Ｌｉｖｉｎ特异性ｓｉＲＮＡ表达载体在胃癌细胞中的稳定表达

目的:构建以Livin基因为靶基因的siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo/Livin,获得稳定沉默Livin基因的胃癌细胞SGC-7901/siRNA-Livin.方法:化学合成siRNA,Livin寡核苷酸,将其分别克隆进载体pGPU6/GFP/Neo,进行核酸序列测定.脂质体法转染SGC-7901细胞,半定量RT-PCR和Western blot检测Livin基因在SGC-7901细胞中的沉默效率,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆.结果:酶切分析显示,所有质粒均为阳性重组载体,核酸测序表明合成的序列准确插入pGPU6/GFP/Neo载体,G418筛选基因转染SGC-7901细胞后形成稳定克隆.其中pGPU6/GFP/Neo/Livin-4转染后Livin mRNA沉默效率大于70%.结论:成功获得Livin特异性siRNA表达载体,SGC-7901细胞Livin基因的表达受到抑制,转染胃癌细胞后获得SGC-7901/siRNA-Livin细胞克隆.     

p73β基因转染对胃癌细胞的生物学影响

目的研究人p73β基因转染对人胃癌细胞SGC-7901的生物学影响,探讨p73β基因抑制SGC-7901细胞增殖的机制。方法用脂质体转染法瞬时转染SGC-7901细胞,转染重组质粒pcDNA3.1-p73β（SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组）和空载质粒pcDNA3.1-N0（SGC-7901-pcDNA3.1-N0组）,并用未转染质粒具有相同遗传背景和代数的SGC-7901细胞作为空白对照（SGC-7901组）。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中P73β、p21、c-myc表达量变化,MTT法观察细胞增殖的活力,原位细胞凋亡检测TUNEL法观察细胞凋亡。结果RT-PCR检测发现SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞与SGC-7901-pcDNA3.1-N0和SGC-7901两对照组相比,其p73β表达明显增高,p21相对表达量明显增多,c-myc相对表达量明显减少。与两对照组相比,SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞增殖率明显减弱,细胞凋亡率明显增高（均P〈0.05）。结论p73β基因可以促进SGC-7901细胞内p21基因的表达,抑制c-myc基因表达。p73β基因可降低胃癌细胞增殖力,诱导胃癌细胞凋亡。     

siRNA干扰Msi1对人胃癌SGC-7901细胞的影响

目的探讨siRNA沉默Msi1基因表达对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡、侵袭与转移的影响。方法针对Msi1 mRNA序列设计合成siRNA,转染SGC-7901细胞。RT-PCR法检测Msi1基因表达;Westernblot检测survivin、caspase3及MMP-9表达;MTT法检测SGC-7901细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果Msi1 siRNA能有效抑制胃癌SGC-7901细胞中Msi1的表达,与空白对照组比较,Msi1 siRNA组SGC-7901细胞生长、增殖速度减缓(P<0.05);survivin、MMP9蛋白表达水平显著下调(P<0.05),而caspase3蛋白表达水平上调(P<0.05);Msi1 siRNA组凋亡率增高。结论沉默Msi1对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡、侵袭与转移有负性调节作用。     

抑癌基因maspin在胃癌细胞株SGC-7901中的表达及意义

目的探讨抑癌基因maspin在胃癌细胞株SGC-7901生长和凋亡过程中的生物学作用。方法构建重组质粒pCD-NA3.1-maspin,转染胃癌细胞株SGC-7901,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学检测maspin基因表达,MTT法检测细胞增殖,原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果重组质粒pCDNA3.1-maspin导入SGC-7901细胞株后,maspin的mRNA和蛋白表达明显增强(P<0.05),胃癌细胞株SGC-7901增殖受到抑制,并出现明显的细胞凋亡。结论 maspin基因可以抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,并诱导细胞凋亡。     

