IGF-1对人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的探讨胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)对体外培养的人视网膜色素上皮(retinal pigmentepithelial,RPE)细胞缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。方法 取体外培养的第3-5代人RPE细胞,经不含IGF-1、含10.00μg.L-1、50.00μg.L-1、100.00μg.L-1IGF-1的无血清培养液处理24h后,通过RT-PCR分别检测HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的相对表达量,用Western-blotting分别检测HIF-1α蛋白和VEGF蛋白的相对表达量。结果 对照组、10.00μg.L-1、50.00μg.L-1及100.00μg.L-1IGF-1组人RPE细胞中HIF-1αmRNA相对表达量分别为:1.44±0.18、1.48±0.17、1.51±0.18、1.53±0.21,4组比较差异无统计学意义(F=0.320,P=0.811);而4组HIF-1α蛋白的相对表达量分别为0、678.17±101.49、1175.35±149.71、1467.77±262.76,4组比较差异有显著统计学意义(F=113.550,P=0.000),并随IGF-1浓度的增加,相对表达量增高,各组间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05);4组VEGF165mRNA及VEGF165蛋白的表达量比较,差异均有显著统计学意义(F=55.096,P=0.000;F=30.269,P=0.000),各组VEGF165mRNA及蛋白水平随IGF-1浓度的增加而增高,各组间比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 IGF-1能促进人RPE细胞HIF-1α蛋白的累积,诱导VEGF165mRNA及蛋白的表达,是导致增生性糖尿病性视网膜病变重要的细胞因子之一。抑制IGF-1表达可能是防治该病的有效靶点。     

shRNA抑制人RPE细胞HIF-1 α基因表达对VEGF及PEDF表达的影响

目的利用小发卡环RNA（shRNA）使缺氧培养条件下的人视网膜色素上皮（RPE）细胞缺氧诱导因子1α（HIF-1α）基因沉默，观察对血管内皮生长因子（VEGF）及色素上皮衍生因子（PEDF）的影响。方法体外转录法合成对HIF-1αmRNA序列的两个靶点的shRNA，对缺氧（150μmol／LCoCl2模拟）培养条件下人RPE细胞的HIF-1α进行干扰，使用RT—PCR检测HIF-1α、VEGF和PEDFmRNA的表达及Western印迹分析检测HIF-1α、VEGF和PEDF蛋白水平。结果HIF-1αmRNA的两种shRNA均能有效地抑制RPE细胞在缺氧条件下HIF-1α的表达，同时也有效地抑制VEGFmRNA和蛋白表达，并促进PEDF蛋白表达，但对PEDFmRNA的表达无影响。结论HIF-1αmRNA的shRNA能有效地使缺氧条件下RPE细胞HIF-1α基因沉默，进而有效地抑制缺氧对VEGF的上调作用，同时也促进PEDF表达。揭示了HIF-1与缺氧条件下PEDF翻译后的下调机制有关，是促进视网膜新生血管形成最为关键的细胞因子之一。     

shRNA抑制缺氧条件下人视网膜色素上皮细胞低氧诱导因子-1α基因对血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨缺氧条件下人视网膜色素上皮（hRPE）细胞低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法利用体外转录法合成针对HIF—1α mRNA序列的靶点之一的小发卡环RNA（shRNA）,以化学低氧诱导剂CoCl2模拟RPE细胞缺氧环境,对缺氧培养条件下hRPE细胞的HIF-1α进行RNA干扰,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF-1α和VEGF mRNA的表达,免疫印迹法检测HIF—1α和VEGF蛋白水平,以正常组、缺氧组及阴性转染组作为对照,观察其对HIF-1α基因的沉默效果及对VEGF表达的抑制作用。结果转染HIF-1α mRNA的特异性shRNA后,RT-PCR检测结果显示缺氧条件下hRPE细胞HIF-1α基因沉默效果为77．1％,VEGF mRNA的表达水平下降了27．8％;免疫印迹法检测结果显示HIF—1α和VEGF蛋白水平显著降低。结论针对HIF-1α mRNA的shRNA能有效地使HIF-1α基因沉默,进而抑制缺氧对VEGF的上调作用。（中华眼科杂志．2007。43：1022—1027）     

