水稻OsEBP-89基因部分转录本中第1内含子的滞留

OsEBP-89基因是水稻中一个转录因子编码基因。该基因含有两个内含子，采用RT－PCR和Southern杂交等方法的检测结果表明，在OsEBP-89基因的部分转录本中，115bp长的第1内含子未被剪接。从水稻cDNA文库也筛选到了仍然保护有第1内含子的OsEBP-89基因的cDNA克隆。OsEBP-89基因第1内含子不完全剪接的转录本与正常成熟转录本的比例在水稻不同组织中是不同的。这是真核基因中内含子滞留的一个新的例子。     

水稻RAD21同源基因(OsRIX4)存在多种mRNA选择性剪接模式

稻RAD21同源基因(OsRIX4)存在着多种mRNA选择性剪接模式, 从中鉴定出一类特殊的剪接模式, 即一个组成型外显子内部的部分片段可以被单独剪除, 该类型不属于已知的5类剪接模式之一.这种剪接模式所产生的转录本能够独立地得到翻译. OsRIX4基因多转录本的表达各具组织特异性, 其中OsRIX4-4和OsRIX4-5转录本的表达量与水稻育性呈正相关. 这种剪接模式的发现, 可以为理解和定义植物mRNA剪接模式提供新的内容, 也凸显转录后mRNA加工和调控机制的复杂性.     

玉米C4 型pepc基因的分子克隆及其在小麦的转基因研究

通过LA-PCR方法，从当地玉米材料中获得了完整的玉米C₄ 型pepc基因。测序结果与GenBank中登录的玉米C₄ 型pepc基因序列进行比对分析表明，DNA序列的同源性达98.96%，mRNA同源性达99.38%，蛋白质的氨基酸序列同源性达99.38%，在DNA水平，两者之间有49处碱基差异， 18处发生在内含子区，18处发生在外显子处。在mRNA水平，两者之间有15处差异，但是这些差异在蛋白质水平上仅导致了4个非连续排列的氨基酸差异。构建了该基因的农杆菌二元表达载体pBAC214。通过PDS/1000He基因枪转化法，获得了该基因的转基因小麦。对转基因小麦进行的Southern杂交，结果表明来自玉米的鉴定pepc基因完全整合到了小麦基因组中。通过对转基因小麦叶片的可溶性蛋白质SDS-PAGE电泳分析，表明该基因在小麦中获得了正确的转录、剪接和翻译。通过对转基因小麦叶片中PEPC酶活性的初步测定，发现部分转基因植株叶片中PEPC酶活性提高了3-5倍，与玉米叶片中的PEPC活性相当。对转基因小麦旗叶光和生理指标的测定，发现部分转基因植株光合速率有所提高，并且气孔的开放程度与叶片中的PEPC活性紧密相关。说明完整的玉米C₄ 型pepc基因在小麦中可以正确表达和起到一定的生理作用。     

两个东亚钳蝎毒素非编码转录本: 蝎毒腺细胞存在NMD途径的证据

从中国东亚钳蝎（Buthus martensii Karsch,BmK)毒腺组织cDNA文库中分离到两个毒素基因的非编码转录本，命名为BaαTX15-SP和BmTXKβ-SP。核苷酸序列分析表明它们的5’端序列分别与BmαTX15和BmTXKβ毒素cDNA的5’UTR和上游ORF序列一致，下游则缺乏任何同源性。两个非编码转录本含有多个短的ORF（≤34aa),3‘端含有一个AATAAA加尾信号，距poly(A)尾14－18nt。基因组织结构分析表明，两个非编码转录本并非错误剪接的产物。研究结果为蝎毒腺细胞可能存在类似于哺乳动物和酵母的无义介导的mRNA降解途径提供了证据。     

果蝇3个新的小分子非编码RNA的鉴定

通过比较基因组和分子生物学方法分析了果蝇属中5种果蝇全基因组内含子区域的保守序列, 获得了3个新的非编码RNA基因. 其中一个为具有典型的box C/D家族保守元件及结构特征的核仁小分子RNA基因, 其功能序列可介导28S rRNA的C2673位点的核糖甲基化修饰. 另外两个为miRNA基因, 其转录序列可形成典型的miRNA前体茎环结构; 在果蝇发育的4个时期均可表达产生长度为23个核苷酸的成熟RNA分子. 结果还表明, 在长度为100~500 bp区间的黑腹果蝇基因内含子中存在396个多物种保守序列(MCIS), 这些序列除编码小分子RNA外, 还可能与影响基因转录或转录后加工的顺式元件有关.     

