类胚体形成对P19细胞向心肌细胞分化的影响

目的探讨类胚体(EBs)形成以及心肌细胞条件培养液对P19细胞向心肌细胞分化的影响。方法将P19细胞接种于铺有琼脂的6孔板中,形成EBs。用α-MEM培养液或心肌细胞条件培养液培养EBs或单层生长的P19细胞。观察细胞生长情况;免疫组化SP法检测心肌肌钙蛋白(cTnT)表达;Western blot法检测cTnT及心肌细胞缝隙连接蛋白43(Cx43)表达。结果单层培养的P19细胞未见cTnT及Cx43表达,免疫组化SP法检测示EBs经α-MEM培养液或心肌细胞条件培养液培养,生长晕中可见cTnT表达。Western blot法检测示心肌细胞条件培养液中cTnT和Cx43表达显著高于α-MEM培养液。结论 EBs形成结合心肌细胞条件培养液培养可有效促进P19细胞向心肌细胞分化,具体分化机制有待深入研究。     

P19细胞向心肌样细胞分化前后gp91-phox的变化

目的：探讨诱导P19细胞向心肌样细胞分化前后gp91-phox水平的变化。方法：P19细胞经0.9%二甲基亚砜（DMSO）于细菌培养皿中悬浮诱导培养4 d,待细胞聚集体形成,吸取聚集体接种于组织培养皿,贴壁培养至第13天。行Western blot检测肌钙蛋白I（cTnI）,以鉴定心肌样细胞的分化,并检测P19细胞向心肌样细胞分化前后细胞中gp91-phox蛋白水平。结果：（1）经0.9%DMSO诱导分化,P19细胞于第7天开始表达cTnI,随后cTnI表达明显增高并趋于稳定;（2）P19细胞分化为心肌样细胞后细胞内gp91-phox蛋白水平较分化前高（P〈0.05）。结论：P19细胞向心肌样细胞分化后gp91-phox表达上调,氧化应激水平增加。     

异源性心肌细胞裂解液诱导骨髓干细胞免疫源性的实验研究

目的将家兔心肌细胞裂解液体外诱导小型猪骨髓间充质干细胞（MSC）所得心肌样细胞回输入原动物,观察其是否激活机体免疫反应。方法将小型猪MSC体外经家兔心肌细胞裂解液诱导所得的心肌样细胞与单纯培养基培养的MSC分别回输入原小型猪体内,于不同时间点,采用流式细胞计数法检测外周血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞数目变化,ELISA法检测体外血清白介素（IL）-2、IL-4浓度变化,采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测细胞回输后小型猪脾淋巴细胞细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性。结果两组细胞回输入原小型猪体内后血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞数目,血清IL-2、IL-4浓度,在各时间点间差异均无统计学意义（P均〉0．05）,各组动物脾淋巴细胞CTL杀伤活性差异无统计学意义。结论经家兔心肌细胞裂解液诱导所得心肌样细胞回输入原小型猪体内,不激活机体免疫反应,提示采用此方法制备的心肌样细胞可能有较好的应用前景。     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

心肌细胞裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化作用

目的:用心肌细胞裂解液体外诱导分化骨髓间充质干细胞(SMCs),观察SMCs能否表达脑钠肽(BNP)及β1受体mRNA,是否具有受体后信号转导通路.方法:分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年小鼠长骨骨髓中分离MSCs,并用含有心肌细胞裂解液的培养基培养1周.用逆转录聚合酶链反应方法定性检测MSCs中BNP及β1受体mRNA水平,用放射免疫方法测定MSCs中环磷酸腺苷(cAMP)的含量.结果:诱导组SMCs能表达BNP及β1受体mRNA,对照组不表达BNP和β1受体mRNA.诱导的SMCs经10-8,10-7,10-6,10-5mol/L异丙肾上腺素(ISO)作用2 h后,均能增加细胞内cAMP含量,且具有ISO浓度依赖性(P＜0.05或P＜0.01).诱导的SMCs经不同浓度的美托洛尔(MET)10-6,10-5 mmol/L作用10 min后,和1×10-7mol/L ISO再一起作用110 min后,测定细胞内cAMP含量与空白组比较,差异无统计学意义;与10-7mol/L ISO作用结果比较,差异有统计学意义(P＜0.01),表明MET能完全阻断ISO升高细胞内cAMP作用.结论:心肌细胞裂解液能体外模拟心肌微环境诱导分化SMCs表达β1受体及BNP mRNA,并具有受体后活性的信号转导通路.     

