黄芪甲苷对人膝骨关节炎退变软骨细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达的影响

目的:观察黄芪甲苷对原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达影响,初步探讨黄芪甲苷防治膝骨关节软骨退变的作用机制。方法:原代培养骨关节炎患者的膝关节软骨细胞,用第三代细胞进行试验。将5个不同浓度的黄芪甲苷,分别作用于关节软骨细胞4、8、24、48、72h后,采用Real Time-PCR法检测细胞中Ⅱ型胶原(Col Ⅱ)、蛋白多糖基因(ACAN)的mRNA表达。结果:黄芪甲苷浓度为25~75mmol/L,作用于退变关节软骨细胞24~72h时,软骨细胞Col Ⅱ和ACAN mRNA的表达量均较对照组显著增加。结论:黄芪甲苷可延缓膝骨关节炎关节软骨细胞的退变,促进软骨细胞ColⅡ及ACAN mRNA的表达可能是其作用机制之一。     

不同血清浓度对大鼠软骨细胞增殖、形态和基因表达的影响

目的 观察不同血清浓度对大鼠软骨细胞体外培养的形态、增殖和基因表达的调控作用。方法 取出生24h SD大鼠关节处软骨,0.1%浓度的Ⅱ型胶原酶多次消化后获得软骨细胞。软骨细胞培养于含5%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）,10% FBS和20% FBS的DMEM低糖培养基中,分别为5FBS组,10FBS组和20FBS组。24h后镜下观察细胞形态变化,CCK8方法检测24、48和72h软骨细胞增殖。Western blot法检测软骨指标Ⅱ型胶原A1（COL2A1）和MMP13（matrix metalloproteinases13）表达,定量PCR检测软骨特异性基因Sox9、A-can、ADAMTS5、MMP9和MMP3的表达及代谢相关基因Nme2和PnP表达。结果 5FBS组的软骨细胞呈由鹅卵石样排列,10FBS组和20FBS组细胞呈现长梭形改变,且血清浓度越大,形态改变越明显。和5FBS组比较,10FBS组和20FBS组细胞增殖明显,呈血清浓度依赖性增加。10FBS组和20FBS组的MMP13表达显著上调,Ⅱ型胶原表达显著下调。PCR结果表明,和5FSB组比较,10FBS组和20FBS组的A-can和Sox9表达下降,MMP9、MMP3和ADAMTS5表达上调,且基因表达变化和血清浓度改变呈正相关。同时随着血清浓度增加,Nme2和PnP表达显著上调。结论 血清浓度的增高促进软骨细胞代谢,引起软骨细胞退变。     

大鼠血浆血清对软骨细胞纤维化转变的影响

目的 观察大鼠的血清和血浆对大鼠软骨细胞的增殖,形态改变,基质蛋白及基质调控基因的表达变化。方法 取出生24h SD大鼠关节处软骨,Ⅱ型胶原酶多次消化后获得软骨细胞,取P1代细胞进行实验。软骨细胞分别培养于含10%大鼠血浆（rat plasma,RP）和10%大鼠血清（rat serum,RS）的DMEM低糖培养基中,分别为血浆组和血清组。分别培养24h,镜下观察细胞形态变化,CCK8方法检测24h、48h和72h软骨细胞增殖（A₄₅₀）。细胞免疫荧光、Western blot和定量PCR检测软骨指标Sox9、Ⅱ型胶原、MMP13、Col2a1、A-can、ADAMTS5、MMP9、MMP3的表达。结果 培养于大鼠血清和血浆的培养基中,24h后血清组的软骨细胞由鹅卵石样排列的多角形变成长梭形。血清组24h（0.67±0.01）,48h（1.29±0.05）和72h（1.92±0.03）A₄₅₀值,明显高于血浆组24h（0.43±0.01）,48h（0.72±0.01）和72h（1.27±0.04）A₄₅₀值,差异均有统计学意义（P<0.01）。血清组软骨细胞MMP13和Col1a1表达显著上调,Ⅱ型胶原和Sox9的表达显著下调。PCR结果表明,血清组A-can（0.24±0.01）和Sox9（0.56±0.04）基因表达相对于大鼠血浆组Sox9（1.00±0.05）和A-can（1.00±0.08）表达明显降低,而血清组ADAMTS5（34.51±2.25）和MMP3（40.33±2.43）表达相对于大鼠血浆组ADAMTS5（1.02±0.21）和MMP3（1.00±0.11）表达明显增强,两组间基因表达差异均有统计学意义（P<0.01）。结论 血清促进软骨细胞转变成纤维样软骨细胞。     

