抗SARS 人源单链抗体H12的表达及复性

从SARS免疫抗体库获得的一株抗SARS-CoV人源单链抗体H12,亟待鉴定。为了快速制备大量具有生物活性的单链抗体H12,构建了pET28a-H12原核高表达载体,表达量占菌体总蛋白质30%以上。采用稀释复性和分子筛柱复性两种方法对包涵体蛋白进行复性与纯化,结果显示两种方法都能使得单链抗体复性。与稀释复性法相比,柱复性效果更好,其抗原结合活性是稀释复性法的1.51倍。柱复性后的单链抗体亲和力测定的解离常数K_d为73.5nmol/mL。为进一步研究单链抗体H12的功能奠定了基础。     

人三叶因子3在毕赤酵母中表达条件的研究

为提高人三叶因子 3 (HumanTrefoilfactor 3 ,hTFF3 )在毕赤酵母中的表达量 ,研究了转化子生长的培养条件 ,包括不同碳源对转化子生长的影响和接种量、甲醇浓度、pH值、摇瓶转速及不同诱导时间对人三叶因子 3表达的影响。结果表明转化子在生长阶段加入葡萄糖生长旺盛 ,培养 14h后OD₆₀₀ 就可达到 50。在 100mL生长培养基上的菌液以 1∶1接入诱导培养基时蛋白表达量最高 ;转化子在 1%的甲醇、pH60、摇瓶转速240r/min的条件下诱导4 8h ,菌体密度OD₆₀₀为 15 ,目的蛋白表达量达到 20mg L。用 5L发酵罐进行了高密度发酵 ,经2%甲醇32h诱导 ,最终菌体密度OD₆₀₀ 达到 120 ,每升发酵液中含目的蛋白100mg。     

抗人VEGF受体Ⅱ基因Ⅲ区单链抗体基因的构建和表达

采用RT-PCR技术从分泌抗人血管内皮生长因子受体Ⅱ（kinase insert domaincontaining receptor,KDR）基因Ⅲ区单克隆抗体Ycom1D3的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL可变区基因,通过重叠延伸拼接（spliceoverlap extension）PCR方法在V_H和V_L基因之间引入柔性短肽（Gly₄Ser）₃,体外构建Ycom1D3单链抗体基因Ycom1D3-ScFv）,将其克隆至pAYZ表达载体,在大肠杆菌中表达。SDS-PAGE和Westernblot分析结果表明,Ycom1D3-ScFv在E.coli 16C9中获得表达,重组蛋白的相对分子量为30kD,与预期结果一致。表达产物主要以不溶性包涵体形式存在,经过溶解包涵体,TALON 金属亲合层析基质（TALON metal affinity resin）纯化和体外复性过程,获得了高纯度的单链抗体片段。流式细胞分析结果证实该单链抗体可与人脐静脉内皮细胞结合,保留了鼠源单抗与KDR抗原的特异性结合活性。抗KDRⅢ单链抗体基因Ycom1D3-ScFv的成功构建和功能性表达为靶向诊断治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。     

超抗原SEA与抗黑色素瘤ScFv融合基因的构建及表达

采用酶切连接和重叠PCR连接两种方法将抗黑色素瘤单链抗体基因和去除N端信号肽的金黄色葡萄球菌肠毒素A基因进行融合,并将融合基因克隆于pET28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)。用NiNTA系统对表达产物进行分离、纯化。MTT法检测融合蛋白对黑色素瘤细胞的体外抑制率。结果表明6HisScFvSEA融合蛋白可在E.coli BL21(DE3)中稳定表达,表达量占菌体蛋白的30%,主要以包涵体的形式存在。融合蛋白可通过激活效应细胞对表达相关抗原的黑色素瘤细胞发挥抑制作用。     

