯化的重组蛋白纯度达90%;制备的ClpE多克隆抗体效价达1∶4 096 000,可与S.pn D39全菌发生特异性反应,S.pn D39在正常生长时可表达ClpE蛋白;ClpE在S.pn表面有表达。结论成功制备了高效价和特异性的ClpE多克隆抗体,ClpE在S.pn表面可正常表达,为表面蛋白。     

登革病毒1型E蛋白第三结构域的原核表达及其免疫原性

目的在大肠埃希菌中表达登革病毒(Dengue virus,DENV)1型(DENV-1)E蛋白第三结构域(EⅢ),并分析重组蛋白的免疫原性。方法利用PCR技术从质粒p MD-D1pr M/E中扩增DENV-1的EⅢ序列,插入原核表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒p ET-D1EⅢ,转化至E.coli Rosetta2(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备多克隆抗体,采用Western blot法检测抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体滴度,蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)检测中和抗体效价。用纯化的重组蛋白免疫经腹部皮下多点注射BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,用DENV-1(Hawaii株)经脑内攻击,分析重组蛋白对小鼠的免疫保护力。结果重组原核表达质粒p ET-D1EⅢ经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为33 000,主要以可溶性形式表达,占重组菌裂解上清蛋白量的52.37%;纯化的纯度可达90%以上,浓度达2 mg/ml;制备的多克隆抗体特异性强,效价高;重组蛋白能保护57.1%的小鼠免受致死剂量DENV的攻击。结论成功在E.coli Rossetta2(DE3)中高效表达了DENV-1 EⅢ蛋白,纯化的重组蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体具有较强的特异性和较高的效价,且在小鼠免疫保护试验中显示出较好的保护力。本实验为进一步研究E蛋白的功能和登革新型疫苗的开发奠定了基础。     

牛源大肠杆菌F41菌毛蛋白的原核表达和多克隆抗体的制备

目的原核表达及纯化牛源产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)F41菌毛蛋白,并制备F41菌毛蛋白的多克隆抗体。方法以ETEC基因组为模板,采用PCR法扩增F41菌毛基因,克隆入表达载体pQE-30,转化大肠杆菌XL1-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析,表达产物经切胶纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用间接ELISA法测定抗血清效价,Western blot分析F41菌毛蛋白与多抗的反应原性。结果重组表达质粒pQE-30-F41经双酶切及测序证实构建正确;F41菌毛重组蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约为32 000;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,纯化的重组蛋白纯度可达92%;制备的抗血清效价达1∶2.56×106以上,Western blot结果表明F41菌毛蛋白与制备的多抗具有良好的反应原性。结论已成功原核表达并纯化了F41菌毛重组蛋白,且制备了高效价的多克隆抗体,为单克隆抗体制备及其免疫检测方法的建立奠定了基础。     

促凋亡蛋白BID多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗BID的多克隆抗体,用于检测凋亡信号转导过程中BID蛋白的表达。方法采用PCR技术合成编码BID特异性肽段的基因,构建GST融合基因表达载体,在E.coli BL21中诱导表达GST-BID多肽的融合蛋白,经Glutathione Sepharose 4B纯化后免疫家兔,免疫血清经纯化后,得到抗BID的多克隆抗体,经Western blot鉴定其特异性。结果通过PCR扩增获得了BID肽段的编码基因;pGEX-6P-1-BID多肽重组质粒经酶切鉴定及测序证明构建正确;在E.coli BL21中表达了GST-BID多肽融合蛋白;纯化后蛋白纯度达95%;制备的抗BID多克隆抗体能够特异地识别BID蛋白。结论所制备的抗BID多克隆抗体可特异性检测BID蛋白。     

幽门螺杆菌VacA-HpaA融合蛋白的表达及其免疫学特性

目的构建H.pylori细胞空泡毒素VacA与黏附素HpaA融合基因的原核表达载体,诱导其表达融合蛋白,并检测表达产物的抗原性与免疫原性。方法用PCR从pQE30-VacA质粒扩增出VacA基因,克隆至pTrc99A-HpaA载体中,与HpaA基因融合后,插入原核表达载体pQE30中,再将pQE30-VacA-HpaA转化入大肠杆菌DH5α,诱导表达并提纯融合蛋白,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,Bradford法检测融合蛋白含量,Western blot鉴定特异性。将融合蛋白免疫家兔,得到多克隆抗血清,用双向免疫扩散和ELISA检测免疫原性。结果SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量约为65000,表达量在35%以上,主要以包涵体形式表达,蛋白含量为0·72mg/ml,具有良好的VacA和HpaA抗原性与免疫原性。结论VacA-HpaA融合蛋白已成功表达,且具有良好的免疫原性,为进一步研究制备H.pylori疫苗创造了条件。     