白脉软膏含药血浆对大鼠退变滑膜细胞和软骨细胞共培养体系的作用及机制研究

【目的】观察白脉软膏含药血浆对大鼠退变滑膜细胞和软骨细胞共培养体系的干预作用,并从"滑膜—软骨"轴角度探讨骨关节炎(OA)的发病机制。【方法】取新生SD大鼠膝关节滑膜,经消化酶消化后获得原代滑膜细胞,取第1代(P1)细胞进行实验。实验设空白组、模型组、西药组、白脉组。模型组加入脂多糖(LPS)进行诱导,西药组与白脉组在模型组LPS诱导的基础上分别加入扶他林软膏、白脉软膏含药血浆干预。LPS诱导24 h后观察滑膜细胞形态变化,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测滑膜细胞上清中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。此后,各组皆与正常软骨细胞进行共培养。共培养24 h后观察软骨细胞形态,实时定量PCR(qPCR)检测软骨细胞基质金属蛋白酶3(MMP3)、带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶4(ADAMTS4)、TNF-α、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)mRNA表达情况,Westernblot法检测Ⅱ型胶原蛋白(COL2A1)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、磷酸化核因子κBp65(p-NF-κBp65)表达情况。【结果】LPS诱导后滑膜细胞形态由原来的多角形变成长梭形。ELISA结果显示,模型组滑膜细胞上清中IL-1β、TNF-α含量较空白组升高(P 0.05),而白脉组IL-1β、TNF-α含量较模型组下降。软骨细胞与退变滑膜细胞培养24 h后由原来的多角形变为长梭形。qPCR结果显示:与空白组比较,模型组软骨细胞MMP3、ADAMTS4、TNF-αmRNA表达升高(P 0.05),Sox9mRNA表达降低(P 0.05);与模型组比较,白脉组软骨细胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表达明显降低(P 0.05),Sox9 mRNA表达水平升高(P 0.05)。Western blot结果显示:与空白组比较,模型组软骨细胞MMP13、p-NF-κBp65表达升高(P 0.05),COL2A1表达明显降低(P 0.05);与模型组比较,白脉组软骨细胞MMP13、p-NF-κBp65表达降低(P 0.05),COL2A1表达升高(P 0.05)。【结论】退变滑膜细胞可导致软骨细胞退变并促进骨关节炎发展,白脉软膏对此病理过程有明显的抑制作用。     

Sox9基因在终板软骨细胞退变模型中的表达变化及意义

目的 建立大鼠腰椎终板软骨细胞体外自然退变模型,并探讨Sox9基因在终板软骨细胞自然退变中的变化及作用.方法 取大鼠腰椎终板软骨细胞,酶消化及自然传代法分离培养大鼠终板软骨细胞,建立体外终板软骨细胞培养模型.采取绘制细胞生长曲线、HE、甲苯胺蓝染色及免疫组织化学染色等方法,对该模型进行鉴定.RT-PCR检测各代细胞中Sox9、Ⅱ型胶原mRNA的表达变化.结果 大鼠终板软骨细胞表达特征性Ⅱ型胶原,其生长情况及细胞表型类似于关节软骨,细胞传至4、5代后表现出细胞形态呈梭形、细胞增殖速度减慢等退变的特征.与原代相比,Sex9基因mRNA在4、5代终板软骨细胞的表达明显下降(P<0.05),受其调控的Ⅱ型胶原mRNA的表达也相应降低,两者表达变化呈正相关(r=0.912,P<0.05).结论 终板软骨细胞自然退变模型成功建立,为椎间盘退变机制研究提供了较好的细胞学基础.Sox9基因与终板软骨细胞自然退变存在明显关联,Sox9基因的表达下降可抑制软骨终板细胞的增殖及基质合成,从而促进或诱发椎间盘的退变.     