代谢型谷氨酸受体mGluR7的基因组结构及其家族蛋白胞外区的基因组结构比较

L－谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质，其代谢型丙氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用。为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础，通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱数据库查询等方法，构建了 覆盖mGluR7全长基因的基因组物理图谱，并采用鸟枪法策略对图中BAC克隆进行测序与拼接组装，最终得到准确度为万分之一的完整的基因组序列。序列分析表明：mGluR7基因是长达880kb的超大基因；其基因组GC含量为38％，重复序列含量为37．5％，由11个外显子和10个内含子组成，其中5个内含子长度超过100kb，内含子1长达285kb； 存在2个替换剪接转录本mGluR7α和mGluR7b。通过比较mGluR7基因家族3组8个亚型受体蛋白胞外区的基因组结构，发现它们对应的基因组结构分为3组，组内各成员的基因组结构较为保守，而组间各成员的基因组结构保守性较差，这种基因组水平的组内保守和组间差异是和蛋白质水平上的保守和差异一致的，提示这些受体的基本功能在进化的过程中有明显的分化。在含mGluR7的组内，尽管组内各成员的基因组结构趋于保守，但大部分含子长度变化幅度很大，揭示基因组结构变化的程度高于蛋白质水平的变化，这种变化预期是在基因表达的调控上体现其生物属性的。     

粟酒裂殖酵母一个新的box C/D snoRNA的鉴定、功能分析及进化意义

通过筛选粟酒裂殖酵母核内小分子RNA的cDNA文库，获得了一个新的小分子RNA序列。该RNA具有典型的box C/D snoRNA的保守元件和结构特征，并具有一段与25S rRNA互补的、长度为10个核苷酸的反义序列，推测其可指导25S rRNA G940 位点2’-O-核糖甲基化修饰。经dNTP浓度依赖性引物延伸实验验证，G940确实为2’-O-核糖甲基化修饰位点。功能元件比较分析揭示该snoRNA的上游反义序列与酿酒酵母snR60 的下游反义序列同源，故命名为snR60-Ⅱ。snR60-Ⅱ基因位于一个非编码RNA基因的内含子中，其产物由宿主基因转录后的RNA前体加工而来。这是酵母snoRNA由非编码RNA基因内含子编码的首次报道。通过计算机分析，本研究还从真菌和果蝇中分别发现了一批酵母snR60功能同源分子。在不同生物中，snR60存在独立基因编码、内含子编码和多顺反子转录等多种基因组织形式，表明snR60在进化过程中具有高度的移动性。     

利用ubi1内含子增强Bt cry1Ah基因在转基因玉米中的表达

Bt cry1Ah基因是从国内苏云金芽胞杆菌分离株BT8中鉴定克隆的新型杀虫蛋白基因. 本研究构建了两个含有Bt cry1Ah基因的植物表达载体, 在其中一个植物表达载体(pUUOAH)的玉米Ubiquitin启动子与cry1Ah基因之间插入了玉米泛素蛋白基因ubiqutin1的第一个内含子(ubi1). 利用基因枪法将其导入玉米(Zea mays L.)胚性愈伤组织中, 得到了可育的再生植株. PCR及Southern blot检测结果表明, cry1Ah基因已整合入玉米基因组中, 并稳定遗传至下一代. 对T₁及T₂代转基因植株进行ELISA检测, 发现pUUOAH载体转基因植株Cry1Ah蛋白的平均表达量提高了20%. 对T₂代转基因植株进行了田间抗虫性鉴定, 发现转cry1Ah基因玉米对玉米螟有很高的抗性, 并且pUUOAH载体转基因植株的抗虫性好于pUOAH(无内含子)载体的转基因植株. 以上结果表明, 玉米ubi1内含子可以有效增强cry1Ah在转基因玉米中的表达.     