应用反义寡核苷酸沉默PDGFR-α表达对RPE细胞增生和凋亡的影响

背景 视网膜色素上皮( RPE)细胞能分泌血小板源性生长因子(PDGF),又具有PDGF受体(PDGFR),已有研究表明PDGF对增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的形成起着关键性作用. 目的 应用反义寡核苷酸( ASODN)技术抑制血小板源性生长因子受体-α(PDGFR-α)基因的表达,观察其对RPE细胞增生和凋亡的影响.方法 将人RPE细胞株在含质量分数10％胎牛血清的低糖DMEM培养基中进行培养,取对数生长期细胞调节细胞密度为5×105个/孔,接种于96孔板,待细胞生长至80％～90％融合时进行转染.空白对照组不加PDGFR-α ASODN及阳离子脂质体Lipofectamine 2000,1.0μmol/L Lipo-ASODN组、2.0μmol/LLipo-ASODN组使用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将靶向PDGFR-α基因的ASODN转染至RPE细胞株.细胞转染48 h后,MTT法检测各组细胞的吸光度(A)值并以A490表示,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PDGFR-α mRNA在RPE细胞中表达的变化;hoechst 33258荧光染色观察培养细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测RPE细胞的细胞周期和凋亡率. 结果 空白对照组、1.0 μmol/L Lipo-ASODN组及2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞的A490值分别为1.45±0.12、1.07±0.06、0.65±0.05,差异有统计学意义(F=97.72,P=0.00),1.0μmol/L Lipo-ASODN组和2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于空白对照组,差异均有统计学意义( P=0.00、0.00);2.0 μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞A490值明显低于1.0 μmol/L Lipo-ASODN组,差异有统计学意义(P=0.00).Hoechst 33258荧光染色显示,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞凋亡数量多于空白对照组.流式细胞仪检测表明,转染PDGFR-α ASODN后RPE细胞阻滞于G0/G1期(F=206.70,P=0.00),1.0 μmol/L Lipo-ASODN组和2.0μmol/L Lipo-ASODN组RPE细胞凋亡率均明显高于空白对照组(37.8±1.3 vs 10.5±0.1,61.2±1.9 vs 10.5±0.1)(F=1808.90,P=0.00).PDGFR-α在RPE细胞中的表达随PDGFR-α ASODN浓度的升高有降低的趋势. 结论 利用ASODN技术沉默PDGFR-α基因表达可以显著抑制PVR过程中RPE细胞的增生,并能诱导其凋亡,不同浓度PDGFR-α ASODN转染后能下调PDGFR-α mRNA的表达,PDGFR-α基因的ASODN靶向技术为PVR的基因治疗提供了实验依据.     

曲安奈德对缺氧条件下培养人RPE细胞HIF-1α及VEGF表达的影响

目的 探讨曲安奈德(TA)对体外缺氧培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)合成的影响.方法 研究人RPE细胞分别在150 μmol/L CoCl2 0 μh/mL TA(0μg/mL TA组)、150μmol/L CoCl2 50 μg/mL TA(50μg/mL TA组)和150 μmol/L CoCl2 200斗g/mL TA(200μg/mL TA组)的培养条件下,通过RT-PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达,使用Western blot检测其蛋白水平.结果 与0μg/mL TA组相比,50μg/mL TA组及200μg/mL TA组中VEGF mRNA及蛋白的表达明显下降,差异均具有统计学意义(P＜005),但HIF-1α mRNA及蛋白的表达无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 TA对缺氧条件下人RPE细胞HIF-1α表达无影响,但能有效地抑制VEGF的表达,对缺血性视网膜病变新生血管形成具有防治作用.     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞促血管生成素-1和促血管生成素-2表达的影响