模拟步行压力下牛蒡子苷元对软骨细胞的保护机制研究

目的:探讨模拟步行压力对软骨细胞的作用及压力负荷下牛蒡子苷元(ARG)对软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)、SRY相关高迁移率族盒蛋白转录因子9(SOX9)、瞬时受体电位香草素亚家族4(TRPV4)、基质金属蛋白酶(MMPs)的影响。方法:分离并培养小鼠原代软骨细胞,制备3D培养软骨细胞水凝胶。将制备的水凝胶分为空白组、模型组、ARG组和抑制剂组。空白组不进行压力干预,使用常规培养基换液。其他3组均给予模拟步行压力(正弦波,1 Hz,20 kPa)干预2 h。压力干预同时,ARG组和抑制剂组分别给予10μmol/L ARG和10 nmol/L TRPV4抑制剂GSK2193874。收集干预后各组水凝胶提取的软骨细胞,免疫荧光染色检测ColⅡ蛋白表达,PCR检测ColⅡ、SOX9、TRPV4、MMP9、MMP13的mRNA表达水平,Western blot检测ColⅡ、SOX9、TRPV4的蛋白表达水平。结果:(1)免疫荧光染色观察显示,与空白组相比,模型组ColⅡ蛋白表达较少;与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ蛋白表达明显增多。(2)与空白组相比,模型组ColⅡ、SOX9、TRPV4的mRNA表达量显著降低(P0.01),MMP9和MMP13的mRNA表达量均显著增高(P0.01);与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ、SOX9、TRPV4的mRNA表达量显著增高(P0.01),MMP9和MMP13的mRNA表达量均显著降低(P0.01)。(3)与空白组相比,模型组ColⅡ和SOX9蛋白表达水平显著降低(P0.01),TRPV4蛋白表达无明显变化;与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ和SOX9蛋白表达水平显著增高(P0.01),TRPV4蛋白表达水平显著降低(P0.01)。结论:模拟步行压力可导致软骨细胞发生趋向于软骨退化的代谢反应。模拟步行压力下,ARG和TRPV4抑制剂对软骨细胞具有保护作用,其机制可能与上调ColⅡ、SOX9表达,抑制TRPV4、MMP9和MMP13的表达有关。     

大鼠Atoh1基因真核表达载体的构建及转染293T细胞的实验研究

摘要：目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS,构建大鼠核转录因子Atoh1的真核表达载体并在真核细胞
中表达。方法从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atoh1基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T
载体中。测序鉴定后将Atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点（internal ribosome entrysite, IRES）的真核细
胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜、
PT-PCR和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠Atoh1 CDS区长1056 bp,编码351个氨基酸,
与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基
应为单核苷酸多态性（SNP）,突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达
载体pIRES2-EGFP中,转染293T细胞48 h后,荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达,PT-PCR和Western blot证实Atoh1
的mRNA和蛋白能在293T细胞中正确表达。结论成功构建了真核表达载体pAtoh1 -IRES2-EGFP,并在293T细胞中成
功表达,为进一步研究Atoh1的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。     

周期性机械应力对大鼠软骨细胞增殖的影响

目的:探讨周期性机械应力对大鼠软骨细胞增殖的影响。方法:通过Ⅱ型胶原酶消化分离大鼠原代软骨细胞,并将软骨细胞分为对照组和实验组。MTT法检测细胞活力,实时荧光定量PCR(Realtime PCR)法检测蛋白聚糖(Aggrecan)及Ⅱ型胶原酶(ColⅡ)mRNA的表达,western blot检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、增殖细胞抗原(PCNA)及细胞周期蛋白D1(CyclinD1)蛋白表达水平与细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。结果:与对照组比较,实验组1 h、2 h的软骨细胞活力均明显提高(P<0.05),Aggrecan及ColⅡmRNA表达量均明显提高(P<0.05),Bcl-2、PCNA及CyclinD1蛋白表达量均明显上调(P<0.05),ERK1/2磷酸化水平明显上调(P<0.05)。结论:周期性机械应力能显著促进软骨细胞增殖。     

