甲基营养菌代谢网络途径和代谢工程改造的研究进展

一碳化合物(甲醇或甲烷)高值化转化是当前生物工程领域的重要研究热点。甲基营养菌是一类以甲醇为碳源和能源生长的革兰氏阴性菌,随着基因组测序的开展和各类组学技术的发展,以扭脱甲基杆菌为代表的甲基营养菌的中心代谢网络途径和相关功能基因逐渐明晰。近年来,甲基营养菌中包括基因过表达、基因敲除整合等遗传操作工具的完善以及各种基因调控元件的开发,为甲基营养菌的底盘改造和异源途径优化表达提供了重要基础,国内外的研究推动了甲醇转化成多种高附加值产品。此外,人们渴望利用传统基因工程菌作为底盘构建合成型甲基菌,以期更高效实现甲醇催化转化。本文中,笔者综述了目前甲基营养菌,尤其是扭脱甲基杆菌的代谢网络特点、代谢工程改造策略与应用以及构建合成型甲基细菌这3个方面的研究进展,以期为甲基微生物催化转化的研究提供借鉴。     

一株新的产吡咯喹啉醌甲基营养菌全基因组测序和比较基因组学分析

【背景】由于甲基营养菌被发现的时间较短,而且可以生产吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone,PQQ)的甲基杆菌属细菌只有少数菌株的全基因组序列被公布,增加了该类细菌基因组学和生物代谢途径研究的难度。【目的】将本实验室筛选的PQQ生产菌经多种诱变方式处理,用于提高PQQ的发酵产量。对高产突变菌株进行全基因组解析,以探究甲基杆菌PQQ合成的分子机制,为后续分子育种提供序列背景信息。【方法】将野生型PQQ生产菌株进行紫外诱变、亚硝基胍诱变、甲基磺酸乙酯诱变、硫酸二乙酯诱变和紫外-氯化锂复合诱变。将突变菌株利用PromethION三代测序平台和MGISEQ-2000二代测序平台测序,然后进行组装和功能注释。组装得到的全基因组序列与模式菌株扭脱甲基杆菌AM1 (Methylobacterium extorquens AM1)进行比较基因组学分析。【结果】经11轮诱变获得一株突变菌株NI91,其PQQ产量为19.49 mg/L,相较原始菌株提高44.91%。突变菌株NI91的基因组由一个5 409 262 bp的染色体组成,共编码4 957个蛋白,与模式菌株M. extorquens AM1比较发现其PQQ合成过程中剪切加工相关的基因pqqF和pqqG缺失,但首次在甲基营养菌中发现与基因pqqF具有相似功能的基因pqqL,且基因pqqC/D的序列存在较大差异。【结论】为甲基营养类细菌甲基杆菌的功能基因组学研究及PQQ合成机理研究提供了基础数据支持,NI91与模式菌株M. extorquens AM1的比较基因组学分析为揭示PQQ合成的不同机理提供了分子基础。     

常压室温等离子体诱变扭脱甲基杆菌AM1高产吡咯喹啉醌

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)作为一种新型的氧化还原酶辅酶,在医药和食品等领域有广阔的应用前景。为改善扭脱甲基杆菌Methylobacterium extorquens AM1 PQQ生产性能,采用常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)进行诱变,结合高通量快速筛选方法,得到以PQQ产量为指标的正向突变株。ARTP诱变的菌株正突变率为31.6%,筛选得到的较优正突变株M.extorquens AM1(E-F3),PQQ产量达到54.0 mg/L,是出发菌株的近3倍。系统的高通量方法筛选ARTP诱变菌为后续进一步提高M.extorquens AM1菌株PQQ的产量奠定了基础,亦为改善菌株生产性能提供了新思路。     

甲醇的生物利用与转化*

甲醇作为一种来源广泛、价格低廉、还原度高的非粮原料有望成为下一代生物制造的关键原料。利用合成生物学技术构建能够高效利用甲醇的重组微生物以实现从甲醇到高值化学品的生物转化已成国内外研究热点,但由于甲醇代谢过程的特殊性及复杂性,目前人工设计的甲基营养菌还难以实现以甲醇为唯一碳源进行生长及产物合成。基于对天然甲基营养菌甲醇代谢过程的分析,从甲醇脱氢酶的筛选与改造、甲醛同化途径的重构与优化、甲醇到化学品的生物转化几个方面对合成型甲基营养菌的构建策略及面临的挑战进行总结与分析,以期为今后合成型甲基营养菌的人工设计和利用提供一定的借鉴。     