高密度培养大肠杆菌YK537/pSBHL11生产重组人细胞白介素-3

在B.Braun ES-10型15L和NBS BioFlo 3000型5L发酵罐中,利用补料分批培养技术高密度表达培养含重组质粒pSBHL-11的大肠杆菌YK537,生产重组人白细胞介素-3(IL-3),发现在发酵过程中,限制性流加甘油,控制溶解氧在30%～40％左右、30℃生长11h,42℃诱导培养4h,能将发酵液中最终菌体密度从OD₁₆600提高到OD₅₃600(相当于每升发酵液含106克湿菌体),并且保持了白细胞介素-3的表达量,占菌体总蛋白的30%左右,含量超过3.3%g/L,使IL-3包涵体产量从湿重2.2g/L提高到8.5 g/L,纯化步骤比较简单,超声破菌后经两次洗涤纯度就达到70%以上。     

溶氧反馈分批补料高密度培养人骨形成蛋白-2工程菌

对表达人骨形成蛋白2成熟肽的基因工程大肠杆菌E.coli DH5α/pDH-B²m在500mL摇瓶中进行了培养条件的摸索实验,并在此基础上扩大至NBS Bioflo IV 20L发酵罐,利用溶氧反馈-分批补料培养技术：在培养过程中保持适当的溶解氧（40%）,以溶氧值在线反馈控制搅拌速度及流加补料培养基,使细菌保持适当的比生长率,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终菌体密度达OD₆₀₀=57,每升干菌量22.8 g,目的蛋白的表达量占细菌总蛋白的30%,人骨形成蛋白2成熟肽的理论产率达到3.59 g/L。      

重组人血管内皮抑制素（rh-Endostatin）大肠杆菌表达体系发酵条件的优化

优化了重组人血管内皮抑制素的E. coli表达体系的发酵条件。利用E. coli表达体系得到了较高的产量,在9h左右的发酵周期内达到OD600值140,包涵体蛋白产量为3 g/L。主要优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG）的终浓度、诱导时间、培养温度、补料控制方法等条件,并且在诱导后提高培养温度到40℃,在非常短的培养周期内达到了高密度培养的目的。利用E. coli表达,继而通过复性获得有活性的重组人血管内皮抑制素,成本低、生产过程稳定可控、得到的蛋白性质稳定,符合工业生产的需要。     

苏云金杆菌vip3A基因的克隆、表达及杀虫活性分析

用全长PCR方法从野生型苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）菌株S184中克隆了2.3 kb大小的vip3A基因并进行了序列分析。将vip3AS184基因插入表达载体pQE30构建了表达质粒pOTP,转化大肠杆菌M15,转化子经1mmol/L IPTG诱导后可表达89 kD大小的Vip3A-S184蛋白,并得到Western blot证实。蛋白可溶性试验表明,目的蛋白中约有19%是可溶的,用透射电镜观察到大多数蛋白是以包涵体形式存在的。因此,可以在自然条件下进行目的蛋白的纯化和对家兔进行免疫制备多克隆抗体,用于苏云金杆菌Vip3A蛋白表达的检测。利用IPTG进行诱导培养的菌液对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、斜纹夜蛾(S.litura)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)等3种害虫的初孵幼虫进行生物测定,结果表明,Vip3AS184蛋白对夜蛾科害虫具有较高的杀虫活性。     

重组人载脂蛋白A-Ⅰ在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高表达

高密度脂蛋白 (High densityLipoprotein ,HDL)是血浆中重要的脂蛋白 ,其主要成分为载脂蛋白AⅠ(ApoliproteinAⅠ ,ApoAⅠ为了大量制备该蛋白 ,首先尝试利用Pichiapastoris表达系统高效表达ApoAⅠ。通过PCR扩增获得天然含人载脂蛋白ApoAⅠ的基因片段 ,将其插入到P .pastoris分泌型载体pPIC9K上 ,BglⅡ酶切线性化后电转化P .pastorisGS115 ,将获得的 1000多个转化子依次在含不同G₄₁₈浓度的YPD平板筛选高抗性转化子 ,得到的2 2个高抗性转化子经甲醇诱导 ,SDS PAGE检测得到 6株高表达菌。然后对其中的高表达菌株AP16的培养及诱导条件进行了优化 ,结果显示 :接种后培养 24～ 28h ,转入诱导阶段 ,培养基pH值在 7～ 7.5 ,菌体密度OD₆₀₀ =80左右 ,以 1%甲醇诱导 96h最有利于ApoAⅠ的表达 ,表达水平达 160mg/L。 14L发酵罐结果显示表达水平与摇瓶相当 ,均高于其它表达系统 ,为大批量制备奠定了基础.     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在大肠杆菌中组成型表达及分离纯化