桥粒芯胶蛋白-2基因沉默对P19细胞向心肌细胞诱导分化的影响

目的 探讨在P19细胞诱导分化成心肌细胞过程中,桥粒芯胶蛋白-2（DSC2）基因沉默对其的影响。方法 设计并合成针对DSC2基因编码区的干扰序列,构建真核细胞表达质粒并转染P19细胞。荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）技术检测DSC2在mRNA和蛋白水平表达变化,筛选出沉默效率最佳的细胞株。二甲基亚矾诱导分化为心肌细胞,观察其超微结构和细胞凋亡等改变,以及对纤维化与脂肪化相关基因mRNA水平表达的影响。结果 成功构建了5种ShDSC2重组质粒,转染P19细胞并获得稳定转染细胞株,筛选出对DSC2基因mRNA水平（69. 47% vs 0,P〈0. 01）和蛋白水平表达（65. 62% vs 0,P〈0. 01）的抑制效率最显著的ShDSC2鄄613组,并成功诱导分化为心肌样细胞后,电镜扫描显示后者细胞出现脂滴、空泡样变性、线粒体肿胀及嵴消失,流式细胞仪检测提示细胞凋亡显著增加,RT鄄PCR示纤维化相关基因（Collal、Colla2、Col3a1）与脂肪化相关基因（Adiponectin、PPAR-γ、C/EBP-α）的mRNA表达均显著升高。结论 建立能有效抑制DSC2表达的P19细胞株并分化为心肌样细胞,表现出与致心律失常型右室心肌病（ARVC）患者病理和分子生物学特点相似的表型特征,提示其可作为深入研究ARVC致病机制的前体细胞。     

二甲基亚砜和5-氮胞苷诱导P19细胞转化为心肌细胞的效率

目的分析二甲基亚砜(DMSO)和5-氮胞苷(5-Aza)诱导P19细胞转化为心肌细胞的效率,比较两者的区别。方法将研究对象分为3组。一组使用常规方法对P19细胞进行培养,为阴性对照组;一组使用DMSO 1.0%进行诱导;一组使用5-Aza 10μmol/L进行诱导。对所有研究对象使用RT-PCR法检测GATA-4基因相对表达量。结果 DMSO和5-Aza组诱导4 d后,细胞均以克隆集落方式增殖,梭形细胞明显增多。8 d出现自发性节律收缩的心肌样细胞。诱导后2 w,5-Aza组分化细胞明显多于DMSO组。RT-PCR法检测GATA-4基因相对表达量,除阴性对照组外,其他两组均表达心肌早期分化基因。每组15 d后表达量与本组7 d表达量相比较均明显增加。此外,5-Aza组诱导28 d基因表达量明显高于DMSO组28 d。结论 DMSO 1.0%和5-Aza 10μmol/L均可诱导P19细胞转化为心肌细胞,5-Aza 10μmol/L的诱导效率高于DMSO 1.0%。     

P19细胞移植对急性心肌梗死后心功能的影响

目的观察P19细胞经冠脉移植对急性心肌梗死后心功能的影响。方法 P19细胞体外诱导分化为心肌细胞,RT-PCR法检测GA-TA-4基因相对表达量。22只日本大耳白兔,随机分为P19细胞移植组(n=11)和培养液对照组(n=11)。通过结扎左冠前降支建立急性心肌梗死模型。冠脉结扎后7 d,细胞移植组和对照组直接经冠脉注入P19细胞和培养液。分别于心梗前、细胞移植前、细胞移植后1 w和4 w对兔进行超声心动图检查。结果移植后4 w,P19细胞移植组在射血分数(LVEF)、左室收缩末直径(LVESD)和舒张末直径(LVEDD)方面与移植前及对照组相比均有显著改善(P<0.05)。结论经冠脉移植的P19细胞可显著改善心功能。     

不同浓度的窦房结细胞裂解液对兔骨髓间充质干细胞的诱导分化作用

目的 探索不同浓度的窦房结细胞裂解液对兔骨髓间充质干细胞的诱导分化作用。方法 体外分离兔窦房结细胞并制备窦房结细胞裂解液。全骨髓贴壁法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,分别加入含1、5、10倍浓度的窦房结细胞裂解液作为诱导培养基,普通培养基培养作对照,观察细胞形态变化,通过免疫荧光染色法检测超极化激活的环核苷酸门控的离子通道蛋白HCN4的表达,免疫细胞化学染色检测心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达。结果 经1、5、10倍浓度窦房结细胞裂解液诱导后的细胞均表达cTnT和HCN4;4组间HCN4阳性细胞率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。随着细胞裂解液浓度的提高,所诱导成的阳性细胞数再逐步增加,但增加至5倍浓度以上,效果并不明显。结论 在一定范围内,不同浓度的窦房结细胞裂解液能够体外诱导骨髓间充质干细胞分化为起搏细胞,但并不遵从剂量效应关系。     

诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究进展

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是通过重编程体细胞而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞的一种细胞类型。iPSCs向心肌细胞分化是一种使心肌细胞再生,治疗心肌梗死、心力衰竭等相关疾病的一种新兴技术。本文通过对近年来发表的iPSCs向心肌细胞分化的相关文献的整理、总结和分析,介绍近年来iPSCs及其向心肌细胞分化的相关研究进展、所面临的问题以及未来的发展方向。     

体外定向诱导人工诱导多功能干细胞向心肌细胞分化

长期以来人们一直在研究心肌再生的可能性。人工诱导多功能干细胞由于其在跨越了胚胎干细胞所面临的医学伦理学问题的同时具有多分化潜能而成为人们研究的热点。在体外定向诱导人工诱导多功能干细胞向心肌细胞分化的试验中,研究者对细胞进行向心肌细胞分化的诱导,检测其分化效率;对分化的心肌细胞进行基因、蛋白水平的验证,并对细胞电生理特性进行比较分析,发现其与正常心肌细胞在各个方面均相似。这些研究为寻找心肌损伤后心肌细胞再生提供了理论基础,并为人们研究心肌细胞在疾病病因学、明确药物效能以及最终的患者特异性治疗方面有广泛的应用价值,为转化医学提供了前景。     

间充质干细胞向心肌细胞分化的诱导研究

间充质干细胞是具有多向分化潜能的成体干细胞,能在多种诱导条件下形成心肌细胞。化学因素:化学小分子可以通过改变间充质干细胞DNA甲基化和组蛋白修饰(乙酰化、甲基化和磷酸化等)等表观遗传特性;物理因素:电磁场和力学因素可以诱导间充质干细胞;生物因素:生长因子、激素等对心肌细胞的发育起着重要作用等这些诱导条件,在体外环境下成功诱导间充质干细胞分化为心肌细胞。该文阐述不同的诱导条件对间充质干细胞向心肌细胞分化的影响和相关机制。     

机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的研究

目的研究机械牵张对诱导多能干细胞向心肌细胞分化效率的影响。方法诱导多能干细胞形成拟胚体后将拟胚体分为四组:对照组(未行牵张处理),牵张组1(5-6天行24小时牵张),牵张组2(5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张),牵张组3(5-6天行24小时牵张,7-10天再行72小时牵张),通过对小鼠诱导多能干细胞施加20%形变率的机械牵张力后,于第15天,分别计数每组跳动克隆数目从而初步在上述四组中选出诱导效率最高组,此后用荧光免疫染色、Westernblot、RT-PCR和激光共聚焦法,进一步鉴定对照组和初步筛选出的牵张组最终分化效率和细胞成熟度差异。结果机械牵张刺激下,分化15天时,牵张组2的跳动克隆数上升(P<0.05),初步筛选出牵张组2可以提高分化效率;统计α-MHC免疫荧光染色面积发现牵张组2是对照组的2.1倍(P<0.05);牵张组2TroponinI的蛋白表达量为对照组的1.7倍(P<0.05);半定量PCR结果发现,心肌细胞标志基因β-MHC,MLC-2v及心肌细胞早期转录因子Nkx2.5的表达量分别提高了6.7倍、4.4倍和11.4倍(P值均<0.05);激光扫描共聚焦显微镜对分化来的单个心肌细胞进行α-actinin观察发现,牵张组2有利于心肌细胞的伸展和成熟。结论初步验证机械牵张力作为一种刺激诱导因素,20%拉伸形变率,牵张组2(贴壁的拟胚体5-6天行24小时牵张,7-8天再行24小时牵张)的处理方法可以显著促进诱导多能干细胞向心肌细胞的分化效率,为以后的深入研究和临床应用提供了实验基础。     

体外诱导间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

间充质干细胞是近年来一类倍受人们关注的干细胞,它有望成为心脏组织修复工程最理想的种子细胞。多项研究表明,间充质干细胞能在体外被诱导分化为心肌细胞,但是与其分化的相关因素和分化机制还需要进一步的研究探讨。     