甲醇的生物利用与转化*

甲醇作为一种来源广泛、价格低廉、还原度高的非粮原料有望成为下一代生物制造的关键原料。利用合成生物学技术构建能够高效利用甲醇的重组微生物以实现从甲醇到高值化学品的生物转化已成国内外研究热点,但由于甲醇代谢过程的特殊性及复杂性,目前人工设计的甲基营养菌还难以实现以甲醇为唯一碳源进行生长及产物合成。基于对天然甲基营养菌甲醇代谢过程的分析,从甲醇脱氢酶的筛选与改造、甲醛同化途径的重构与优化、甲醇到化学品的生物转化几个方面对合成型甲基营养菌的构建策略及面临的挑战进行总结与分析,以期为今后合成型甲基营养菌的人工设计和利用提供一定的借鉴。     

醋酸菌对甲醇的净化及细菌纤维素合成研究

介绍了巴氏醋酸杆菌以甲醇为唯一碳源,通过合成细菌纤维素而将含甲醇的废水中的甲醇净化,在试验条件下,适宜的培养条件为：培养基初始pH值5.0-6.0,接种量为5%,发酵培养温度为30℃,振瓶转速100r/min,巴氏醋酸杆菌对甲醇的最大净化浓度为3.8%,培养4d时的最大净化率达96%以上。     

新型重组毕赤酵母产人胰岛素前体的表达工艺研究

以毕赤酵母为异源表达宿主合成人胰岛素前体,在实验室研究和工业生产中已有广泛应用。目前研究主要使用天然甲醇诱导型AOX1启动子,以甲醇为单一基础碳源进行胰岛素前体的诱导发酵生产。但在毕赤酵母高密度发酵生产过程中,甲醇代谢过程耗氧大、产热高,补料控制工艺复杂,限制了发酵生产的放大。基于前期对启动子AOX1的转录调控设计研究,提出以人工设计的高效组成型转录调控器件CSAD_5驱动胰岛素前体基因表达,开发了以葡萄糖为碳源的发酵生产工艺,以解决甲醇体系中的产热、耗氧及工艺控制问题。在此基础上,通过增强筛选压力提高异源基因拷贝,获得了一株胰岛素前体高表达重组毕赤酵母,利用优化的培养工艺在5L反应器水平发酵生产,胰岛素前体产量在108h达到1. 85g/L,为目前报道以葡萄糖为碳源,生产人胰岛素前体的最高水平,为胰岛素前体的工业生产及毕赤酵母的应用提供了新的思路和方法。     

葡萄糖和麦芽糖碳源底物对粪产碱杆菌合成凝胶多糖的胞内代谢流影响*

麦芽糖和葡萄糖对粪产碱杆菌发酵合成凝胶多糖有着显著的影响,为了详细分析两种底物对凝胶多糖合成的影响机制,利用恒化培养实验及稳态碳平衡代谢分析,研究发现在稀释速率为0.1h^-1时,利用麦芽糖和葡萄糖为碳源底物的条件下粪产碱杆菌的微观代谢途径通量有较大的差异。以麦芽糖为底物时凝胶多糖的摩尔得率为53.8%,比葡萄糖为碳源时的摩尔得率(36.9%)高出了45.8%以上。同时以麦芽糖为碳源时HMP途径的绝对代谢通量比葡萄糖时的通量提升了40%以上。这条途径通量的增加,提升了NADPH还原力供给速率,促进了依赖于还原力NADPH的凝胶多糖合成途径通量,提升了碳源底物向产物的摩尔转化速率。而且代谢流分析结果显示ED途径通量和能量提供也是影响粪产碱杆菌凝胶多糖合成效率的关键因素。麦芽糖作为碳源底物过程中维持的较低的残留葡萄糖浓度解除了高葡萄糖浓度条件下对凝胶多糖合成的抑制,能够实现更高通量的ATP能量提供效率,更加促进了凝胶多糖合成通量。     

一株分离自海水的产生物表面活性剂菌株的鉴定及其发酵优化

为研究分离自海水的芽孢杆菌dhs-330产生物表面活性剂的培养条件和产物特性,采用16S r DNA基因序列分析鉴定菌种,对发酵培养基的碳源、氮源、p H值和培养温度进行优化,采用飞行时间质谱进行产物鉴定及抑菌圈法考察产物抑菌活性。结果显示,该菌株与Bacillus mojavensis菌株16S r DNA的序列相似性为99%。菌株发酵液表面张力可由70 m N·m-1降低至27 m N·m-1。发酵培养基的最适碳源、有机氮源和无机氮源分别为甘油、酵母膏和尿素;p H值为6.5~7.0、温度为30~35℃条件下,菌体生长和生物表面活性剂合成最为有利。发酵产物为脂肽-糖脂混合型生物表面活性剂,对海洋污损微生物Bacillus pumilus dhs04有显著的抑菌活性。菌株dhs-330是能合成脂肽-糖脂混合生物表面活性剂、具有海洋污损微生物防除潜力的优选菌株。     

