同源重组法构建副干酪乳杆菌组氨酸蛋白激酶基因缺失突变株

构建副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)组氨酸蛋白激酶prcK基因缺失突变株,为prcK基因功能研究提供实验工具。采用同源重组技术构建质粒p KLKRT(含prcK::Tet~r基因),将其电转化进入L.paracaseiHD1.7中,使prcK::Tet~r基因同源重组到L.paracasei HD1.7的染色体上,通过四环素耐药、氨苄青霉素敏感等特性筛选出含有prcK::Tet~r基因的新L.paracasei HD1.7。结果表明,经聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)验证及酶切验证后确定质粒p KLKRT构建成功,并成功转化入L.paracasei HD1.7中,经PCR确认L.paracasei HD1.7 prcK基因缺失突变株构建成功。该突变株产生的细菌素效价比出发菌株低23.61%。采用同源重组方法成功构建L.paracasei HD1.7 prcK基因缺失突变株,为研究L.paracasei HD1.7群体效应相关基因的分子机理奠定基础。     

PCR技术检测金黄色葡萄球菌进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,其传统方法包括选择性培养、生化鉴定等步骤,耗时长、灵敏性差,很难满足食品安全快速检测要求。PCR技术是近年来广泛应用于食品中致病微生物快速检测的现代方法之一,其目的基因多种多样,主要包括耐药性相关基因、毒素基因、酶基因及多种特异性鉴别基因。本文综述了PCR技术应用于金黄色葡萄球菌检测的各种目的基因,并简要介绍了多重PCR及实时定量PCR等新技术的应用。     

金黄色葡萄球菌食品分离株肠毒素基因分布及分型研究

目的 对2006-2009年上海市Staphylococcus aureus(S.aureus)食品分离株进行肠毒素基因检测和基因分型研究,以了解肠毒素基因的分布规律及S.aureus的流行特点.方法 利用PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因,包括5种传统肠毒素基因(SEA-SEE)和4种新型肠毒素基因(SEG-SEJ);利用脉冲场凝胶电泳法对49株食品分离株进行基因分型.结果 本研究发现49株食品分离株中有19株含有肠毒素基因,16株含有传统肠毒素SEA和SEC,且SEC占93.8％,并检测到新型肠毒素SEG、SEI、SEJ和SEH.PFGE法基因分型显示5株菌不能被分型,其余44株可分为28个基因型,表现为基因型的多样性,且分离自不同时间的菌株具有相同的带型.结论 应加强食品中S.aureus的监测分析,为其引起的食物中毒的预防和控制提供科学依据.     

金黄色葡萄球菌溶血素基因分布的研究

目的:研究α-溶血素基因(hla)、β-溶血素基因(hlb)在金黄色葡萄球菌菌株中的分布情况,为金黄色葡萄球菌的防治及追溯提供依据.方法:以分离自人化脓组织、生牛乳以及生鲜肉等8类不同来源的376株金黄色葡萄球菌菌株为研究对象,利用PCR技术检测金黄色葡萄球菌溶血素基因的分布情况.结果:365株金黄色葡萄球菌被检出含有溶血素基因.总检出率为97.07%,其中α-溶血素基因总检出率为95.21%,β-溶血素基因的总检出率为73.93%.结论:各来源间金黄色葡萄球菌溶血素的检出率不同.且同一来源的菌株的hla和hlb检出率也不同,表明不同来源以及不同溶血素的基因型在金黄色葡萄球菌中的分布存在差异.     

基于OD-TTD法构建金黄色葡萄球菌生长模型的研究

本文应用OD-TTD法测定金黄色葡萄球菌的生长速率和迟滞期,并在此基础上构建其生长模型。以金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003为实验菌株,将梯度稀释的菌液于96孔细胞培养板中培养,实时测定各菌液的OD值。根据达到特定OD值所需的时间(times to detection,TTD)与起始菌数(N0)的线性关系和OD达到特定值时的菌数(Nd),计算生长速率(μ)和迟滞期(λ),然后选择合适的模型拟合生长数据。结果得出:TTD=-154.86N0+1202.3,R2=0.9997(OD=0.1),计算出μ为0.0064 log[cfu/(mL·min)],λ为7.8 min。根据Gompertz、Baranyi、Logistic和3-phase linear(3PLM)模型推算TTD值。结果表明3PLM模型推导结果与实测值基本吻合,因此最适合构建生长模型。此外,对比平板法和OD-TTD法,发现生长速率值两者差别不大,但迟滞期值则前者远比后者大。因此,在OD-TTD法基础上采用3PLM模型可以快速简便地构建金黄色葡萄球菌生长模型,但是迟滞期的测定结果仍存在不确定性。     

进出口食品中金黄色葡萄球菌spa基因的分型

目的对我国进出口食品中分离得到的金黄色葡萄球菌进行spa基因分型。方法对36株金黄色葡萄球菌的spa基因进行PCR扩增,并对产物进行测序分析,测序结果通过数据库进行spa基因分型。结果共分出16个基因型,分别为t189、t091、t164、t002、t899、t197、t1044、t034、t156、t7400、t2592、t4209、t127、t437和两株新发现的基因型。其中t189型共有13株,t091型共4株,t164和t002型分别为3株,其余型分别为1株。结论 食品中分离出的36株金黄色葡萄球菌spa分型以t189居多,t091型次之,其他14型相对较少。     