目的 探讨缺氧环境下人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞中促血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang1)和促血管生成素-2(angiopoietin-2,Ang-2)表达变化及其可能的机制.方法 将人RPE细胞培养在厌氧箱中,以建立缺氧模型.按缺氧时间0h、1h、4h、12h和24 h分为5组,观察Ang-1、Ang-2与缺氧诱导因子-1 α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的变化;另取4h作为观察点,按处理因素分为缺氧对照组和HIF-1α抑制剂3-(5’-hydroxymethy1-2’-furyl)-1-benzyl indazole (YC-1)处理组,YC-1浓度分别为1μmol·L-1、10μmol·L-1和100 μmol·L-1,观察抑制HIF-1α后对Ang-1和Ang-2表达的影响. 应用免疫荧光染色法和Western blot分别检测Ang-1、Ang-2与HIF-lα蛋白的表达.结果 常氧条件下人RPE细胞内可见Ang-2蛋白表达,未见Ang-1及HIF-1α蛋白表达;缺氧条件下Ang-1和Ang-2分别与HIF-1α共表达于RPE细胞胞质中.HIF-1α与Ang-1在缺氧早期呈上升趋势,其中HIF-1α于缺氧后4h表达最高(0.451±0.022,与0h相比t=5.401,P＜0.05),24h后有所下降;Ang-1于缺氧后24 h表达最高(1.342±0.059,与0h相比t=20.100,P＜0.01);Ang-2表达几乎不变(1.542±0.129、1.621 ±0.131、1.574±0.146、1.624±0.027,与0h相比t=0.044、0.673、0.244、0.700,均为P＞0.05).浓度为1 μmol·L-、10 μmol·L-1和100 μmol·L-1的YC-1均可有效抑制HIF-1α蛋白的表达(t=21.583、27.154、27.431,均为P＜0.01).HIF-1α蛋白表达下调后,Ang-1蛋白表达也随之受到抑制(t=9.492、15.487、17.942,均为P＜0.05),而Ang-2蛋白表达无明显变化(f=0.859、0.178、1.565,均为P＞0.05).结论 缺氧条件下人RPE细胞表达Ang-1上调,并与HIF-1α表达具有时相关系,Ang-2无明显变化;抑制HIF-1α表达后,Ang-1表达随之降低.提示在脉络膜新生血管生成过程中Ang-1的表达可能受HIF-1α选择性调控.     

糖尿病大鼠视网膜中缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子表达的研究

目的:检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与血管内皮生长因子(VEGF)在糖尿病大鼠视网膜中的表达,探讨其在糖尿病视网膜病变(DR)发生发展中的作用。方法:SD大鼠120只随机分为对照组与DR组,DR组采用链脲佐菌素(STZ)一次性建立糖尿病模型。应用免疫组化SP法和RT-PCR技术分别于1,3,6mo检测视网膜中HIF-1α与VEGF蛋白及其mRNA的表达变化。结果:HIF-1α与VEGF蛋白及其mRNA在对照组视网膜中不表达,在DR组中呈进行性表达增强(P<0.05);DR组中HIF-1α与VEGF的表达呈正相关(r=0.605,P<0.05)。结论:DR视网膜中HIF-1α与VEGF表达增强,与DR的发生发展密切相关。     

大鼠视网膜胚胎发育过程中低氧诱导因子-1α及血管内皮生长因子的表达

背景研究发现低氧诱导因子-1（HIF-1）与机体缺氧的生理反应有关,并在胚胎发育过程中发挥作用。此外人视网膜胚胎发育过程中血管内皮生长因子（VEGF）呈高表达。但二者在胚胎期缺氧环境中的作用及相互关系仍有待研究。目的观察大鼠视网膜胚胎发育过程中HIF-1α和VEGF的表达变化,探讨HIF-1α和VEGF在视网膜胚胎发育过程中的作用和相互关系。方法30只清洁级SD孕鼠剖腹取出胚胎10、12、14、16、20d鼠,每组取5只孕鼠,每只孕鼠随机选取2只胎鼠进行观察。摘除胎鼠一侧眼球,分离视网膜并制备切片,用免疫组织化学法检测视网膜组织中HIF-1α、VEGF蛋白的阳性表达,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法分别检测不同胎龄大鼠及成年大鼠视网膜组织中HIF-1α mRNA及VEGF mRNA的表达。结果免疫组织化学染色表明,在大鼠视网膜胚胎早期（10～12d）即可检测到HIF-1α和VEGF蛋白均呈高表达,二者的表达强度均随胎龄的增加而减弱（F=56．70,P〈0．01;F=60．78,P〈0．01）,各胎龄组视网膜中HIF-1α和VEGF蛋白的表达量均明显高于成年鼠,差异均有统计学意义（P〈0．01）,随胎龄的增加HIF-1α蛋白在视网膜中的表达变化与VEGF蛋白表达呈正相关（r=0．96,P=0．00）。RT—PCR检测结果表明,大鼠胚胎早期（10～12d）即可检测到HIF-1α mRNA和VEGF mRNA在视网膜中均呈高表达,二者的表达均随胎龄的增加而减弱（F：68．84,P〈0．01;F=96．49,P〈0．01）,各胎龄组视网膜中HIF-1α和VEGF蛋白的表达量均明显高于成年鼠,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论大鼠视网膜胚胎发育过程中HIF-1α及VEGF的表达随着胎龄的增加均呈先高后低的动态变化趋势,提示HIF-1α／VEGF通路参与大鼠视网膜的胚胎发育过程。     