肺癌抑癌基因1对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响

目的探讨肺癌抑癌基因1(Tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1)对鼻咽癌细胞株HNE-1增殖与侵袭能力的影响。方法采用RT-PCR法从乳腺癌细胞株MCF-7中扩增TSLC1基因全长编码区序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-TSLC1,转染HNE-1细胞,RT-PCR及Western blot检测TSLC1基因mRNA和蛋白的表达水平。MTT和Transwell小室试验检测TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖及侵袭能力的影响。结果重组表达质粒pcDNA3.1-TSLC1经双酶切及测序证明构建正确;稳定转染重组表达质粒的HNE-1细胞中TSLC1基因出现过表达;TSLC1基因过表达可显著抑制HNE-1细胞的增殖与侵袭能力。结论 TSLC1基因过表达对HNE-1细胞增殖与侵袭能力具有明显的抑制作用,为鼻咽癌的基因治疗提供了理想的分子靶点。     

无乳链球菌GapC蛋白和鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合表达及纯化

目的构建无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,S.agalactiae)gapC基因和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimu-rium,S.typhimurium)fliC基因的融合基因gapC-fliC,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法应用PCR技术分别扩增鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白fliC基因和无乳链球菌gapC基因片段,通过柔性肽(Gly4Ser)2编码序列将二者串联并克隆至质粒pQE-30上,构建重组原核表达质粒fliC-gapC-pQE30,转化E.coli XL1-Blue,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后,进行Western blot分析及融合蛋白活性检测。结果重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30经双酶切和测序证明构建正确;表达的融合蛋白FliC-GapC相对分子质量约95 000,表达量占菌体总蛋白的58%,主要以包涵体形式存在,且可与小鼠抗鼠伤寒沙门菌和抗无乳链球菌多抗血清发生特异性反应,具有较好的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性。结论成功构建了重组表达质粒fliC-gapC-pQE-30,并在E.coli XL1-Blue中表达了融合蛋白,为下一步动物免疫保护性试验的研究奠定了基础。     

复合通用CD4~+Th细胞表位基因的原核表达及免疫学特性

目的构建复合通用CD4+Th细胞表位基因的原核表达载体,检测表达蛋白的免疫学特性,并探讨其作为载体蛋白的可能性。方法以限制性核酸内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUC19-Pep10,回收长度为650bp左右的目的片段,插入原核表达载体pQE30中,获得重组质粒pQE30-Pep10,转化大肠杆菌M15后进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Westernblot分析后,进行亲和层析纯化及透析复性,获得重组蛋白Pep10,将Pep10和TT分别免疫雌性BALB/c小鼠,以间接ELISA法和流式细胞术分别检测其免疫原性和淋巴细胞增殖效应。结果SDS-PAGE显示重组蛋白Pep10相对分子质量约为23000,表达量达41%,主要以包涵体形式表达,Westernblot检测可见特异性染色条带,纯化后纯度达94%,共获得42mg重组蛋白。其体外淋巴细胞增殖效应与TT相当,增殖指数分别为4.216和4.736,而免疫原性远低于TT,特异性IgG几何平均滴度(GMT)分别为1∶15758.65和1∶67558.81。结论已成功构建重组原核表达载体pQE30-Pep10,并在大肠杆菌中高效表达,且表达的重组蛋白Pep10具有良好的淋巴细胞增殖效应和较低的免疫原性,有可能作为一种新型载体蛋白,用于多糖结合疫苗的研制。     

百日咳黏附素的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的原核表达百日咳黏附素(Pertactin,Prn),并制备抗Prn单克隆抗体。方法从无细胞百日咳疫苗生产菌株CS株基因组DNA中克隆Prn基因,插入表达载体pQE-30中,构建重组表达质粒pQE-30-Prn,转化E.coli M15,IPTG诱导表达。表达的重组Prn蛋白经阳、阴离子交换层析纯化后,采用Western blot和ELISA法鉴定重组Prn蛋白的反应原性。以纯化的重组Prn蛋白为免疫原,利用杂交瘤技术制备单克隆抗体,并对制备的单抗进行鉴定。结果重组表达质粒经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的重组Prn蛋白相对分子质量约为69 000,主要以包涵体形式表达;纯化的重组Prn蛋白的纯度达95%以上,产量可达25 mg/L,能与不同来源的抗Prn-Ab血清特异性结合。获得2株分泌抗Prn单抗的杂交瘤细胞株,分泌的单抗均为IgG1类,轻链类型均为κ,效价均达1∶105以上,并能特异性识别Prn蛋白,而与百日咳杆菌其他抗原蛋白无交叉反应。结论原核表达、纯化了重组Prn蛋白,并制备了2株效价高、特异性强的单抗,为无细胞百日咳疫苗的质量控制及百日咳杆菌致病机制的研究提供了材料。     

小反刍兽疫病毒F蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的原核表达小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)F蛋白,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的PPRV Nigeria 75/1株F基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除F基因信号肽和跨膜区的引物,进行RT-PCR扩增,并克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并初步应用于PPRV的检测。结果重组原核表达质粒pET-32a(+)-PPRV-F经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组F蛋白相对分子质量约59 000,诱导6 h表达量最高,且主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上;免疫小鼠制备的多抗能与纯化的重组蛋白发生特异性反应,抗体效价高于1∶64 000;间接免疫荧光试验显示,制备的多抗能够识别PPRV Nigeria 75/1株全病毒抗原。结论原核表达了PPRVF蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体,为其进一步研究及小反刍兽疫临床快速检测方法的建立奠定了基础。