抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应，3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗，为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。     

抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体的研制及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体并研究其初步应用。方法用广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经融合,筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用所得的单克隆抗体以Western blotting检测广州管圆线虫病患者血清,并建立双抗体夹心ELISA法检测感染大鼠血清。结果获得3株分泌高滴度抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(2A2、3F1、4H2),其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫、猪囊尾蚴、旋毛虫抗原均不发生交叉反应。3株单克隆抗体均可识别广州管圆线虫成虫可溶性抗原蛋白Mr 15 000,以及患者血清中两种循环抗原Mr24 000和Mr15 000。双抗体夹心ELISA检测阳性率为76.5%。结论制备的抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,且在循环抗原的检测方面有应用前景。     

华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ ZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱（Ni NTA树脂）纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a（GRA2a）类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。     

旋毛虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫之间共同抗原的研究

目的鉴定旋毛虫、卫氏并殖吸虫及华支睾吸虫之间的共同抗原,避免血清学诊断这3种寄生虫病时的交叉反应。方法应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印渍(Western blot)对旋毛虫肌幼虫、卫氏并殖吸虫成虫及华支睾吸虫成虫可溶性抗原中的蛋白组分进行研究。结果旋毛虫肌幼虫、卫氏并殖吸虫成虫及华文睾吸虫成虫3者相同蛋白带的分子量为108、65、53、43、42、31、25、16 kDa。免疫印渍结果表明,旋毛虫和卫氏并殖吸虫抗原中分子量为 65、58、53kDa的蛋白带均与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清、肺吸虫感染的大鼠和患者血清发生反应;旋毛虫和华支睾吸虫抗原中分子量为108kDa的蛋白带均与旋毛虫感染的大鼠、小鼠及患者血清、肝吸虫病患者血清发生反应;而3种可溶性抗原中的53kDa与本实验中所有寄生虫感染的动物和患者均有交叉反应。结论 65、58、53 kDa蛋白为旋毛虫和卫氏并殖吸虫的共同抗原,108kDa蛋白为旋毛虫和华支睾吸虫的共同抗原,而53 kDa蛋白为这3种寄生虫的共同抗原。     

抗华支睾吸虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

自从Kohler和Milstein1975年成功地发展了淋巴细胞杂交瘤技术后,国内外已有不少学者先后建立起分泌抗不同寄生虫抗原的单克隆抗体细胞株,在华支睾吸虫病方面尚未见有报道。我们于1986～1987年共建立4株抗华支睾吸虫单克隆抗体杂交瘤细胞系。 材料和方法 1 用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,首次由腹腔注入抗原液0.3ml(含蛋白450μg)加等量福氏完全性剂配成的乳剂,间隔2wk,     

分泌抗日本血吸虫卵单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

用SP2/0骨髓瘤细胞与日本血吸虫可溶性虫卵抗原免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合,经筛选和克隆化后获得4株分泌抗血吸虫卵单克隆抗体的杂交瘤细胞.此4株单克隆抗体均能用虫卵抗原的ELISA、IHA和COP检出。用成虫冰冻切片作IFA可出现3种不同的免疫荧光反应类型。经交叉和吸收试验(ELISA法)证明其中3株对血吸虫卵具有高度特异性,另1株针对血吸虫、肺吸虫、华支睾吸虫共同抗原决定簇。4株单克隆抗体免疫球蛋白亚类鉴定均属小鼠IgM。     

华支睾吸虫未脱脂和脱脂成虫抗原的免疫印迹分析

目的 寻找华支睾吸虫成虫抗原中具有特异性诊断价值的抗原组分。方法 应用SDS—PAGE和Westernblot分析华支睾吸虫成虫未脱脂、脱脂的可溶性抗原蛋白组分的血清学反应特征。结果 未脱脂成虫抗原有14条蛋白带可与华支睾吸虫病病人血清反应，其中分子质量单位为180、170、100、67、41、37、35、32、26ku是主带，180、170、37、35ku条带还可与日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病病人血清发生交叉反应。脱脂成虫抗原有10条蛋白带可与华支睾吸虫病病人血清反应，其中分子质量单位为180、100、67、37、35、24、20ku是主带，此外，180ku带可与日本血吸虫病和卫氏并殖吸虫病病人血清发生交叉反应，78ku带可以与血吸虫病病人血清发生交叉反应。结论 华支睾吸虫成虫抗原经脱脂处理后可减少与日本血吸虫病和卫氏并殖吸虫病病人血清交叉反应的蛋白组分数量。华支睾吸虫未脱脂和脱脂成虫抗原中主要的特异性抗原组分分别是100、67、41、32、26ku和100、67、37、35、24、20ku，这些组分抗原可用于华支睾吸虫病的免疫诊断。     