低氧诱导因子-1α干扰RNA对血管内皮生长因子mRNA表达的抑制作用

目的 探讨低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α．HIF-1α）特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α对低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor．VEGF）mRNA表达的抑制作用。方法 构建HIF-1α特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α通过脂质体Lipofectamine2000分别介导pSUPER^H1-SiHIF1α转染低氧状态下培养的人低分化鼻咽鳞癌细胞（nasopharyngeal carcinoma cell line，CNE2），对照组转染pSUPER空载体．采用半定量RT—PCR方法检测HIF-1αmRNA和VEGF mRNA的表达。结果 转染DSUPER^H1-SiHIF1α的CNE2细胞中HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达较对照组分别降低79．4％和65．7％。结论 HIF-1α特异性小片段干扰RNA表达载体pSUPER^H1-SiHIF1α能明显抑制HIF-1α mRNA和VEGF mRNA的表达。     

川芎嗪对人脐静脉内皮细胞缺氧相关因子表达的影响

目的 观察川芎嗪(TMP)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧相关因子表达的影响.方法 体外培养HUVECs,取2～5代细胞进行实验.将HUVECs分为对照组、氯化钴(CoCl2)缺氧组及50、100、200 μmol/L TMP药物处理组.对照组不作任何处理.CoCl2缺氧组利用150 μmol/L的CoCl2干预HUVECs 4 h;50、100、200 μmol/L TMP药物处理组在CoCl2干预HUVECs 4 h后,再加入不同浓度TMP继续培养8h.分别提取各组细胞RNA和总蛋白,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脯氨酰羟化酶2(PHD2)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白的表达.结果 实时RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,CoCl2缺氧组PHD2mRNA表达下降(t=3.734),HIF-1α和VEGF mRNA表达升高(t=4.589、3.926),差异均有统计学意义(P＜0.05).50、100、200 μmol/L TMP药物处理组分别与CoCl2缺氧组比较,PHD2 mRNA表达均升高(t=3.286、3.617、3.886),差异有统计学意义(P＜0.05);HIF-1α mRNA表达均无明显变化(t=1.025、0.726、-1.386),差异无统计学意义(P＞0.05);VEGF mRNA表达均有所下降,但50 μmol/L TMP药物处理组与之差异无统计学意义(t=1.696,P＞0.05),100、200 μmol/L TMP药物处理组与之差异有统计学意义(t=2.974、3.492,P＜0.05).Western blot检测结果显示,与对照组比较,CoCl2缺氧组PHD2蛋白表达下降,差异有统计学意义(t=3.122,P＜0.05);HIF-1α及VEGF蛋白表达均有不同程度升高,差异有统计学意义(t=3.778、3.257,P＜0.05).50、100、200 μmol/L TMP药物处理组分别与CoCl2缺氧组比较,PHD2蛋白表达均升高(t=2.813、3.026、3.078),差异有统计学意义(P＜0.05);HIF-1α、VEGF蛋白表达均有所下降,但50 μmol/L TMP药物处理组与之差异无统计学意义(t=2.056、1.986,P＞0.05),100 μmol/L TMP药物处理组(t=3.058、2.976)及200 μmol/L TMP药物处理组(t=3.828、3.136)与之差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TMP能上调缺氧HUVECs中PHD2 mRNA和蛋白的表达,下调HIF-1α蛋白、VEGF mRNA和蛋白的表达.     

