新生小鼠脊髓神经干细胞体外增殖及其多潜能分化特性

目的：观察新生小鼠脊髓神经干细胞的体外增殖及其分化特性。 方法：实验于2005—11／2006-02在安徽医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室完成。①在无菌条件下，利用显微解剖分离新生小鼠（出生后2d内）脊髓，采用原代机械吹打使其成为单细胞悬液，离心，弃去上清液，加入于细胞培养液（含20μg／L碱性成纤维细胞生长因子，20μg／L表皮生长因子，B27辅助培养液），以1&;#215;10^8L^-1。密度接种于25mL培养瓶中，进行原代培养。②将原代培养7d左右的细胞再次离心。弃去上清，加入干细胞培养液，机械吹打成单细胞悬液，以5&;#215;10^7L^-1密度进行传代培养海六七天传代1次。③机械吹打制成的单细胞悬液．经过传代培养。重新增殖为神经球，采用巢蛋白抗体鉴定培养细胞，用体积分数为0．1的胎牛血清诱导神经干细胞分化后，用神经元和星型胶质细胞标志物微管相关蛋白，胶质纤维酸性蛋白相应抗体检测神经干细胞分化情况。 结果：①脊髓源性神经千细胞形态学观察：在细胞培养第3,4天即可见培养基中出现由几个或十几个细胞组成的结构紧密、大小不等的悬浮细胞团块，称之为“神经细胞球”；随着培养时间的延长和多次传代换液，细胞增殖迅速，神经细胞球数目明显增多。②脊髓神经干细胞的分化与鉴定：将神经球转入含体积分数为0．1的胎牛血清的培养液中。数小时内迅速贴壁并开始分化，5d后分化的细胞呈现出3种典型的神经细胞形态；免疫细胞化学检测神经细胞球巢蛋白染色阳性及其分化的神经元和星型胶质细胞微管相关蛋白、胶质纤维酸性蛋白分别染色阳性。 结论：新生小鼠脊髓存在具有多分化潜能的神经干细胞。它们可以在体外大量增殖，经过诱导可朝神经元和胶质细胞的方向分化。     

胎鼠纹状体神经干细胞分离培养方法的改进

目的:利用有血清和多聚赖氨酸培养液中加入SD14d胚胎大鼠纹状体区神经干细胞,探讨其分离、纯化神经干细胞操作技术的改进。方法:实验于2003-03/2004-11在广州第一军医大学珠江医院神经外科实验室完成。①选用SD大鼠20只,取孕13～14d的SD大鼠胚胎纹状体,吸管吹打(不超过10次)后,用组织剪剪成1mm3块状,以1.25mL/L的胰酶,在37℃下消化20min,以S-Dulbecco改良的Eagle培养基-F12中止消化,采用1000r/min离心10min,显微镜下细胞记数,以1×104/cm2接种到改良的有血清和多聚赖氨酸铺被的12孔培养板上,培养液为Dulbecco改良的Eagle培养基-F12加上B27,加入血清和20μg/L表皮生长因子。7d后用吸管吸取漂浮的细胞球,机械吹打成单细胞悬液,按每培养孔1×104/cm2细胞行传代再培养,此后5～7d再传代,方法同前。②利用神经干细胞与星形胶质细胞、神经细胞以及成纤维细胞贴壁之间的差异,使细胞分为贴壁和漂浮的两层细胞,分离去掉贴壁的神经细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞以及部分的神经干细胞,得到漂浮的细胞球。③机械吹打后制成单细胞悬液,再传代培养,细胞重新增殖成细胞球,应用免疫细胞化学技术特异性抗原巢蛋白检测最初的细胞球、吹打后的单细胞和重新增殖的细胞球巢蛋白抗原的表达和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。巢蛋白为神经干细胞特异性标记物,其阳性表达表明神经干细胞的存在。结果:①原代培养的纹状体细胞第2天可见贴壁生长的神经细胞、星形胶质细胞和增殖的细胞球(约10～16个细胞大小),漂浮的细胞开始出芽并增殖;第3天贴壁的细胞球继续增殖(约50个细胞大小),漂浮的细胞则增殖成4～8个大小的细胞球;第4～7天贴壁的细胞球开始分化,漂浮的细胞则继续增殖成约30个细胞大小的细胞球,巢蛋白染色阳性。②漂浮的细胞,吹打后行传代培养,加入表皮生长因子、血清和多聚赖氨酸,细胞仍漂浮生长,1周后增殖成约70～80个细胞大小的细胞球,吸管吹打继续再培养,细胞仍漂浮增殖成细胞球,巢蛋白抗原表现阳性。③免疫细胞化学染色显示原代培养中贴壁的细胞球、吹打后的单细胞、漂浮的细胞球巢蛋白染色阳性,吹打后的细胞若不加入表皮生长因子,则细胞染色显示胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白阳性。分离纯化后的细胞具有自我更新能力和多分化潜能,有很强的增殖能力。结论:利用有血清和多聚赖氨酸加入的方法分离培养的原代细胞球巢蛋白表达阳性,具有纯化度高,存活时间长的特点。     