利用不同碳源进行毕赤酵母高密度发酵及TEF-1启动子指导下的HPV16_L1蛋白表达

目的:研究不同碳源对于毕赤酵母菌株在发酵罐中高密度生长,以及对组成型翻译延伸因子-1(TEF-1)启动子指导下HPV16_L1蛋白表达的影响。方法:利用1.5L发酵罐使用不同碳源进行毕赤酵母的高密度发酵,检测在不同碳源利用情况下菌体的增殖动力学,并以Western blot动态分析HPV16_L1蛋白的表达水平。结果:以甘油作为碳源,菌体细胞湿重可达到510g/L(OD600为189.4),HPV16_L1的表达在72h之前保持高水平;在甲醇和葡萄糖中菌体细胞湿重都可达到220g/L左右(OD600分别为75.3和77.3),甲醇利用下HPV L1蛋白在144h后仍保持较高水平表达,葡萄糖中60h HPV L1表达开始显著下降;在山梨醇作为碳源情况下菌体未能在发酵罐中获得高密度生长;总体上,甘油作为碳源在72h左右可获得最高的目的蛋白收获总量。结论:为实现毕赤酵母高密度生长与异源基因在TEF-1启动子指导下高效表达,以及HPV L1蛋白的简易、有效制备提供了基础。     

干酪乳杆菌12A碳源代谢的比较基因组学分析

【目的】在基因组学水平上,对干酪乳杆菌的碳源代谢特性及调控机制进行研究。【方法】基于BioCyc和MetaCyc数据库,利用Pathway Tools对菌株12A及7株已公布全基因序列的干酪乳杆菌进行全基因组水平的碳源代谢比较分析。【结果】全基因组比较分析结果显示,干酪乳杆菌12A可以将9种糖转运到细胞内代谢利用;可以将多种寡糖和多糖在细胞外水解成半乳糖和葡萄糖;干酪乳杆菌12A可经异型乳酸发酵或混合酸发酵途径生成乙醇及其副产物。【结论】干酪乳杆菌12A可以代谢多种类型碳源,底物选择范围宽泛,而且可以作为工业乙醇发酵的特定菌株;利用比较基因组学方法建立基因结构与细菌代谢能力的联系是可靠的。     

灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆及超量表达对三萜合成的影响

灵芝Ganoderma lucidum是我国传统的药用真菌,三萜类物质是灵芝的主要生物活性成分,甾醇14α-脱甲基酶是三萜合成途径中的关键酶。根据已报道其他物种甾醇14α-脱甲基酶的氨基酸保守序列设计简并引物,获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶特异基因片段,并进一步获得灵芝甾醇14α-脱甲基酶基因的全长DNA和cDNA序列。其中DNA序列长1,981bp,cDNA序列长1,635bp。结构基因编码蛋白包含544个氨基酸,分子量为61.99kDa,等电点为6.36。将甾醇14α-脱甲基酶基因的cDNA序列克隆到灵芝超量表达载体pGl-GPD中,利用农杆菌介导的转化法实现了甾醇14α-脱甲基酶基因在灵芝内的超量表达。转化子的甾醇14α-脱甲基酶基因在转录水平表达量增加,三萜含量增加。进一步研究发现,三萜合成途径的关键酶基因Gl-aact、Gl-hmgr及Gl-ls的转录表达量也有所增加。     

致癌土壤杆菌K-8菌株的分离和几株致癌土壤杆菌的初步鉴定

利用3-酮基乳糖反应特性和对不同碳源培养基上生长能力的相关性,用DYL和YBS培养基从桃树新鲜幼嫩的冠瘿中分离到具致癌力的土壤杆菌K-8菌株。对四株国内分离的致癌菌株鉴定,确定菌株S-1、B-1为根癌土壤杆菌生物Ⅰ型菌株,而K-8和702为根癌土壤杆菌生物Ⅱ型菌株。     

谷氨酸棒杆菌耐受胁迫机制及工业鲁棒性合成生物学研究进展

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum作为一般被认为具有生物安全性的一种模式工业微生物,不仅在发酵工业中成功用于大规模生产氨基酸,而且具有合成多种新型化学品的潜力。谷氨酸棒杆菌菌株在生产化合物时,经常会受到各种逆境条件的胁迫,从而降低细胞活力和生产性能。合成生物学的发展为提高谷氨酸棒杆菌的鲁棒性提供了新的技术手段。本文总结了谷氨酸棒杆菌应对发酵过程中各种胁迫的耐受机制。同时,重点介绍提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性和耐受性的合成生物学新策略,包括挖掘新的抗逆元件、改造转录调控因子、利用适应性进化策略挖掘抗逆功能模块等。最后,从生物传感器、转录调控因子的筛选和设计、多种调控元件利用等方面对提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性进行了展望。     