缺氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子干扰性RNA对人血管内皮细胞血管内皮生长因子表达的抑制

目的 探讨缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）小片段干扰性RNA（siRNA）对人血管内皮细胞VEGF表达的影响。 方法 构建HIF-1α siRNA重组质粒。将体外培养的人血管内皮细胞（HUVEC-12）分成常氧（20%）组和低氧（1%）组。低氧组中，采用脂质体Lipofectamine ^TM 2000（LF2000）分别转染空载体质粒（空载体组）、HIF-1α siRNA（HIF-1α组）、VEGF-₁₆₅ siRNA（VEGF组）和HIF-1α siRNA+VEGF₁₆₅ siRNA（共转染组）。低氧组中未转染的细胞为对照组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）鉴定基因转染效率；RT-PCR和免疫细胞化学法检测各组细胞中VEGF基因和蛋白表达的变化。 结果 成功构建HIF-1α siRNA重组质粒。人血管内皮细胞转染24 h后，HIF-1α siRNA和VEGF-₁₆₅ siRNA重组质粒有表达。常氧组细胞中仅见微弱的VEGF mRNA和蛋白表达，而低氧组表达明显上调；HIF-1α组、VEGF组和共转染组表达较对照组减弱，其中共转染组抑制效果最明显。 结论 HIF-1α和VEGF₁₆₅ siRNA能有效抑制人血管内皮细胞VEGF的表达。     

缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子干扰性RNA抑制鼠视网膜新生血管的研究

目的 探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)小片段干扰性RNA(siRNA)对小鼠视网膜新生血管的抑制作用.方法 本研究采用随机对照方法.构建HIF-1αsiRNA重组质粒.C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pEGFP-N1,1 d后视网膜铺片观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达.选7天龄C57BL/6J小鼠90只,17只为正常组,73只建立氧诱导的视网膜新生血管模型,分为模型对照组、空载体组和基因治疗组(HIF-1α siRNA组、VEGF siRNA组及共转染组).于出氧舱前1 d,向空载体组小鼠玻璃体腔注射空载体质粒;HIF-1α siRNA组注射HIF-1α siRNA,VEGF siRNA组注射VEGF165 siRNA,共转染组注射HIF-1αsiRNA+VEGF165 siRNA.采用荧光造影视网膜铺片方法观察血管形态变化;制作组织切片计算突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;采用逆转录聚合酶链反应和Western blot检测视网膜HIF-1α和VEGF的表达.采用单因素方差分析和组间最小显著差法进行统计学分析.结果 pEGFP-N1经脂质体LF2000介导转染视网膜细胞后1 d即可见GFP表达.基因治疗组较模型对照组新生血管丛明显减少,荧光渗漏明显减轻,其中共转染组效果最明显.基因治疗组[HIF-1α siRNA组为(27.73±2.33)个,VEGF siRNA组为(15.43±3.23)个,共转染组为(8.70 ±2.88)个]较其他3组突破视网膜内界膜的细胞核数量减少,差异均具有统计学意义(F=3016.527,P＜0.01).视网膜HIF-1α mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.08±0.06,0.383±0.009)和空载体组(1.09±0.05,0.386 ±0.010)较正常组(0.81 ±0.07,0.035±0.003)上调,而HIF-1α siRNA组(0.46±0.06,0.182±0.008)较模型对照组下调,抑制效率分别为57.4%和52.5%,差异均有统计学意义(F=139.804,2686.001;P＜0.01).VEGF mRNA及蛋白表达水平:模型对照组(1.53 ±0.07,0.340±0.004)和空载体组(1.59±0.06,0.337±0.009)较正常组(0.27±0.08,0,051±0.008)明显上调,而基因治疗组较模型对照组明显下调,差异均有统计学意义(F=421.423,2513.583;P＜0.01),其中共转染组下调最明显,抑制效率分别为85.6%和80.9%.结论 HIF-1α siRNA和VEGF165siRNA均可有效抑制小鼠视网膜新生血管形成,两种siRNA共转染抑制效果最明显.     