胎鼠纹状体神经干细胞分离培养方法的改进

目的：利用有血清和多聚赖氨酸培养液中加入SD14d胚胎大鼠纹状体区神经干细胞，探讨其分离、纯化神经干细胞操作技术的改进。方法：实验于2003—03／2004-11在广州第一军医大学珠江医院神经外科实验室完成。①选用SD大鼠20只，取孕13～14d的SD大鼠胚胎纹状体，吸管吹打（不超过10次）后，用组织剪剪成1mm，块状，以1．25mL／L的胰酶，在37℃下消化20min，以S—Dulbeeeo改良的Eagle培养基-F12中止消化，采用1000r／min离心10min，显微镜下细胞记数，以1&;#215;10^4／cm^2接种到改良的有血清和多聚赖氨酸铺被的12孔培养板上，培养液为Dulbeeeo改良的Eagle培养基-F12加上B27，加入血清和20μg／L表皮生长因子。7d后用吸管吸取漂浮的细胞球，机械吹打成单细胞悬液，按每培养孔1&;#215;10^4/cm^2细胞行传代再培养，此后5～7d再传代，方法同前。②利用神经干细胞与星形胶质细胞、神经细胞以及成纤维细胞贴壁之间的差异，使细胞分为贴壁和漂浮的两层细胞．分离去掉贴壁的神经细胞、成纤维细胞、星形胶质细胞以及部分的神经干细胞，得到漂浮的细胞球。③机械吹打后制成单细胞悬液，再传代培养，细胞重新增殖成细胞球，应用免疫细胞化学技术特异性抗原巢蛋白检测最初的细胞球、吹打后的单细胞和重新增殖的细胞球巢蛋白抗原的表达和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。巢蛋白为神经干细胞特异性标记物，其阳性表达表明神经干细胞的存在。结果：①原代培养的纹状体细胞第2天叮见贴壁生长的神经细胞、星形胶质细胞和增殖的细胞球（约10-16个细胞大小），漂浮的细胞开始出芽并增殖；第3天贴壁的细胞球继续增殖（约50个细胞大小），漂浮的细胞则增殖成4-8个大小的细胞球；第4-7天贴壁的细胞球开始分化，漂浮的细胞则继续增殖成约30个细胞大小的细胞球，巢蛋白染色阳性。②漂浮的细胞，吹打后行传代培养，加入表皮生长因子、血清和多聚赖氨酸，细胞仍漂浮生长，1周后增殖成约70-80个细胞大小的细胞球，吸管吹打继续再培养，细胞仍漂浮增殖成细胞球，巢蛋白抗原表现阳性。③免疫细胞化学染色显示原代培养中贴壁的细胞球、吹打后的单细胞、漂浮的细胞球巢蛋白染色阳性，吹打后的细胞若不加入表皮生长因子，则细胞染色显示胶质纤维酸性蛋白和神经丝蛋白阳性。分离纯化后的细胞具有自我更新能力和多分化潜能，有很强的增殖能力。结论：利用有血清和多聚赖氨酸加入的方法分离培养的原代细胞球巢蛋白表达阳性，具有纯化度高，存活时间长的特点。     