大豆转录因子GmWRKY57B的基因克隆及功能分析

WRKY类转录调控因子在高等植物中构成一个基因超家族, 它不但广泛参与了植物对非生物胁迫和生物胁迫的反应, 还参与了生长发育及多种代谢途径的调控. 本研究构建了一个大豆cDNA文库, 采用酵母单杂交的方法, 用来自AtNPR1启动子区的W-box对构建的大豆cDNA文库进行筛选, 获得了GmWRKY57B基因, 该基因全长1033 bp, 编码299个氨基酸, 属于WRKY类转录因子的第Ⅲ组; 酵母挽救实验及凝胶阻滞实验均表明, GmWRKY57B能够与W-box特异性结合; 酵母体内的转录激活实验表明, GmWRKY57B在酵母细胞中具有转录激活功能; GmWRKY57B在大豆根、茎、叶中均有表达; GmWRKY57B基因在烟草中的过表达能够提高转基因烟草植株的抗旱性, 表明GmWRKY57B 基因在非生物逆境中有一定的功能.     

海岛棉GbKTN1对酵母细胞伸长的影响

用5′RACE/3′RACE从海岛棉(Gossypium barbadense)开花后10 d的纤维细胞中分离获得了GbKTN1 cDNA序列, 全长2006 bp, 包括113 bp的5′非翻译区、1563 bp的可读框及327 bp的3′非翻译区(不包括终止密码子TAA). 可读框编码521个氨基酸, 蛋白质分子量约为55 kD, 靠近GbKTN1 C末端的233~414 氨基酸残基间包含一个ATP结合功能区. Southern杂交证明, GbKTN1在海岛棉基因组中以单拷贝形式存在. 半定量RT-PCR结合Southern杂交分析表明, GbKTN1在海岛棉根、茎、叶及纤维细胞中均有表达, 以纤维细胞中的表达最高, 叶中最低. 利用裂殖酵母系统, 初步分析了GbKTN1对细胞伸长的功能, 发现该基因在酵母细胞中诱导表达后使细胞显著伸长, 平均为诱导前的2.18倍, 部分细胞呈不规则形状, 这是首次在活体(in vivo)中证明KTN1与细胞的伸长有关.     

粟酒裂殖酵母中3个新的box H/ACA snoRNA的鉴定及意义

真核生物rRNA和snRNA中特定位点的假尿嘧啶化修饰是由box H/ACA snoRNA指导的, 这些RNA通常具有保守的H和ACA元件以及“发夹-铰链-发夹-尾”的二级结构. 通过筛选cDNA文库, 从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中鉴定了3个新的box H/ACA snoRNA, 分别命名为SP12, SP16和SP20. 这些小分子RNA 3′末端都具有ACA类元件, 其二级结构中包含2或3个较大的类似发夹的结构. 尽管SP20 的H元件并不典型, 但能折叠成典型box H/ACA snoRNA的二级结构, 推测其具有指导18S rRNA上U1208和U1053两个位点的假尿嘧啶化修饰的功能. 相反, SP12和SP16的二级结构不同于SP20, 并且也没有与rRNA或snRNA互补的反义元件, 所以被称为“功能未知的向导snoRNA(orphan guide RNA”, 其功能尚有待阐明. SP12和SP16的基因都位于2个编码蛋白质基因的间隔区, SP16 snoRNA是从一个较大的RNA前体剪切加工而来. 有趣的是, SP20基因位于一个预测的蛋白质基因的编码区中, 但转录方向相反. Northern杂交和RT-PCR分析都无法检测到该蛋白质基因的mRNA, 表明该基因在细胞中的表达是不存在的. 这是粟酒裂殖酵母中一个推测编码蛋白质的基因位点反向编码一个小分子RNA的首次报道.     