HIF-1α、HPSE、VEGF共同促进视网膜母细胞瘤的恶性进程

目的 探讨视网膜母细胞瘤(RB)中乙酰肝素酶(HPSE)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及其与血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度(MVD)的关系.方法 应用免疫组织化学法检测34例RB石蜡标本及10例正常视网膜组织中HIF-1α、VEGF蛋白表达,用CD34抗体进行肿瘤血管内皮染色,计数肿瘤微血管密度(MVD);应用RT-PCR检测18例RB组织中 HPSE mRNA、HIF-1α mRNA、VEGF mRNA的表达,分析RB组织中HPSE、HIF-1α、VEGF表达情况及其与肿瘤微血管形成、临床及病理特征的关系.计量资料采用成组设计定量资料t检验、方差分析和q检验;计数资料采用χ~2检验、Fisher检验及秩和检验;相关性采用Spearman等级相关分析及kappa检验.结果 34例RB石蜡标本中HIF-1α、VEGF阳性表达率为58.8%、64.7%,明显高于正常对照组(χ~2=10.784,P<0.05;χ~2=9.269,P<0.05).18例RB中HPSE、HIF-1α、VEGF mRNA阳性率为55.6%、44.4%、72.2%,与正常组比较有统计学意义(χ~2=8.642,P<0.05;χ~2=6.222,P<0.05;χ~2=9.956,P<0.05).HIF-1α、VEGF与MVD的表达呈正相关(r=0.664,P<0.05;r=0.590,P<0.05);RB中HIF-1α mRNA、HPSE mRNA表达与VEGF mRNA表达呈相关性(Z=2.350,P=0.009;Z=2.940,P=0.002).结论 HIF-1α、HPSE可共同作用于VEGF这种促血管生成重要因子,在肿瘤血管形成中起一定作用.     

缺氧诱导因子-1α在早期糖尿病大鼠视网膜神经细胞中的表达

目的研究缺氧诱导因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)在早期糖尿病大鼠视网膜中的表达,以探讨其在糖尿病性视网膜神经细胞病变发生及发展中的作用。方法用链脲佐菌素制作糖尿病大鼠模型,在制模成功后1周、2周、4周、6周、8周、10周及12周取眼球组织,以年龄匹配正常大鼠作为对照组,分别以免疫组织化学染色及Westernblotting方法检测视网膜组织中HIF-1α表达的位置及表达量;同时,以Real-timeRT-PCR方法检测视网膜组织中血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowthfac-tor,VEGF)的mRNA表达水平。结果糖尿病模型诱导成功后1周,视网膜组织即有HIF-1α表达,主要位于节细胞层及内核层的细胞核内,4周时阳性细胞数大于1周(12.34±0.41vs9.32±0.74),6~10周达到高峰(分别为16.51±0.35,45.33±0.52和37.31±0.43),12周下降(9.82±0.54)。Westernblotting显示HIF-1α蛋白表达模式与免疫组织化学相似,1周时即有表达,6~10周达到高峰,12周下降。Real-timeRT-PCR结果显示视网膜组织VEGF的mRNA水平在基础状态下少量表达,糖尿病诱导成功后表达水平逐渐提高,8周达到高峰,之后开始下降。结论HIF-1α及其下游基因VEGF在早期糖尿病视网膜神经细胞中的瞬时高表达而不是持续表达,可能是早期糖尿病视网膜神经细胞损害的原因。     