金黄色葡萄球菌肠毒素及移动基因元件研究进展

金黄色葡萄球菌肠毒素是一种热源性的超抗原。食用被肠毒素污染的食物能够引起食物中毒,导致恶心、呕吐、腹痛有时伴随腹泻。本文综述了肠毒素的分类命名、理化性质、以及编码不同肠毒素的基因在移动基因元件中的存在情况。这些移动基因元件在金黄色葡萄球菌毒力传播和进化过程中起着至关重要的作用,了解它们对于金黄色葡萄球菌流行病学溯源以及理解毒力机制具有一定的指导意义。     

应用基因芯片技术检测食品中金黄色葡萄球菌

采用基因芯片技术对食品中金黄色葡萄球菌进行检测,在检测靶基因扩增后用制备的基因芯片进行杂交反应。应用基因芯片对从食品中分离的金黄色葡萄球菌进行检测,得到金黄色葡萄球菌特异性的杂交图谱,从而达到对食品中金黄色葡萄球菌进行检测的目的。实验证明,制备的基因芯片能够准确、快速检测食品中金黄色葡萄球菌。     

PCR检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因

目的:检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素基因谱携带情况,探讨与食物中毒发病相关的金黄色葡萄球菌基因类型。方法:取食品中检出的金黄色葡萄球菌进行分离培养鉴定,通过PCR技术检测样本18种不同型的肠毒素基因的携带情况,并进行统计学分析。结果:食品中检出的金黄色葡萄球菌肠毒素基因有较高的阳性检出率,主要检出sea、seb、sei、seg、sel、sem、sen等基因,其中sea基因检出率最高,达到77.27%;sei、seg、sem、sen基因具有相关性,检出率为9.09%;seb、sel基因的检出率为4.55%。结论:在食品中主要检出金黄色葡萄球菌肠毒素sea、sei、seg、sem、sen、seb、sel等基因,其中,sei、seg、sem、sen基因的相关性还有待进一步深入研究。     

1874株金黄色葡萄球菌临床分布及耐药性结果分析

目的了解四川省某医院甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin sensitive Staphylococcus aureus,MSSA)与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的临床科室分布和耐药性情况。方法回顾性分析2014年12月-2017年12月四川省某医院门诊及住院患者,包括8名因金黄色葡萄球菌引起的食物中毒患者,送检各类标本分离出SA(Staphylococcus aureus)可疑菌落1874株,对其进行鉴定和药敏检测。结果 MSSA和MRSA标本主要来源于痰液(51.31%,74.33%)、伤口分泌物(21.52%,8.96%)和脓液(10.07%,7.92%)。725株MSSA临床分离率依次为门诊(27.17%)、呼吸科(15.45%)、ICU(10.21%)、神经科(8.55%)和口腔科(5.52%),1149株MRSA依次为ICU(33.16%)、神经科(11.66%)、呼吸科(9.75%)、儿科(7.57%)和妇产科(6.27%)。耐药性结果表明,MSSA对苯唑西林、万古霉素、利奈唑胺、替考拉林敏感,对青霉素G、红霉素和阿莫西林/克拉维酸耐药率依次为89.38%、56.69%、21.51%外,对其他抗菌药耐药率均18.00%; MRSA对万古霉素利、奈唑胺、替考拉林敏感,对苯唑西林、莫西沙星、克林霉素、红霉素、青霉素G、四环素、环丙沙星、阿莫西林/克拉维酸和氨苄西林/舒巴坦的耐药率均显著高于MSSA。结论四川省某医院2014年12月-2017年12月期间临床分离的SA以MRSA为主, MSSA和MRSA在标本来源、科室分布等方面存在较大差异, MRSA耐药情况更为严重,明显高于MSSA。若要评估金黄色葡萄球菌感染风险以及病人的治疗方案,应分别考虑MRSA和MSSA的感染来源和耐药性。     

解淀粉芽孢杆菌单链核苷酸介导的同源重组系统的构建

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一类重要的工业微生物,在农业、医药和食品等领域有广泛用途。为了开发高效的基因操作技术,在解淀粉芽孢杆菌中引入单链核苷酸(ss DNA)介导的同源重组方法。首先,通过敲除mut S基因干扰解淀粉芽孢杆菌的错配修复系统,然后导入单链结合蛋白(Beta)表达质粒,构建了宿主菌B.amyloliquefaciens XH7(mut S-,bet+)。其次,通过设计88 bp的ss DNA电转化导入以上构建的宿主菌中实现了以rpo B基因为靶点的有效同源重组,转化株产生利福平抗性。实验优化了ss DNA介导同源重组的参数:75μg的ss DNA,电转细胞复苏时间为6~12 h。本研究首次成功实现了ss DNA同源重组技术在解淀粉芽孢杆菌的应用,对解淀粉芽孢杆菌和其它难转化的芽孢杆菌属进行有效的遗传操作手段提供新的思路。     