油菜Polima和陕2A细胞质雄性不育系相关基因的序列比较

orf224是在油菜Polima胞质中发现的一个与细胞雄性不育相关的线粒体基因，陕2A不育系则是我国第一个大面积推广的杂交油菜品种“秦油2号”的亲三，Polima和陕2A的基因组DNA为模板，通过合成5′和3′端一对待异引物，利用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR）从两个不育系的基因组DNA中都扩增出了与orf224同源的DNA片段，将其克隆到pGEM-TEasy载体上进行序列测定，测序结果表明：两序列均由675个核苷酸组成，编码224个氨基酸组成的多肽，两序列的核苷酸及推导出的氨基酸同源性分别为99．9％和99．6％，在＋398处两者有一个碱基的差异（AAC→AGC）和一个氨基酸的差异（Asn→Ser），从而证实了Polima和陕2A为线粒体上同一座位的不同等位基因的差异。     

水稻三角颖突变体tri1的遗传分析与基因克隆

籽粒形状与大小是影响水稻产量和品质的重要因素. 本研究在经⁶⁰Co-γ射线辐射粳稻品种台北309的后代中分离获得一个三角颖突变体tri1(triangular hull 1). 与野生型相比, tri1籽粒颖壳呈三角形, 粒厚增加, 蛋白质含量升高, 株高和千粒重降低. 遗传分析表明, 该突变性状能稳定遗传, 受一对隐性核基因控制. 采用图位克隆法将目的基因精细定位于水稻第1染色体长臂上分子标记CHR0122与CH0127之间, 物理距离约47 kb, 并与分子标记CHR0119共分离. 在该区域内共有6个候选基因, 测序分析表明tri1突变体中一个释义基因OsMADS32的第3外显子内缺失了一个碱基A, 导致移码突变和翻译提前终止; RT-PCR分析表明, OsMADS32主要在水稻幼穗中表达, 在根、茎、叶和发育的种子等组织中的表达量极低, 说明OsMADS32基因与花的发育与关. 据此, 推测OsMADS32基因可能为TRI1的候选基因.     

人类肽-甲硫氨酸亚砜还原酶的cDNA克隆、组织表达谱特征及染色体定位

蛋白质结构中某些氨基酸的氧化和还原是生物体内对蛋白功能的一种调控方式．甲硫氨酸（Ｍｅｔ）被氧化则变为甲硫氨酸亚砜（Ｍｅｔ（Ｏ）），它可导致所在蛋白质的生物学活性降低或丧失，但肽－甲硫氨酸亚砚还原酶（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ， ｍｓｒＡ）则可使甲硫氨酸亚砜还原为甲硫氨酸，使其所在蛋白质重新恢复活性．为了研究人体中Ｍｅｔ氧化还原的机制，以牛ｍｓｒＡ ｃＤＮＡ序列为信息探针，筛选人ＥＳＴ数据库，依据若干同源ＥＳＴ的信息从人ｃＤＮＡ分子库中克隆到一个长１２５５ｈｐ的人ＭＳＲＡ ｃＤＮＡ．该ＣＤＮＡ包含一个长７０５ ｂｐ的可读框，它编码了 ２３５个氨基酸残基．同源性比较表明，该基因与牛和大肠杆菌的ｍｓｒＡ基因的氨基酸一致性分别为８８％和６１％．表达谱分析发现，该基因在人体大多数组织中均有一条长约１．６ｋｂ的转录本，并在肾中呈高表达．应用辐射杂种细胞株定位系统（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｐａｎｅｌ， ＲＨ ｍａｐｐｉｎｇ）将该基因精确定位在人染色体８ｐ２２～２３区带的ＤＳＳ５１８和Ｄ８５５５０位标之间，由于此前已有Ｋｅｒａｔｏｌｙｔｉｃｗｉｎｔｅｒｅｒｙｔｈ     