将粪产碱杆菌青霉素G酰化酶基因构建重组表达质粒pKKFPGA ,pKKFPGA再转化宿主菌DH5α,所得重组菌不需诱导便能高效表达青霉素G酰化酶 ,表达量达 2590u L ,比野生型粪产碱杆菌表达量高432倍 ,其菌体比活力达300 (u L) A₆₀₀。菌体破碎后的上清液经DEAE-SepharoseCL 6B离子交换层析和Butyl-SepharoseCL 4B疏水层析 ,即可得纯度提高 20倍、比活为 686u mg的青霉素G酰化酶 ,两步纯化的总收率达 91%。Western印迹分析表明5%的原前体青霉素酰化酶在胞内形成了包涵体 ,说明其成熟的限速步骤在胞内的运输阶段.     

腈水解酶psn基因工程菌的发酵及产酶条件优化

来自恶臭假单胞菌的腈水解酶具有高效催化3-氰基吡啶产烟酸的能力,对表达该酶的基因psn进行发酵和产酶条件优化,通过对C源、N源、磷酸盐、金属离子、温度、诱导剂浓度和诱导时间进行单因素考察,获得最适培养基条件(g/L):葡萄糖5、蛋白胨15、酵母粉5、(NH4)2SO45、K2HPO424.5、KH2PO45.76、MgSO40.48;最佳诱导条件:培养2.5 h后添加IPTG诱导,浓度0.2 mmol/L,诱导温度30℃。在该条件下培养,重组大肠杆菌的腈水解酶比酶活可达到45.67 U/mL,比优化前提高了2.26倍。在此基础上,于5 L发酵罐上进行C、N源的补料研究,获得最适分批补料策略,发现其腈水解酶活力可达到75.40 U/mL,是优化前的3.74倍。     

应用正交实验法优化大肠杆菌表达CTB-PSMA624-632蛋白的条件

通过基因工程方法,将含霍乱毒素B亚单位(CTB)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)表位肽的重组质粒pET28a-CTB-PSMA624-632,转化表达宿主菌BL21 (DE3)。CTB蛋白的表达有利于开发粘膜佐剂和霍乱弧菌基因工程疫苗,同时抗原肽疫苗也是肿瘤免疫治疗的理想候选。本研究采用正交实验法,优化条件以增加大肠杆菌中CTB-PSMA624-632蛋白的表达量。选取了5个单因素作为考察因子,分别为:预诱导时间、诱导时间、诱导温度、IPTG浓度、诱导转速。先做了4水平的实验L16(45)。根据极差分析的数据对影响较大的3个因素又做了细调型的3水平实验L9(33)。结果表明,在早期指数生长期的诱导能得到相对高水平的包涵体形式的CTB-PSMA624-632蛋白,并且此蛋白的表达随着诱导温度升高到37℃而逐渐增加;相比于使用正常浓度的IPTG诱导得到的蛋白表达量,用100%μmol/L诱导足以诱导蛋白的表达,这比通常使用的IPTG浓度小10倍;此外,诱导时间5 h与7 h对蛋白的表达量差距甚微,因此选定较短时间的5 h,240 r/min的诱导转速也被认为是能诱导目的蛋白CTB-PSMA624-632具有高表达量的最优条件。     