产琥珀酸放线杆菌发酵生产琥珀酸的研究进展

近年来,因瘤胃微生物产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes具有高的琥珀酸产量,并能够利用多种碳源进行发酵等优点,在利用发酵法生产琥珀酸领域具有广泛的应用前景和商业化价值,因而其代谢途径和发酵工艺等基础研究成为国内外研发的热点。近年来,人们在产琥珀酸放线杆菌的代谢途径、琥珀酸发酵动力学模型、新型经济培养基以及高产菌株选育等方面的研究取得了很大进展,对研发琥珀酸发酵工艺、降低生产成本和节能减耗等具有重要的理论意义。     

剩余活性污泥完全资源化利用微生物集成技术

剩余活性污泥完全资源化利用微生物集成技术包括: 使用土著PHA合成菌回注法驯化并发酵活性污泥, 生产生物降解材料聚羟基脂肪酸酯(PHA); 采用土著嗜酸性氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌进行生物淋滤, 去除重金属; 以解磷菌和解钾菌为菌种, 进行固态发酵, 生产生物菌肥。结果表明, 500 L中试PHA占挥发性悬浮固体的20%以上; 重金属含量达到国家排放要求; 生物菌肥中活菌数大于1×108 个/g以上。实现了剩余活性污泥的近零排放。     

枯草芽孢杆菌发酵条件优化及其破乳效能

本文对枯草芽孢杆菌在不同碳源、氮源培养基的生长及破乳效能进行了研究, 并通过正交试验对枯草芽孢杆菌的发酵条件进行优化结果表明, 单一碳源葡萄糖和混合碳源葡萄糖 + 液体石蜡的培养基可提高枯草芽孢杆菌的发酵产量; 单一碳源葡萄糖、混合碳源葡萄糖 + 汽油和以硝酸铵 + 酵母膏为氮源的菌液有较高的破乳效能; 在正交试验中, 培养温度对枯草芽孢杆菌的发酵产量影响最大, 其最优组合为: 培养温度25oC, 摇床转数140 r/min, 培养pH值7.0, 接菌量6 mL, 培养时间24 h。摇床转数对枯草芽孢杆菌的发酵产物的破乳效能影响最大, 优化结果为: 培养温度25oC, 摇床转数140 r/min, pH值7.0, 培养时间20 h。     

甲醇重新用作发酵生物领域的碳源

甲醇作为发酵、生物工程领域的碳源,在日本正显露头角。由于各国甲醇设备将相继建成,其价格趋向稳定,为此都密切注视着利用甲醇产品开发的工业化生产。过去,作为微生物同化甲醇的 SCP 是研究、成品化的主要目的,但由于种种原因,已不想往工业生产上发展,而向新化学制品领域的方向展开研究。例如用甲醇作碳源生     

琥珀酸脱氢酶或琥珀酰辅酶A合成酶缺失促进大肠杆菌积累5-氨基乙酰丙酸

5-氨基乙酰丙酸 (ALA) 是生物体内四吡咯类化合物的合成前体,在农业及医药领域应用广泛,是极具开发价值的高附加值生物基化学品。目前利用外源C4途径的重组大肠杆菌发酵生产ALA的研究主要利用LB培养基并添加葡萄糖和琥珀酸、甘氨酸等合成前体,成本较高。琥珀酸在C4途径中以琥珀酰辅酶A的形式直接参与ALA的合成。文中在以葡萄糖为主要碳源的无机盐培养基中研究了琥珀酰辅酶A下游代谢途径琥珀酸脱氢酶编码基因sdhAB和琥珀酰辅酶A合成酶编码基因sucCD缺失对ALA积累的影响。与仅表达异源ALA合成酶的对照菌株相比,sdhAB和sucCD缺失菌株ALA的产量分别提高了25.59%和12.40%,且ALA的积累不依赖于琥珀酸的添加和LB培养基的使用,从而大幅降低了生产成本,显示出良好的工业应用前景。     

浓香型酒窖中生丝微菌的分离与特性

从浓香型大曲酒发酵糟中,首次分离到一株能利用甲醇为唯一碳源和能源的生丝微菌Hy-phomicrobium sp M7。该菌具有独特的形态学特征:细胞顶端常生长一根菌丝结构。通过菌丝出芽而繁殖。细胞呈卵圆形,单独存在。菌落淡褐色。该菌对甲醇有较大的亲和力。在甲醇存在时,能以NO_3~-为电子受体进行厌氧生长。能利用甲醇、甲胺类化合物、乙醇、乙酸盐作为碳源生长,不利用c_2以上的有机物。在乙醇为碳源的培养基上,菌丝顶端常长出一种喇叭口结构。最适氮源为NH_4~+,酒糟浸液、酵母膏对生长有促进作用。该菌不同于文献报道的已知种。讨论了该菌在酒窖中存在的生态意义。