低强度脉冲聚焦超声通过上调PGAM5蛋白表达促进软骨细胞线粒体自噬

目的 探讨低强度脉冲聚焦超声(focused low-intensity pulsed ultrasound,FLIPUS)对软骨细胞线粒体自噬活化的影响.方法 提取C57BL/6J乳鼠膝关节原代软骨细胞进行体外实验,IL-1β处理细胞模拟骨关节炎样软骨细胞损伤并进行验证.细胞分为对照组、IL-1β组和IL-1β+FLIPUS组.RT-PCR检测各组Col2α1 和MMP13 mRNA 表达;Western blot 检测各组Col2α1、MMP13、LC3B-Ⅱ、TOM20、TIM23、PGAM5、FUNDC1及p-FUNDC1(p-ser13)蛋白表达.结果 成功提取原代软骨细胞并模拟骨关节炎样软骨细胞损伤.与对照组比较,IL-1β组Col2α1 mRNA和蛋白表达明显降低(P＜0.01),MMP13 mRNA和蛋白表达明显增加(P＜0.01);与IL-1β组相比,IL-1β+FLIPUS组Col2α1表达明显上升(P＜0.05),MMP13表达明显下降(P＜0.01).与对照组相比,IL-1β组LC3B-Ⅱ蛋白表达显著降低(P＜0.05);与IL-1β组相比,IL-1β+FLIPUS组LC3B-Ⅱ、PGAM5蛋白表达显著上升(P＜0.01),TOM20、TIM23、p-ser13蛋白表达则明显下降(P＜0.05).结论 FLIPUS可能通过上调软骨细胞PGAM5蛋白表达,使FUNDC1第13位丝氨酸去磷酸化,活化线粒体自噬.     

膝痹通络方通过调节MAPK-MEK信号通路延缓对白细胞介素1β诱导的关节软骨细胞退变

【目的】观察膝痹通络方对白细胞介素1β(IL-1β)诱导的软骨细胞退变的影响,并从丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-MAPK激酶(MEK)信号通路探讨其机制。【方法】提取新生SD大鼠四肢关节软骨细胞,选择P1代细胞进行实验,共设5组:正常对照组,IL-1β组,高、中、低浓度中药组。正常对照组软骨细胞加入正常大鼠血清培养;IL-1β组软骨细胞加入正常大鼠血清、20 ng/mL IL-1β培养;高、中、低浓度中药组软骨细胞分别加入对应浓度的膝痹通络方含药血清进行培养,并加入20 ng/mL IL-1β。24 h后倒置显微镜下观察软骨细胞大小、密度、形态,采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测软骨细胞基质金属蛋白酶3(MMP3)、聚蛋白多糖酶4/5(ADAMTS4/5)、蛋白多糖(A-CAN)、性别决定区Y框蛋白(SOX9)等软骨退变相关基因的表达,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测软骨细胞SOX9、基质金属蛋白酶13(MMP13)、磷酸化原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶(P-Raf1)、Raf-1、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶(P-MEK1)、MEK1的蛋白表达。【结果】倒置显微镜下可见,经IL-1β炎性因子诱导后的软骨细胞出现退变形态;q PCR结果显示,与IL-1β组比较,各浓度中药组MMP3、ADAMTS4/5的mRNA表达水平降低(P0.05),A-CAN的mRNA表达水平升高(P0.05),高浓度中药组SOX9的mRNA表达水平升高(P0.05);Western Blot结果显示,与IL-1β组比较,各浓度中药组软骨细胞MMP13蛋白表达,Raf1、MEK1磷酸化水平降低(P0.05),SOX9蛋白表达水平升高(P0.05)。【结论】膝痹通络方可延缓IL-1β诱导的软骨细胞退变,其机制可能与调节MAPK-MEK信号通路相关蛋白及基因表达有关。     