心肌组织裂解液诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的探讨心肌组织裂解液定向诱导骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌样细胞的可行性。方法体外分离、培养及鉴定大鼠BMSCs,实验分为3组:空白对照组、正常心肌组织裂解液诱导组和梗死心肌组织裂解液诱导组。分别对第3代BMSCs进行定向诱导,倒置相差显微镜观察诱导后细胞形态变化。诱导4周后,Western-blot检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)、心肌连接蛋白43(Cx43)的表达。结果 P3代BMSCs CD34染色呈阴性,而CD105、CD106染色呈阳性。两个诱导组cTnT、Cx43蛋白表达量均高于空白对照组,且梗死心肌裂解液诱导组的蛋白表达量高于正常心肌组织裂解液诱导组,差异有统计学意义(P0.05)。结论正常心肌组织裂解液及梗死心肌组织裂解液均可诱导BMSCs分化为心肌样细胞,且梗死心肌组织裂解液组诱导分化效率更高。     

维甲酸通过抑制沉默调节因子1诱导P19细胞分化为神经细胞的机制

目的探讨维甲酸(RA)诱导P19向神经分化的潜在分子机制。方法适当浓度RA诱导P19细胞4 d,观察是否有神经细胞标志物β-Tubulin产生,同时观察对SIRT1和Notch1的影响。RT-PCR和Western印迹实验检测敲低SIRT1对β-Tubulin和Notch1的影响。Western印迹实验检测高表达Notch1是否对β-Tubulin表达水平产生影响。结果 RA诱导P19细胞4 d内β-Tubulin表达水平逐渐升高,SIRT1和Notch1表达水平明显降低,表明RA在4 d内能够明显地刺激P19细胞向神经细胞方向分化,并能够抑制SIRT1和Notch1信号通路。敲低SIRT1后,与对照组比较诱导分化4 d后神经分化标志物β-Tubulin水平升高,Notch1水平下降。高表达Notch1组在诱导神经分化4 d后β-Tubulin水平相对较低。结论 RA可能通过降低SIRT1而抑制Notch1信号通路,促使P19细胞向神经分化。     

鼠拟胚体来源细胞向肝细胞及心肌细胞分化的初步观察

目的观察微重力生物反应器内拟胚体（EBs）的形成及其EBs来源细胞的肝细胞与心肌细胞分化。方法将未分化鼠胚胎干细胞（Es细胞）以1×10^6／mL移人微重力反应器内旋转培养，6d后取出反应器内形成的EBs接种于培养板培养，使用含DMSO、地塞米松等IMDM培养液继续培养10d。动态观察EBs形成和EBs来源细胞分化细胞形态特征，采用Western blot、免疫荧光染色方法检测EBs来源细胞肝细胞及心肌细胞标志物的表达。结果生物反应器旋转培养6d形成均一的拟胚体，接种后移行细胞中出现肝细胞特征样细胞和自发性搏动细胞，Western blot检测到EBs来源细胞肝细胞标志物Alb表达，免疫荧光染色分别检测出肝细胞标志物Alb、AFP和心肌细胞标志物GATA4的表达。结论微重力生物反应器可加快EBs的形成。EBs来源细胞可有效地向肝细胞及心肌细胞分化，两种细胞之间可能存在相互作用。     

血管内皮生长因子对诱导多能干细胞向心肌细胞分化的影响

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)对小鼠诱导多能干细胞(iPSCs)向心肌细胞分化的诱导作用。方法采用悬滴培养法,分别以10、20、50 ng/ml的VEGF对iPSCs细胞进行诱导分化,自然分化作为阴性对照组,加入1%二甲亚砜诱导剂为阳性对照组,倒置显微镜下观察细胞生长情况,记录跳动的拟胚体出现的时间和数目,计算心肌细胞分化率,细胞免疫荧光检测心肌细胞cTnT的表达,RT-PCR检测心肌发育基因α-MHC和β-MHC mRNA的表达。结果与自然分化组相比,三个浓度组的VEGF均可提高iPSCs的心肌细胞分化率(P<0.05),浓度为20 ng/ml时,iPSCs的心肌细胞分化率最高;与二甲亚砜组相比无统计学差异(P>0.05)。分化的心肌细胞可自发搏动,同时表达心肌特异蛋白cTnT和调控心肌发育的基因α-MHC和β-MHC;VEGF可上调α-MHC和β-MHC的表达(P<0.05)。结论 VEGF可以促进诱导iPSCs向心肌细胞分化。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化的研究进展

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）是指从桑葚胚或附植前囊胚内细胞团分离的多潜能细胞,具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在过去的20余年中,随着对干细胞特征认识的加深,ES细胞已展示出很好的应用前景。Es细胞能够在体外不断自我更新并保持未分化的特性,在生长因子及某些药物的诱导下能够分化为心肌细胞、神经细胞、胰岛细胞、肝细胞及内皮细胞等3个胚层来源的各种体细胞。因此,Es细胞成为研究组织特点及功能、药物筛选及毒性实验、细胞移植替代治疗的理想供体细胞。