新生小鼠海马、嗅球及皮质神经干细胞的分离培养及鉴定

背景：从体外分离培养出高纯度、生物学性能均一的神经干细胞,建立起一套完整的神经干细胞培养体系,是进行神经干细胞研究的基础。 目的：建立新生小鼠海马、嗅球、皮质组织神经干细胞的分离培养体系,并对其生物学特性进行分析。 方法：分离新生昆明小鼠海马、嗅球、皮质组织,采用机械分离和胰酶消化法提取原代神经干细胞。采用无血清培养技术、机械吹打和酶消化法进行传代培养神经干细胞。以体积分数为10%的胎牛血清诱导分化神经干细胞。对神经干细胞及其分化产物行CD133、巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色鉴定。 结果与结论：从新生小鼠海马、嗅球、皮质可提取出具有自我更新和多向分化能力的神经干细胞,经巢蛋白、CD133免疫荧光染色检测呈阳性;神经干细胞经胎牛血清诱导后可分化为β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞,并证实染色阳性细胞为神经元和星形胶质细胞。该实验建立了一套神经干细胞体外分离培养、纯化、鉴定、诱导分化方案,为后续神经干细胞研究的顺利进行奠定了实验基础。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景:神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的:观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法:从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论:从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞的分化

背景:在神经干细胞移植治疗帕金森病中,移植细胞的数量及多巴胺能神经元的分化比率是必须解决的问题,而有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化是解决问题的关键所在.目的:探讨胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β体外诱导中脑神经干细胞向多巴胺能神经元的分化.方法:分离妊娠12d小鼠胚胎腹侧中脑,经胰酶消化和机械吹打制成单细胞悬液,离心过滤后机械方法传代培养5～7d的神经球,分组进行诱导分化10～12d,待80%细胞从神经球迁移出来,分化为单细胞时,进行免疫细胞化学鉴定及流式细胞术检测酪氨酸羟化酶阳性细胞率.结果与结论:神经球细胞表达巢蛋白抗原,能分化为神经元特异性烯醇化酶和胶原纤维酸性蛋白阳性细胞.胶质源性神经营养因子与白细胞介素1β在体外能明显提高中脑神经干细胞分化为酪氨酸羟化酶阳性神经元的比例,胶质源性神经营养因子诱导组、白细胞介素1β诱导组和两者联合应用均较空白对照组比例高,尤其是两者联合应用作用更显著,说明胶质源性神经营养因子、白细胞介素1β可明显促进中脑神经干细胞分化为数量足够、形态及功能成熟的多巴胺能神经元.     

小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性和相关基因的表达

目的:观察小鼠胚胎神经干细胞的体外生长特性并检测其相关基因的表达。方法:实验于2005-02/06在暨南大学医学院中心实验室进行。①取妊娠13.5d昆明小鼠分离胚胎大脑中的神经干细胞,用添加碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基进行体外培养,取培养3d的神经球接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶,用含血清的培养基诱导分化。②免疫细胞化学检测细胞表面抗原。③四甲基偶氮唑盐法绘制生长曲线。④流式细胞术检测细胞周期。⑤反转录-聚合酶链反应和免疫细胞化学技术对神经干细胞进行鉴定。结果:①胚胎神经干细胞及其分化细胞的抗原表达:血清诱导8h,分化细胞中(8.9±5.6)%细胞呈Tubulin阳性,(87.5±7.4)%细胞胞浆呈胶质纤维酸性蛋白阳性表达。未诱导细胞近100%呈巢蛋白阳性,仅有极少数细胞Tubulin阳性或胶质纤维酸性蛋白阳性。②胚胎神经干细胞的细胞周期:从小鼠胚胎大脑获取的神经干细胞3d左右进入指数生长期;原代培养细胞83.8%处于静止期/DNA合成前期。③原代与传代细胞均表达巢蛋白mRNA,聚集形成的神经球巢蛋白阳性。血清诱导4h胚胎神经干细胞开始转录神经元相关基因Tau和胶质细胞相关基因胶质纤维酸性蛋白。结论:从小鼠胚胎大脑可成功分离获得大量胚胎神经干细胞,并在含碱性成纤维细胞生长因子的条件培养基中迅速增殖,血清诱导下分化生成神经元和星型胶质细胞。     

胎鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养和鉴定:有向多种成体神经干细胞分化的潜能吗?