集胞藻PCC 6803蛋白SpPhaB和SpPhaE的原核表达及结晶条件筛选

【目的】克隆蓝藻集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的编码基因并构建原核表达载体,优化培养条件以提高在大肠杆菌中可溶蛋白的表达量,筛选SpPhaB结晶条件,为PHB家族蛋白的结构与功能研究提供基础。【方法】克隆集胞藻PCC 6803 PHB合成途径的phaB、phaE基因,将phaB、phaE基因构建到表达载体pET28a中,优化IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,提高在大肠杆菌BL21(DE3)中SpPhaB和SpPhaE可溶蛋白的表达产量,经Ni柱亲和层析纯化分别获得His-SpPhaB和His-SpPhaE蛋白,进一步筛选SpPhaB结晶条件。【结果】构建了pET28a-SpPhaB和pET28a-SpPhaE表达载体;优化获得SpPhaB可溶蛋白的最佳表达条件为：诱导温度37 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.1 mmol/L、诱导时间7 h;SpPhaE的可溶性蛋白最佳表达条件为：诱导温度25 °C、转速220 r/min、IPTG浓度0.5 mmol/L、诱导时间7 h,并获得了SpPhaB的结晶条件。【结论】构建了具有高效表达可溶的集胞藻PCC 6803 SpPhaB和SpPhaE的原核表达系统,并筛选优化了SpPhaB的结晶条件,为研究SpPhaB蛋白的结构及功能奠定了基础。     

A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌标准株染色体DNA中扩增出α毒素基因,构建了含α毒素基因的重组菌株BL21(DE3)(pXETA02)。经酶切鉴定和序列测定证实,构建的表达质粒pXETA02含有α毒素基因序列。经SDS-PAGE、Western blot分析和ELISA检测,重组菌株表达的α毒素蛋白能够被α毒素单抗识别。表达优化结果表明,以IPTG为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.8mmol/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入IPTG,诱导时间5h,此时α毒素蛋白表达量为34.83%。以乳糖为诱导剂诱导α毒素表达的优化条件是:培养基pH7.5、培养温度37℃,乳糖浓度0.1g/L,菌体生长密度OD600达到0.8时加入乳糖,诱导时间5h,α毒素蛋白表达量为23.82%。动物实验结果表明,用重组菌株α毒素蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD的A型产气荚膜梭菌标准株C57-1毒素攻击。     

乳糖诱导剂促进P450 BM-3在大肠杆菌中可溶性表达的研究

P450 BM-3是一种具有工业化应用潜力的单加氧酶,可催化饱和脂肪酸羟基化。为提高其在大肠杆菌宿主中的可溶性表达水平,采用乳糖作为诱导剂对P450 BM-3的诱导表达条件进行研究。结果发现：在大肠杆菌的OD600达到0.7~1.5时,添加2.0 g/L的乳糖、30℃诱导10 h可获得最佳诱导效果。与IP TG的诱导效果对比发现：采用乳糖作诱导剂时,菌体生物量提高1.09倍,目标蛋白量提升2.13倍,蛋白包涵体的比例则降低至10%。研究结果表明：乳糖可显著提升P450 BM-3在大肠杆菌中的重组表达水平,并且能够促进p450 BM-3的可溶性表达。     

多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1在大肠杆菌表达的条件优化和大规模培养

通过以培养基配方、IPTG浓度、金属离子复合液浓度、镁离子浓度、表达时间、接种量、诱导时间点等发酵的重要条件对重组蛋白表达量影响的研究,确定多表位恶性疟疾疫苗M.RCAg-1蛋白最佳表达条件为以改良TB培养基培养、最优Mg2+,诱导剂IPTG和金属离子复合液浓度分别为10mmol/L,0.5mmol/L,6μl/ml,接种量为10%,表达时间为4.5h,将优化后的参数用于50L发酵罐进行连续3批中试规模的发酵,最终收获菌体湿重平均为31.8±1.78g/L,目的蛋白表达量可占菌体总蛋白的50%左右,试验确定了恶性疟疾多表位随机组合蛋白M.RCAg-1在大肠杆菌中的最优表达条件,该条件能够适合大规模培养需要。     

用E．coli表达Canstatin—N及其表达条件优化

以重组质粒DET—CN为模板设计引物CASN1N和CASN2,PCR方法扩增约267bp的人血管能抑素N端1～89氨基酸基因片段,用EcoRI和Sal I双酶切将其克隆进pET-22b（＋）载体获得重组表达质粒pET-22b（＋）一CN,转化E．coliBL21（DE3）,用IPTG诱导表达Canstatin-N,产物以包涵体形式存在。本文在摇瓶发酵条件下研究了诱导剂浓度、诱导培养时间对目标蛋白表达的影响,结果表明IPTG的最佳诱导浓度为0．1mmol／L;37℃下诱导培养2h时产物表达量最高。纯化获得的融合hiS6的重组Canstatin—N具有免疫和抑制鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成活性。     