缺氧及血管内皮生长因子对视网膜色素上皮细胞Opticin蛋白表达的影响

目的 探讨缺氧及血管内皮生长因子(VEGF)对视网膜色素上皮(RPE)细胞Opticin 蛋白表达的影响及其内在机制.方法 实验研究.原代培养人眼RPE细胞,取生长良好的第3～6代细胞,接种于含DMEM培养液的6孔板中,于缺氧条件下或加入不同浓度(1、10、50及100 μg/L)VEGF进行培养.逆转录聚合酶链反应(PCR)检测缺氧后RPE细胞中VEGF mRNA的表达.蛋白印迹法检测细胞内和细胞培养液中Opticin蛋白含量.明胶酶谱法检测细胞培养液中明胶酶活性.组间检测数据比较采用单因素方差分析.结果 蛋白印迹法检测,显示缺氧组RPE细胞内Opticin蛋白含量无明显变化;而RPE细胞培养液中,缺氧组Opticin蛋白含量明显下降.逆转录PCR检测,缺氧组12、24 h VEGF mRNA表达灰度值分别为0.81 ±0.04、0.67±0.07,均较正常对照组VEGF mRNA表达灰度值(0.21±0.03)明显升高,差异有统计学意义(F =483.60,P＜0.05).添加不同浓度的外源性VEGF后,RPE细胞内Opticin蛋白表达无明显变化;添加1、10、50及100μg/L的外源性VEGF后,RPE细胞培养液中,Opticin蛋白表达灰度值分别为0.65 ±0.02、0.52±0.04、0.23±0.03、0.30±0.03,均较正常对照组Opticin蛋白表达灰度值(0.73 ±0.04)明显下降(F=141.38,P＜0.05).明胶酶谱法分析,显示与基质金属蛋白酶-2相对应的位置出现明显的消化条带,且酶的活性随VEGF浓度的增加而递增.低浓度的乙二胺四乙酸可抑制由VEGF引起的RPE细胞培养液中Opticin蛋白含量减少.结论 缺氧及VEGF作用可影响RPE细胞培养液中Opticin蛋白分泌,可能与增多的基质金属蛋白酶-2对Opticin蛋白的酶解作用有关.     

缺氧诱导因子-1α与血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及相关性

目的:检测视网膜新生血管中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,研究其与血管内皮生长因子(VEGF)表达的相关性。方法:以高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立视网膜新生血管模型,取对照组和给氧组幼鼠眼球作荧光素血管灌注,病理切片及免疫组织化学检测,分别观察视网膜血管的改变,视网膜新生血管内皮细胞数目及HIF-1α,VEGF蛋白的表达。结果:给氧组视网膜可见大量新生血管形成,新生血管内皮细胞核数为(23.38±1.07)个,与对照组相比差异有极显著性(P<0.01)。HIF-1α蛋白表达在神经节细胞层和突破视网膜内界膜的新生血管。VEGF蛋白表达在内核层,神经节细胞层和突破视网膜内界膜的新生血管。两者表达呈显著正相关(r=0.931,P<0.01)。结论:在视网膜新生血管形成中存在HIF-1α,VEGF的高表达,且两者表达密切相关。     

ALK5抑制剂对转化生长因子-β1（TGF-β1）致视网膜色素上皮细胞纤维化的干预作用

目的　探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-beta1，TGF-β1）对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞向成纤维细胞转化的影响，及活化素受体样激酶5（activated receptor kinase 5，ALK5）抑制剂（SB-431542）对这一影响的干预作用。方法　体外培养人RPE细胞，随机分为对照组、TGF-β1处理组、TGF-β1+SB-431542处理组、SB-431542处理组。对照组不做任何处理，其余三组分别用10 μg·L^-1 TGF-β1、10 μg·L^-1 TGF-β1+30 μmol·L^-1 SB-431542、30 μmol·L^-1 SB-431542处理细胞24 h。MTT法检测各组RPE细胞增殖率；划痕实验观察各组处理后0 h、12 h、24 h RPE细胞迁移情况；免疫荧光法检测各组细胞ALK5蛋白的分布和表达；Western blot法检测各组ALK5、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原（collagen typeⅠ，ColⅠ）以及纤维粘连素（fibronectin，FN）蛋白的表达。结果　与对照组相比，TGF-β1作用于RPE细胞24 h后，可改变RPE细胞表型，使其呈成纤维细胞样外观，并明显促进RPE细胞增殖和迁移。10.0 g·L^-1 TGF-β1作用24 h后RPE细胞增殖率为对照组的（1.33±0.08）倍，30 μmol·L^-1 SB-431542作用24 h后RPE细胞增殖率为10.0 g·L^-1 TGF-β1处理组的（67.77±6.78）%。经TGF-β1作用24 h后RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达显著上调，分别是对照组的（3.69±0.37）倍、（1.76±0.05）倍、（2.58±0.18）倍、（1.86±0.11）倍、（1.74±0.08）倍；SB-431542可逆转TGF-β1诱导的ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白表达上调，分别是TGF-β1处理组的（67.73±5.15）%、（71.71±3.50）%、（79.87±0.05）%、（63.59±3.16）%、（83.07±2.31）%，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结论　TGF-β1可促进RPE细胞增殖、迁移，向成纤维细胞转化，并能显著上调RPE细胞内ALK5、VEGF、α-SMA、ColⅠ及FN蛋白的表达；SB-431542可通过抑制TGF-β1的作用而抑制RPE细胞的纤维化。     