盘电泳分析蠕虫蛋白质的初步观察Ⅱ.五种吸虫成虫蛋白组分的分析

本文选用常见寄生人体的5种吸虫——华支睾吸虫、卫氏并殖吸虫、日本血吸虫、姜片虫及肝片吸虫用盘电泳作虫体蛋白质组分的比较分析。日本血吸虫和卫氏并殖吸虫成虫取自实验动物,华支睾吸虫、姜片虫及肝片吸虫取自自然感染的动物。取虫后,分别制成粗制抗原。盘电泳用Davis(1964)法,采用6％     

应用免疫金银染色法对日本血吸虫、华支睾吸虫和卫氏肺吸虫进行抗原定位的研究

应用免疫金银染色技术（IGSS）和间接荧光抗体试验（IFAT）对日本血吸虫、华支睾吸虫和卫氏肺吸虫进行抗原定位的研究。证明日本血吸虫成虫主要特异性抗原定位在虫体肠管壁,华支睾吸虫和卫氏肺吸虫主要抗原定位也在肠管壁。IGSS观察华支睾吸虫的贮精囊部位以及卫氏肺吸虫皮层也存在特异性抗原。     

抗弓形虫表膜抗原P30单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗弓形虫主要表膜抗原Ｐ３０单克隆抗体并进行鉴定，进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选出能够稳定分泌高滴度抗Ｐ３０单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位，并通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析鉴定。结果获得了两株抗Ｐ３０抗原的杂交瘤细胞株Ｅ３和Ｇ２，其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。２株单抗均属ＩｇＧ１亚类，且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明，制备的抗Ｐ３０抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

[目的 ]制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。[方法 ]用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。 [结果 ]筛选出 2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株 ,两株单抗均为IgG2b,2A5和 1H10培养上清的ELISA效价分别为 1∶5 12和 1∶2 5 6 ,腹水效价分别为 1∶2 5 6 0 0和 1∶12 80 0 ,两株单抗与间日疟原虫、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应 ,能识别恶性疟原虫 33kDa的虫源蛋白。 [结论 ]制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗     

华支睾吸虫排泄分泌抗原McAb的制备及双抗夹心ELISA的初步建立

目的 以华支睾吸虫排泄分泌抗原(ESA)免疫小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体,并建立一种可检测ESA的双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法。方法 用ESA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选杂交瘤细胞株,制备高效价单克隆抗体并鉴定;单抗经HRP标记和配对筛选,建立双抗夹心ELISA并分析其特异性及灵敏度。结果 成功制备出抗华支睾吸虫ESA McAb:B7、F1;抗体类型均为IgG₁,抗体滴度高,特异性好,以筛选到的两株单抗建立双抗夹心ELISA法,最佳线性范围为0.014~0.248 μg/mL(R²=0.996 9),最低检出限为0.014 μg/mL。结论 初步建立了检测华支睾吸虫ESA的免疫诊断方法。     

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的?摇在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38（SjP38）抗原分子，并以其纯化产物为抗原，制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。 方法 将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，在1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达，超声破菌后获得可溶性表达产物，通过镍柱一步法纯化，以纯化的重组SjP38为抗原，免疫BALB/ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹法（Western blotting）分析其特异性。 结果 筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株，均为IgG1； Western blotting 分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。 结论 制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。     

抗日本血吸虫蛋白质“靶抗原”单克隆抗体的研究

在成功地抽提出国际公认在诱导血吸虫保护性免疫力上起重要作用的24-26kD和90kD蛋白质“靶抗原”的基础上,进一步应用上述抗原免疫小鼠,经融合试验及克隆化获得分泌抗日本血吸虫蛋白质“靶抗原”单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞29株,其中IgG类16株(IgG_1 7株,IgG_(2a) 5株,IgG_(2b) 1株,IgG_3 3株),IgM 13株。以后,又从McAb的定位研究、McAb体外ADCC对血吸虫童虫的杀伤效应、McAb在不同血吸虫抗原中的识别位点(抗原结合位)等方面,对报获的McAb进行了研究。     

抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法以重组表达纯化的日本血吸虫信号蛋白14-3-3为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对获得的单克隆抗体进行类和亚类、效价、浓度、纯度、亲和常数、特异性和检测灵敏度的测定与鉴定。结果共获得6株针对日本血吸虫信号蛋白14-3-3的单克隆抗体,分别为5G9、3F1、3F7、5C6、5D1和1G6,抗体类型分别为IgG1、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG1和IgG1。对其中的单克隆抗体5G9分析显示,制备的腹水抗体效价为1∶1.28×105,亲和层析纯化后的浓度为5.3 mg/ml,纯度95%,亲和常数为5.1×107mol/L。免疫印迹试验结果表明,该单克隆抗体可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原特异性反应,而与大肠埃希菌、健康人血清和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。HRP标记的单克隆抗体5G9检测14-3-3蛋白的灵敏度为31.25 ng/ml。结论本研究获得了6株能稳定分泌抗日本血吸虫14-3-3蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立新的日本血吸虫活动性感染检测方法奠定了良好的基础。     

分泌抗细粒棘球绦虫单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为了对包虫病的免疫诊断和免疫预防提供有价值的单克隆抗体,通过对骨髓瘤细胞SP2/0与用细粒棘球蚴囊液免疫的BALB/c小鼠脾细胞融合试验及多次筛选、克隆,建立了分泌单克降抗体的细胞株NIA_2。用ELISA及免疫电镜等方法检测证实该细胞株有特异性。其培养上清分泌抗体滴度为1:2560,注入同系小鼠腹腔,诱生肿瘤和滴度为1:163840的腹水。免疫球蛋白鉴定表明是IgG_1,未见对囊虫的阳性反应。该杂交瘤细胞株经组织培养传代10个月,分泌抗细粒棘球绦虫抗体性能稳定。     

抗旋毛虫副肌球蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的利用杂交瘤技术制备分泌抗重组旋毛虫副肌球蛋白N端抗原（rTsP3）的单克隆抗体（McAb）并进行鉴定。方法以rTsP3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,筛选分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,制备腹水并进行纯化,采用间接ELISA法测定培养细胞上清液及腹水中的McAb滴度、相对亲和力及抗体亚类,Western blot法鉴定抗体对抗原识别的特异性。结果获得了2株稳定分泌抗旋毛虫rTsP3的McAb杂交瘤细胞株,分泌的McAb分别为IgG2b亚类κ型和IgG1亚类κ型,亲和力常数分别为8.98×108mol/L和9.7×10^8mol/L,Western blot显示2株单抗均能识别旋毛虫成虫匀浆蛋白、rTsP3及重组副肌球蛋白（rTsPmy）。结论成功制备了抗旋毛虫rTsP3单克隆抗体,该单抗能识别旋毛虫副肌球蛋白抗原。     

堆型艾美球虫子孢子单克隆抗体的制备及鉴定

目的 建立堆型艾美球虫（Eimeria acervulina）子孢子表面抗原的杂交瘤细胞株。 方法 使用纯化的堆型艾美球虫子孢子直接免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术建立细胞株，制备单克隆抗体。用ELISA确定单克隆抗体的交叉反应性、相对亲和力、免疫球蛋白的类型和亚类，并对单克隆抗体进行鉴定。 结果 获得4株可稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中Easp-3G3、Easp-5G10为IgG1 类，Easp-3H6为IgG2b 类，Easp-5H4为IgG2a 类。4株单克隆抗体均能与堆型艾美球虫子孢子的抗原蛋白反应，但仅Easp-5H4能与柔嫩艾美球虫子孢子抗原蛋白反应。Easp-3G3和Easp-5G10与另外2种单克隆抗体的识别位点不同，而Easp-3G3与Easp-5G10、Easp-3H6与Easp-5H4的识别位点相近。 结论 制备了4株堆型艾美球虫子孢子单克隆抗体。