水稻紫色种皮基因Pb的精细定位与候选基因分析

紫米因其种皮内花色素苷的沉积而着色．控制种皮着色的Pb基因位于水稻第4染色体，紫色种皮对白色种皮呈显性．本研究利用培矮64S（白米）×豫南黑籼糯（紫米）和培矮64S×川黑糯（紫米）两个F2分离群体对P易基因进行了精细定位．首先用SSR标记将P易基因初步定位在距微卫星位点RM3820下游0．79cM的位置．然后，通过在候选区域内发展高密度的InDel标记和CAPS标记，将P6基因限定在两个InDel标记RID3与RID4之间25kb范围以内．在该区段内，TIGR水稻基因组（R．5）标有两个注释基因：一个为与玉米k基因同源的砌，为控制花色素苷代谢的Myc类转录因子；另一个为与拟南芥刀四同源的bhlh16，也与植物色素代谢有关．根据两者的性质和前人相关研究结果，推测Pb与Ra实为同一个基因．序列分析结果表明，与白米品种培矮64S，9311（籼）和日本晴（粳）相比，豫南黑籼糯和川黑糯中Ra基因第7外显子存在一个GT缺失．根据GT缺失发展了一个CAPS标记CAPSRa，并对两个F2分离群体和100余份水稻品种进行分析．结果发现，所有F2白米单株以及所有白米（n=63）和红米（n=23）品种的CAPSRa基因型与培矮64S相同，而所有紫米品种（n=20）与豫南黑籼糯和川黑糯相同．据此推测，水稻紫色种皮性状可能由Ra基因第7外显子内的GT缺失引起．     

大豆GmLlsl基因的克隆及表达调控分析

玉米的叶片坏死斑点(lethal leaf-spot 1,Lls1)基因及其拟南芥中的同功能基因已证明编码叶绿素分解代谢中的关键酶脱镁叶绿酸氧化酶(pheide a oxygenase,PaO)．为了深入研究大豆叶片衰老过程中叶绿素分解代谢的调控机制,从大豆中克隆了玉米Lls1的同源基因,其cDNA全长1817bp,命名为GmLls1(GenBank登录号：DQ154009)．序列分析表明,该基因与拟南芥、玉米、豇豆和番茄等的Lls1及其同功能基因具有很高的同源性,其编码蛋白含有典型的Rieske[2Fe-2S]结构域、非亚铁血红素铁结合域和C-末端CXXC基序,这些都是PaO功能蛋白所具有的典型结构特征．RT-PCR结果显示,在大豆叶片自然衰老、人工黑暗诱导衰老和子叶衰老3个系统中,GmLls1基因都表现出明显的衰老上调趋势．进一步分析发现,在因敲减类受体蛋白激酶rlpk2基因而导致衰老延缓的大豆转基因叶片中,GmLls1的表达显著下降,而在因过表达rlpk2而导致加速衰老的转基因叶片中,GmLls1的转录本积累明显增加,暗示RLPK2介导的信号途径可能参与调控GmLls1在大豆叶片衰老过程中的表达,而rlpk2-RNAi转基因离体叶片光照下表现出lls1突变体典型的斑状失绿坏死表型则进一步支持了上述推论．     

转芪合酶基因植物中三羟基反式芪的功能

应用RT－PCR方法，从葡萄组织中克隆了两个芪合酶基因的编码区（1．19kb)。在大肠杆菌中能特异表达42ku的蛋白质，其分子量与芪合酶大小一致，并用其制备了兔抗血清。利用pBin438构建了植物组成型表达载体，经农杆菌介导获得转基因烟草植株。PCR，Southern blot,Western blot和RT－PCR分析证明该基因已整合到烟草的染色体中，并正常转录和特异表达。薄层层析和HPLC的结果进一步判断表达的芪合酶在烟草中可催化其底物合成3，4′，5－三羟基反式芪（trans-resveratrol),从转基因烟草中纯化的3，4′，5－三羟基反式芪能使人乳腺癌细胞停留在Go,G1期的细胞数增加。     