HERG基因G572R突变体表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的构建HERG基因G572R突变体表达载体并建立其稳定转染HEK293 的细胞系。方法应用重叠延伸PCR构建
HERG-G572R突变体表达载体,经G418筛选稳定转染细胞系,通过Real-Time PCR,Western blot及测序鉴定稳定转染细胞系。
结果经序列比对,证明HEK-HERG-G572R突变体表达载体构建成功,Real-Time PCR,Western blot 及测序证明稳定转染细胞
系构建成功。结论该方法可成功构建的HKE-HERG-G572R细胞株,为药物个体化治疗提供工具。
     

过表达Wnt3基因抑制肝前体细胞凋亡

目的利用腺病毒载体转染体外培养的肝前体细胞,研究过表达Wnt3对肝前体细胞凋亡的影响。方法用携带Wnt3的腺
病毒载体（Ad-Wnt3）转染肝前体细胞,同时设立空载体腺病毒转染组（Ad-GFP）为对照。转染72 h 后,用荧光显微镜观察
Hoechst33342 染色后细胞凋亡情况;流式细胞术检测Annexin-PE/7-ADD法标记的细胞凋亡率;RT-PCR和Western blot分别检
测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平。结果qRT-PCR和Western blot结果显示,Wnt3在肝前体
细胞中特异性表达,表明腺病毒系统Ad-Wnt3能高效转染肝前体细胞。与对照组相比较,肝前体细胞转染Wnt3后,肝前体细胞的
凋亡水平明显下降,凋亡相关蛋白Bcl-2和Bcl-xl的mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。Bax的mRNA及蛋白表达水平
则明显下降（P<0.05）。结论在肝前体细胞中,Wnt3基因过表达能抑制肝前体细胞凋亡,其机制可能是通过Bcl-2家族起作用。     

Wnt 3α蛋白诱导脂肪间充质干细胞向成软骨细胞分化的实验研究

目的研究Wnt 3α蛋白对脂肪间充质干细胞向成软骨方向分化能力的影响。方法从4dSD仔鼠腹股沟脂肪垫分离出脂肪组织,通过Ⅰ型胶原酶消化分离并经免疫荧光鉴定脂肪间充质干细胞。取第三代脂肪间充质干细胞,采用RT—PCR和Western blot方法观察外源Wnt 3α蛋白对脂肪间充质干细胞增殖和向成软骨细胞分化能力的影响。结果在体外分离与培养的脂肪间充质干细胞的培养液中添加Wnt 3α蛋白,明显上调Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的mRNA和蛋白表达水平。结论Wnt 3α蛋白具有促进大鼠脂肪间充质干细胞增殖和向成软骨细胞分化作用。     

骨形成蛋白-7对多孔钽／软骨细胞复合物分泌功能以及 Col-Ⅱ、AGG 和 Sox9基因表达的影响

目的：研究人重组骨形成蛋白-7（bone morphogenetic protein-7,BMP-7）对国产多孔钽／软骨细胞复合物中软骨细胞分泌功能以及Ⅱ型胶原（ typeⅡcollagen,Col-Ⅱ）、蛋白聚糖（ aggrecan,AGG）和SRY相关高迁移率组基因9（SRY-related high mobility group-box gene 9,Sox9）mRNA表达的影响。方法：3周龄新西兰幼兔,取双膝关节软骨细胞分离培养及鉴定,将生长状态良好的第2代细胞以1×106／mL浓度接种于多孔钽并给予不同浓度BMP-7,分为对照组（多孔钽／软骨细胞组）、50μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组、100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组及200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组。 CCK-8法检测不同浓度BMP-7对多孔钽／软骨细胞生长及增殖的影响,扫描电镜观察各组软骨细胞在多孔钽表面及内部生长情况,二甲基亚甲蓝（ dimethyl methylene blue,DMMB）比色定量法对BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合物糖胺多糖（ glycosaminoglycan,GAG）进行定量检测,实时荧光定量PCR检测Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA的表达。结果：原代软骨细胞培养24 h后呈梭形生长,4 d后细胞呈多角形,胞浆丰富。阿辛蓝（ alcian blue）、番红O（ safranin O）、Col-Ⅱ免疫细胞化学染色均呈阳性反应。 CCK-8法细胞增殖检测结果显示,100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组细胞增殖水平高于其他各组（ P＜0．05）。扫描电镜示各组软骨细胞在多孔钽表面生长状态良好,细胞有多个突起、伸展、叠层生长并覆盖于多孔钽表面。 GAG定量检测显示,100μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组GAG含量比其他各组均明显升高（ P＜0．05）;实时荧光定量PCR检测显示,各实验组Col-Ⅱ、AGG和Sox9 mRNA表达量均高于对照组,以200μg／L BMP-7／多孔钽／软骨细胞组升高最为明显（ P＜0．05）。结论：BMP-7／多孔钽／软骨细胞复合体能促进体外软骨细胞增殖及细胞外基质的分泌,促进软骨基因的表达。     