背景:脑室周围白质软化是早产儿脑损伤的主要类型,迄今尚无防治方法.对丢失大量少突胶质细胞的白质进行神经干细胞移植,理论上应是治疗脑室周围白质软化最为理想的方案.目的:体外培养制备具有多向分化潜能的胎鼠神经干细胞,以供后期实验经脑室移植应用.方法:取孕12～14 d胎鼠大脑皮质组织,剪成1.0 mm~3小块制备单细胞悬液分离纯化,待形成细胞球后加入含小牛血清的DMEM/F12培养基进行诱导分化培养.观察神经干细胞的原代、传代培养情况,免疫组化法对神经干细胞分化情况进行鉴定.结果与结论:培养的神经干细胞活力为(94.3±2.2)%,原代培养3 d形成神经球,体外传至10代左右,神经球的细胞团增殖速度明显减慢,部分细胞老化.各代神经球均呈巢蛋白染色阳性,可确认为神经干细胞.进一步对第4代神经球诱导分化培养后,免疫组化结果分别呈GFAP,β-tublin和O4阳性.提示所制备的神经干细胞具有自我更新和增殖能力,并具备向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞分化的潜能.     

多聚赖氨酸和明胶对神经干细胞增殖和分化的影响

背景:目前大鼠神经干细胞体外诱导分化的研究报道诸多,但其分化过程很难控制,很多实验的操作方法复杂,分化比率也很低.目的:探索大鼠胚胎前脑神经干细胞体外原代及传代培养方法,并观察其分化规律.方法:胎鼠在无菌条件下分离出前脑,制备单细胞悬液,以1×1011L-1接种于含N2的DMEM/F12培养基中培养,传代培养过程中加入BrdU,标记神经干细胞球.诱导分化实验分为多聚赖氨酸铺板组、明胶铺板组和无铺板组.采用体积分数20%胎牛血清刺激其分化.免疫细胞化学检测nestin、BrdU及在血清诱导条件下神经干细胞向神经细胞分化的能力.结果与结论:细胞呈神经干细胞样生长,具有连续增殖能力,可以传代培养.传代神经球中的细胞均呈nestin阳性和BrdU阳性.多聚赖氨酸铺板组和明胶铺板组贴壁后分化为神经细胞能力强于无铺板组(P < 0.01).多聚赖氨酸铺板组略强于明胶铺板组(P > 0.05).神经谱系标记物神经胶质纤维酸性蛋白和微管相关蛋白2的免疫细胞化学结果均阳性.结果表明,大鼠胚胎前脑富含神经干细胞,其分化观察,多聚赖氨酸和明胶在诱导神经干细胞分化中作为细胞贴壁支持物提高分化细胞数量的作用,且多分化为星形胶质细胞.     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感，不同性别孤独感发生率无差异性，不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）；随年级增加，孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970，P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题，老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童，以减少其孤独感的发生。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

The characteristics of interpretation of results of analysis of protein amount in urine of pregnant women

The adequacy of implementation of present proteinuria diagnostic thresholds under examination of pregnant women was examined. The analysis was applied to all urine samples of pregnant women from December 2009 to March 20010. The amount of protein in urine was concurrently evaluated by turbidimetric analysis with sulfosalicylic acid, colorimetric analysis with pyrogallol red, "dry chemistry" technology (the diagnostic strips). It is established that the mentioned techniques of analysis of protein in urine provide independent results. The results of colorimetric analysis are characterized by better precision and adequacy. However, in case of pregnant women the diagnostic threshold of protein concentration should be shifted from 0.120 to 0.150 g/l.     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

《中国内镜杂志》主编雷光华教授简介

雷光华男,1970年12月生,骨科学博士,一级主任医师,二级教授,博士生/后导师。国家"万人计划"领军人才,教育部"长江学者"特聘教授,科技部"中青年科技创新领军人才",国家卫生计生突出贡献中青年专家,享受国务院政府特殊津贴专家,国家临床重点专科骨科和运动医学学科带头人,全国青年岗位能手,湖南省"芙蓉学者"特聘教授,湖南省科技领军人才和骨科学科领军人才,湖南省普通高校学科带头人,湖南省首届"优秀科技工作者",中南大学"湘雅名医"。