低氧诱导因子1α在急性高眼压大鼠视网膜中的表达

目的了解低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)在急性高眼压大鼠视网膜中的表达,并探讨其在急性青光眼损伤中的作用。方法 80只Wistar大鼠随机分为对照组、穿刺组、加压后2h、12h、1d、3d、7d、14d组。对照组不做任何处理,穿刺组只进行前房穿刺不加压,加压各组前房灌注加压法制作急性高眼压模型。HE染色观察视网膜的形态学变化,免疫组织化学方法和RT-PCR方法观察HIF-1α蛋白和mRNA在视网膜中的表达情况。结果急性高眼压损伤后1d,光学显微镜下可见视网膜高度水肿,7d时水肿基本消失,14d时视网膜各层结构紊乱,明显萎缩变薄。HIF-1α蛋白和mRNA在加压后2h时表达增多(HIF-1α蛋白IOD值0.54±0.06,mRNA相对表达量1.5162±0.1199),12h达到高峰(HIF-1α蛋白IOD值1.73±0.10,mRNA相对表达量2.9041±0.1690),随时间推移表达逐渐减少,14d时降至最低(HIF-1α蛋白IOD值0.52±0.03,mRNA相对表达量1.2847±0.0434),但仍高于对照组(HIF-1α蛋白IOD值0.25±0.04,mRNA相对表达量1.0009±0.0480),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论大鼠视网膜的HIF-1α在急性高眼压后表达增加,该因子在急性青光眼发病机制中具有重要作用。     

HSP90抑制剂对缺氧诱导的RPE细胞SDF-1表达的影响

目的 研究热休克蛋白(heat shock protein 90,HSP90)抑制剂17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG)对缺氧诱导的视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)表达的影响.方法 将培养的第3代RPE细胞分为缺氧对照组、DMSO对照组和17-AAG预处理组.其中17-AAG预处理组根据浓度不同又分为6组:0.01 μmol·L-1、0.10 μmol·L-1、0.50 μmol·L-1、1.0 μmol·L-1、5.0 μmol·L-1、10.0μmol·L-1.利用氯化钴建立体外RPE细胞的化学缺氧模型,不同浓度的HSP90抑制剂17-AAG预处理RPE细胞1 h后给予12 h缺氧处理,RT-PCR和Western blotting方法检测SDF-1表达变化情况.结果 缺氧对照组、DMSO对照组和不同浓度17-AAG预处理组SDF-1 mRNA与内参B-actin mRNA光密度比值分别为0.89±0.04、0.93±0.07、0.62±0.06、0.52±0.06、0.43±0.06、0.28±0.04、0.21±0.04、0.17±0.03;SDF-1蛋白与内参B-actin蛋白光密度比值分别为0.76±0.04、0.80±0.06、0.65±0.04、0.34±0.03、0.20±0.02、0.16±0.02、0.07±0.02、0.05±0.01.与缺氧对照组比较,DMSO对照组SDF-1 mRNA和蛋白的表达无明显变化,而不同浓度17-AAG预处理组SDF-1 mRNA和蛋白的表达明显降低(p均<0.05),呈浓度依赖性.结论 HSP90的特异抑制剂17-AAG能有效抑制缺氧条件下RPE细胞SDF-1表达.