细胞角蛋白8 GFP/Puro 双标干涉慢病毒系统的构建及对细胞凋亡的影响

目的构建细胞角蛋白8（CK8）的双标慢病毒干涉载体,获得高滴度慢病毒颗粒,感染HCT116细胞建立稳定株,检测CK8
敲低对细胞凋亡的影响。方法将CK8 的siRNA序列插入慢病毒表达载体GV248,并与包装质粒PMD、SPA共转染293T细
胞,36、48 h分两次收集慢病毒上清,应用流式细胞术检测病毒滴度。获得的病毒感染HCT116细胞,用嘌呤霉素筛选阳性细胞,
Western blotting检测干涉效果。采用Annexin V/PI染色检测干涉CK8对化疗药物顺铂诱导的细胞凋亡的影响。结果与结论
成功构建CK8干涉慢病毒载体并得到干涉稳定株,在HCT116细胞中干涉CK8 使细胞对顺铂引起的凋亡更加敏感。
     

替莫唑胺诱导大鼠脑胶质瘤C6细胞caspase非依赖的程序性死亡

目的观察替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6细胞程序性死亡的诱导效应,并探讨可能的分子机制。方法观察不同浓度替莫
唑胺在不同时间点处理大鼠脑胶质瘤大鼠脑胶质瘤C6细胞系,MTT法观察抑制率并筛选出最优的作用时间和作用浓度。应
用400 μg/ml替莫唑胺处理细胞24 h,通过HE染色、Hochest、Western blot、Tunnel、免疫组化观察替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6
细胞系的程序性死亡的诱导效应。结果MTT法、HE染色、Hochest和Tunnel结果显示替莫唑胺对大鼠脑胶质瘤C6细胞具有
凋亡诱导效应;免疫组化和Western blot结果显示促凋亡蛋白Bax表达水平上调,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达的下调。未发现主要
的caspase蛋白的表达变化。结论替莫唑胺对脑胶质瘤C6细胞具有凋亡诱导效应,而这种效应可能是通过caspase非依赖途径
完成的。
     

BMPER通过Wnt/β-catenin信号通路减轻高糖高脂对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制

目的:探究骨形态发生蛋白内皮细胞前体来源调节因子（BMPER）在成骨分化中的生物学作用。方法:将MC3T3-E1细胞分为对照（control）组、成骨诱导（OM）组和成骨诱导+高糖高脂（OM+HG/PA）组。采用Western印迹法检测各组细胞Runt相关转录因子2（Runx2）、Ⅰ型胶原α1（Col1α1）、BMPER的表达。将空载体对照质粒及BMPER过表达质粒转染到MC3T3-E1细胞中,将细胞分为p-NC和p-BMPER组。使用Western印迹法检测各组细胞BMPER、Runx2、Col1α1、Wnt1、Wnt3a、active β-catenin表达。碱性磷酸酶（ALP）染色检测BMPER对成骨分化的影响。应用非特异性siRNA及合成的靶向沉默BMPER小干扰RNA（siRNA）转染MC3T3-E1细胞,将细胞分为si-NC组及si-BMPER组,使用Western印迹法检测各组细胞Wnt1、Wnt3a、active β-catenin表达。结果:与OM组相比,OM+HG/PA组中Runx2、Col1α1、BMPER蛋白表达显著减少（t=7.572、 8.568、10.742,均P< 0.05）。与p-NC组相比,p-BMPER组Runx2、Col1α1、Wnt1、Wnt3a、active β-catenin蛋白表达水平显著升高（t=9.816、8.331、8.413、14.343、9.156,均P<0.05）,ALP染色加深。与si-NC组相比,si-BMPER组Wnt1、Wnt3a、active β-catenin的表达显著下调（t=10.807、8.678、10.167,均P<0.05）。结论:BMPER通过Wnt/β-catenin信号通路减轻高糖高脂对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制。     

蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12负性调控心脏HERG钾通道电流

目的研究蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12（PTPN12）对心脏HERG钾通道电流的调控作用。方法（1）质粒构建和基因转
染：PCR 技术构建各种质粒,应用脂质体将各种质粒转染HEK293 细胞,经G418 筛选获得稳定表达的细胞株;（2）应用抗
PTPN12 抗体进行Western blotting 分析检测PTPN12 的表达;（3）细胞电生理检测：应用膜片钳技术检测单独表达HERG组
（HEK293/HERG 细胞）、PTPN12 过度表达组（将pCDNA3.1-PTPN12-RFP 转染HEK293/HERG 细胞）、PAO处理组（PTPN12/
HERG组基础上加入抑制剂PAO）、herg 突变组（将pCDNA3.1-PTPN12-RFP 转染HEK293/HERGY327A-Y700A-Y845A细胞
株）的HERG钾通道电流。结果（1）成功构建herg突变质粒和pCDNA3.1-PTPN12-RFP质粒,并获得稳定表达的细胞株;（2）共
转染pCDNA3.1-PTPN12-RFP 质粒的HEK293/HERG细胞在荧光显微镜下可观察到PTPN12-RFP 在细胞中的表达,Western
blotting可检测到PTPN12的表达;（3）PTPN12过度表达组脉冲电流密度明显低于对照组（P<0.01）,PAO处理组和herg突变组
电流密度明显高于PTPN12/HERG组（P<0.01）。结论PTPN12对心脏HERG钾通道电流具有明显负性调控作用,其可能机制
是PTPN12减弱了HERG钾通道酪氨酸磷酸化程度。这一发现有助于更深刻理解HERG钾通道调控机制和长QT综合征发病
机制。
     

Effects of HDAC4 on IL-1β-induced matrix metalloproteinase expression regulated partially through the WNT3A/β-catenin pathway

Background:Histone deacetylase 4 (HDAC4) regulates chondrocyte hypertrophy and bone formation. The aim of the present study was to explore the effects of HDAC4 on Interleukin 1 beta (IL-1β)-induced chondrocyte extracellular matrix degradation and whether it is regulated through the WNT family member 3A (WNT3A)/β-catenin signaling pathway.Methods:Primary chondrocytes (CC) and human chondrosarcoma cells (SW1353 cells) were treated with IL-1β and the level of HDAC4 was assayed using Western blotting. Then, HDAC4 expression in the SW1353 cells was silenced using small interfering RNA to detect the effect of HDAC4 knockdown on the levels of matrix metalloproteinase 3 (MMP3) and MMP13 induced by IL-1β. After transfection with HDAC4 plasmids, the overexpression efficiency was examined using Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) and the levels of MMP3 and MMP13 were assayed using Western blotting. After incubation with IL-1β, the translocation of β-catenin into the nucleus was observed using immunofluorescence staining in SW1353 cells to investigate the activation of the WNT3A/β-catenin signaling pathway. Finally, treatment with WNT3A and transfection with glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β) plasmids were assessed for their effects on HDAC4 levels using Western blotting.Results:IL-1β downregulated HDAC4 levels in chondrocytes and SW1353 cells. Furthermore, HDAC4 knockdown increased the levels of MMP3 and MMP13, which contributed to the degradation of the extracellular matrix. Overexpression of HDAC4 inhibited IL-1β-induced increases in MMP3 and MMP13. IL-1β upregulated the levels of WNT3A, and WNT3A reduced HDAC4 levels in SW1353 cells. GSK-3β rescued IL-1β-induced downregulation of HDAC4 in SW1353 cells.Conclusion:HDAC4 exerted an inhibitory effect on IL-1β-induced extracellular matrix degradation and was regulated partially by the WNT3A/β-catenin signaling pathway.