一起由金黄色葡萄球菌引起食物中毒的实验室诊断

目的对一起食物中毒进行相关样品的实验室检测,针对分离病原菌进行分子分型溯源和耐药分析。方法对可疑食品(冰激凌、牛奶)样品、患者呕吐物和粪便标本使用国家标准或其他方法进行沙门菌、志贺菌、致泻大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽胞杆菌和诺如病毒检测。对检出的金黄色葡萄球菌进行肠毒素检测、脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型和抗生素敏感性检测。结果从生产冰激凌剩余牛奶及冰激凌样品中检出金黄色葡萄球菌12株,患者呕吐物和粪便标本中检出4株,菌株均产生A+C+E混合型肠毒素,PFGE显示患者呕吐物、粪便、中毒同批冰激凌样品、生产冰激凌用牛奶中检出的金黄色葡萄球菌菌株同源性为100.0%;药敏结果显示,这16株菌株均对青霉素和红霉素耐药。结论本起事件是由冰激凌加工点使用了被金黄色葡萄球菌污染且产生大量肠毒素的牛奶生产冰激凌所致。建议监管部门加强对农村食品小作坊、牛奶供应站等生产经营场所的监管,预防类似事件的发生。     

利用同源重组技术调节啤酒中SO2含量研究

二氧化硫在啤酒中具有抗氧化的重要功能,亚硫酸盐还原酶(MET10编码)在啤酒酵母硫代谢过程中起重要作用。利用同源重组技术,采用醋酸锂转化法,将一段目的基因转入到酵母体内,从而获得一株亚硫酸盐还原酶基因突变的工业酿酒酵母。突变株通过驯养,对比发酵栓试验,结果表明在发酵结束时,突变菌株的SO2产量是出发菌株的1.5倍。     

水饺馅料中金黄色葡萄球菌预测模型的建立

本文将金黄色葡萄球菌接种到水饺馅料中,分别在4、10、15、20和25℃下恒温贮藏。采用修正的Gompertz方程描述金黄色葡萄球菌在水饺馅料中不同温度下的生长状况。温度对其最大比生长速率(μmax)和延滞时间(Lag)的影响采用平方根模型(Belehradek)进行描述。结果表明修正的Gompertz方程能较好的描述金黄色葡萄球菌的生长动态,Belehradek方程对其动力学参数的描述呈良好的线性关系。同时采用13℃和18℃下金黄色葡萄球菌生长情况进行验证,证明数学模型的建立是有效的。      

应用基因芯片技术鉴定食源性金黄色葡萄球菌的研究

目的:建立快速鉴定食源性金黄色葡萄球菌的基因芯片技术。方法:采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌16SrRNA基因的DNA片段,序列进行BLAST比较并通过软件设计其特异性探针,采用基因芯片杂交技术鉴定食源性金黄色葡萄球菌样品。结果:对所有样品进行基因芯片杂交技术处理并扫描观察,金黄色葡萄球菌的杂交结果呈阳性,其检测结果与传统方法鉴定结果一致。结论:应用基因芯片鉴定技术可快速、准确地鉴定食源性金黄色葡萄球菌,值得推广应用。     

碳纳米生物传感检测金黄色葡萄球菌

目的建立一种基于碳纳米材料的适配体传感器快速检测金黄色葡萄球菌的方法。方法利用核酸适配体与其靶标之间的特异性结合能力以及碳纳米管的荧光猝灭特性,构建一种新型快速的金黄色葡萄球菌检测方法。结果该方法特异性良好,与非目标菌株无交叉反应。同时,该方法对金黄色葡萄球菌的检出限为10~5 CFU/mL,线性范围为10~5～10~9 CFU/mL,而且在此浓度范围之间呈现良好的线性关系,线性方程为Y=53.22X-39.99,线性相关系数r~2=0.992。结论该方法具有检测速度快、操作简便、检测成本低等特点,为金黄色葡萄球菌的快速检测提供了一种有效手段。     

Inactivation of Staphylococcus aureus by pulsed UV-light sterilization

Pulsed UV light is a novel technology to inactivate pathogenic and spoilage microorganisms in a short time. The efficacy of pulsed UV light (5.6 J/cm2 per pulse) for the inactivation of Staphylococcus aureus as suspended or agar seeded cells was investigated. A 12-, 24-, or 48-ml cell suspension in buffer was treated under pulsed UV light for up to 30 s, and 0.1 ml of sample was surface plated on Baird-Parker agar and incubated at 37 degrees C for 24 h to determine log reductions. Also, 0.1 ml of cell suspension in peptone water was surface plated on Baird-Parker agar plates, and the plates were treated under pulsed UV light for up to 30 s. The treated and untreated plates were incubated in the conditions described above. A 7- to 8-log CFU/ml reduction was observed for suspended and agar-seeded cells treated for 5 s or longer. In the case of suspended cells, the sample depth, time, treatment, and interaction were significant (P < 0.05). In the case of agar-seeded cells, the treatment time was significant (P < 0.05). Our results clearly indicate that pulsed UV technology has potential for the inactivation of pathogenic microorganisms.