抗菌肽Adenoregulin基因工程菌培养条件的优化及分批发酵研究

denoregulin（ADR）是来源于南美树蛙Phyllomedusa bicolor皮肤的含有33个氨基酸的抗菌肽,在非极性环境中形成α_螺旋型结构,具有抗菌活性强、抗菌谱广的特点。将ADR基因克隆于pET32a载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),对这一工程菌株的培养条件进行了优化。通过正交试验,考察诱导时机、诱导剂量和诱导时间三个因素的不同水平对蛋白表达的影响,结果发现诱导时机的影响尤为显著,考察了9种不同培养基对表达量的影响,发现培养基中加入葡萄糖对目标蛋白的稳定表达起了重要的作用,确定最佳培养条件为：培养基为2×YT+0.5%葡萄糖,诱导时机为OD600=0.9左右,诱导剂IPTG加入的终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为4h。采用前期恒pH、后期指数流加的策略进行工程菌BL21(DE3)/pET32a-adr的高密度培养,在整个流加过程中,通过控制葡萄糖的加入量,将菌株的比生长速率控制在015h^-1,乙酸浓度也被控制在较低的水平(<2g/L),但是质粒丢失严重,在发酵结束时,约有40%的大肠杆菌中不带质粒,这导致了目标蛋白的表达量下降严重,但是表达的目标蛋白90%以上为可溶性形式。表达的融合蛋白无抑菌活性,而裂解后得到的ADR单体具有明显的抑菌活性。     

Effective approach to greatly enhancing selective secretion and expression of three cytoplasmic enzymes in Escherichia coli through synergistic effect of EDTA and lysozyme

An effective approach to greatly enhancing the selective secretion and expression of recombinant cytoplasmic enzymes in Escherichia coli was successfully developed through the synergistic effect of ethylenediaminetetraacetate (EDTA) and lysozyme. The method was applied to two endoglucanases (EGs) and an amylase. The optimal culture conditions of temperature and concentration of isopropyl-β-D: -1-thiogalactopyranoside (IPTG) were 23-30?°C and 0.2?mM, respectively, under which the three enzymes could be expressed in active form. Among all the chemicals tested, EDTA was found to be most suitable for enhancing the secretion of EG-I-1A into the medium. Addition of lysozyme alone had little influence on the secretion and expression. In contrast, on the basis of the addition of 5?g?EDTA/L at the induction time of 12?h, the simultaneous addition of 0.15?g?lysozyme/L further significantly increased the secretion and expression of the three enzymes, demonstrating the synergistic effect of EDTA and lysozyme. The production of EG-I-1A in the culture medium by adding 5?g?EDTA/L and 0.15?g?lysozyme/L under the optimal culture conditions of 23?°C and 0.2?mM IPTG was over 260-fold higher than that without EDTA and lysozyme under the standard conditions of 37?°C and 1?mM IPTG. In summary, the advantage of this novel cultivation approach for secretion was that not only did it selectively enhance the secretion of the proteins of interest, but also greatly increased the expression of the three enzymes by over 80?%.     

High-level expression of soluble human β-defensin-2 in Escherichia coli

Human β-defensin-2 (hBD2) is a short cationic peptide with a broad antimicrobial spectrum. The coding sequence of hBD2 was cloned into pET-32a (+) to construct a fusion expression plasmid, pET32–hBD2, which was transformed into E. coli BL21 (DE3) for expression. The cultivation parameters of the expression vector harboring strain were optimized to produce the fusion protein in soluble form efficiently and to avoid the formation of insoluble inclusion bodies. The optimal conditions were determined as following: cultivation at 28 °C in MBL medium, induction at middle stage of exponential growth with 0.8 mM IPTG, and post-induction expression for 8 h. Under the above conditions, a high percentage of the target fusion protein (≥92.3%) was expressed in soluble form and the volumetric productivity of soluble fusion protein reached 1.3 g/l. The culture process was successfully scaled up in a 10 l bench-top fermentor.