嗜水气单胞菌hfq2基因对生物被膜形成的影响

Hfq蛋白是一种进化上保守的sRNA分子伴侣蛋白,在转录后水平调控RNA翻译,涉及细菌重要生理功能的调节.嗜水气单胞菌ATCC 7966基因组中含有两个hfq基因拷贝(AHA_0924与AHA_3797),目前对AHA_3797(简称hfq2)基因功能的研究比较少.本研究首先利用同源重组技术敲除该基因,发现hfq2缺失后形成生物膜的能力显著降低(P0.001),进一步通过SWATH(sequential window acquisition of all theoretical spectra)定量蛋白质组学技术比较野生型与Δhfq2在生物膜状态下的蛋白表达差异,共鉴定出1538个蛋白,其中131个蛋白表达上调, 140个蛋白表达下调.生物信息学分析表明,生物被膜状态下Δhfq2导致细菌铁离子转运相关蛋白表达上调,趋化作用相关蛋白则大幅度下调.进一步利用Western Blotting对部分差异蛋白的表达进行了验证.最后通过铁离子螯合剂添加试验证实, Hfq2蛋白可以通过影响铁离子动态平衡过程来影响细菌生物被膜的形成.了解Hfq2蛋白在细菌生物被膜形成过程的调控机理,对病原菌的防治以及新型抑菌策略的研发具有重要的科学意义.     

不能利用脯氨酸为惟一碳氮源生长的费氏中华根瘤菌突变株的筛选及鉴定

费氏中华根瘤菌可以利用脯氨酸作为唯一碳、氮源生长，本研究利用转座子Tn5gusA5随机插入诱变的方法得到6000多株突变子，并从中筛选到一株脯氨酸代谢缺陷的突变子GXHN100。通过插入位点的定位及序列分析，发现插入位点位于一个未确定功能的ORF内，将该ORF命名为pmrA（Proline metabolic relative ）。通过原位杂交从构建的部分基因文库中获得一个阳性克隆pGXHN100（含有3.3Kb外源片段），序列分析表明它包含了插入基因的完整序列。将3.3Kb的pGXHN100外源片段连接到广宿主载体pLAFR₃上获得重组质粒pGXHN200,通过三亲接合，将pGXHN200导入GXHN100获得互补菌株GXHN200。植株实验发现，突变体GXHN100结有效瘤，固氮酶活与出发菌株无显著差异，但结瘤时间延迟，结瘤效率及竞争结瘤能力下降。     

表达血管内皮生长因子受体2胞外全长片段的重组鼠沙门氏菌对小鼠肿瘤的预防作用

研究目的基因在减毒鼠伤寒沙门菌中的稳定表达及以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的口服基因疫苗体内代谢情况, 并探讨重组疫苗菌防治小鼠肿瘤的可行性. 将真核表达载体pcDNA3.1+/VEGFR2_(n1-7)导入鼠减毒伤寒沙门氏菌SL3261中构建口服重组疫苗菌疫苗SL3261-pcDNA3.1+/VEGFR2_(n1-7). 通过PCR扩增检测真核表达载体中真核启动子CMV; 通过透射电子显微镜下检测重组疫苗菌形态和鞭毛结构, 观察连续传代后重组疫苗菌内目的基因能够稳定表达且不影响重组疫苗菌的生长特性. 重组疫苗菌经由灌胃对小鼠进行基因免疫后, 透射电子显微镜下在小鼠的肝、脾、小肠、大肠组织中可检测到减毒沙门氏菌的分布. 2周后用CT-26小鼠结肠腺癌细胞进行攻击, 疫苗组小鼠肿瘤生长明显受抑制, 且生存期远远超过对照组小鼠(P<0.05), 免疫组化显示免疫组小鼠肿瘤组织内CD4⁺及CD8⁺ T细胞浸润. 肿瘤组织超微结构显示疫苗组小鼠肿瘤细胞分化较两对照组为好. 本研究证实外源性目的基因能够在鼠减毒沙门氏菌中长期稳定表达, 且不影响沙门氏菌的生长特性; 并且该重组疫苗菌可将具有治疗性目的基因带入机体并产生抗瘤效应而本身对机体无明显的毒性效应, 为减毒沙门氏菌作为口服基因疫苗的载体及其在体内的分布代谢提供了理论依据, 为肿瘤的预防和治疗提供一条简便、安全、有效的途径.