si-RNA介导FGFR1基因沉默对胃癌细胞生长及凋亡的影响

目的探索靶向沉默成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）表达对胃癌细胞SGC-7901生长及凋亡的影响。方法通过Westernblotting法研究FGFR1蛋白在胃癌细胞SGC-7901以及人正常胃黏膜上皮细胞GES-1的表达情况;设计合成特异性针对FGFR1基因的小干扰RNA（siRNA）及阴性对照-siRNA（NC-siRNA）;采用瞬时转染法将siRNA转入胃癌细胞SGC-7901中,Westernblotting法检测转染siRNA-FGFR1后对SGC-7901细胞中FGFR1蛋白表达的影响。通过MTT法检测siRNA-FGFR1对SGC-7901细胞增殖抑制的时间-效应关系,以及克隆集落形成实验检测siRNA-FGFR1对SGC-7901细胞克隆集落形成的影响;采用Hoechst染色法和流式细胞术检测siRNA-FGFR1对胃癌细胞凋亡的影响。结果与人正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比,胃癌细胞SGC-7901的FGFR1蛋白表达水平明显增高（P＜0.05）;siRNA-FGFR1转染SGC-7901细胞后,FGFR1蛋白表达水平明显下调（P＜0.05）;胃癌细胞增殖生长曲线提示,用siRNA技术沉默胃癌细胞中FGFR1的表达后,相较于空白组和NC-siRNA组,siRNA-FGFR1组细胞增殖明显受抑制,另外胃癌细胞SGC-7901克隆集落形成明显受抑制;流式细胞术结果表明,正常组与NC-siRNA组中胃癌SGC-7901细胞早期凋亡百分比差异无统计学意义（P＞0.05）,而siRNA-FGFR1组细胞早期凋亡百分比显著升高（P＜0.01）。结论siRNA-FGFR1可抑制FGFR1蛋白在人胃癌细胞SGC-7901中的表达,并抑制胃癌细胞的生长,促进其凋亡。以FGFR1为靶点的小RNA干扰技术有望成为胃癌靶向治疗的新方法。     

谷氨酰胺酶反义基因诱导胃癌细胞凋亡的作用研究

目的 利用反义核酸技术封闭胃癌细胞的谷氨酰胺酶基因,观察反义GAcDNA能否对胃癌细胞的恶性表型有所逆转,为肿瘤的基因治疗探索一条新途径,也为后续研究及临床应用奠定基础.方法 将含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3.0/GA,通过脂质体介导转入胃癌细胞SGC-7901,经筛选、鉴定,命名为SGC-7901GA,采用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况,观察反义核酸转染后胃癌细胞凋亡的改变.结果 pcDNA3.0/GA通过脂质体介导转染胃癌细胞SGC-7901,PCR证实GAcDNA目的 片段已经整合到了SGC-7901细胞基因组,获得的G418抗性细胞命名为SGC-7901GA.检测胃癌细胞的凋亡情况表明重组质粒转染后SGC-7901GA的TUNEL阳性细胞数量显著上升,与对照组比较差异有统计学意义.结论 本实验通过含有GAcDNA片段的反义真核表达载体pcDNA3.0/GA转染胃癌细胞株,发现胃癌细胞的凋亡指数增加,提示肿瘤细胞恶性程度有所降低,反义核酸技术封闭谷氨酰胺酶基因可能成为肿瘤基因治疗的一条新途径.     

PCDNA3/p33ING1、wt-p53转染对胃癌细胞株SGC-7901生长抑制及凋亡的影响

目的 研究p33^ING1基因与p53基因间的协同功能对胃癌细胞生长抑制和细胞凋亡的影响。方法 构建PCD—NA3／p33^ING1真核表达质粒（正义，反义）与wt—p53质粒，将其单、共转染至胃癌细胞株SGC-7901；应用流式细胞仪检测细胞生长周期曲线比例；TUNEL法、MG-P-MY法染色观察SGC-7901的凋亡情况。结果 p33^ING1单转染和wt-p53共转染的SGC-7901胃癌细胞株较反义组和转染空载体组细胞生长速度减慢。细胞周期G0／G1期延长，S期变短（P〈0．05），细胞调亡数增加（P〈0．05）。结论 p33 ING1具有抑癌功能及生物活性．与p53基因共同抑制胃癌细胞的生长，诱导细胞的凋亡，使细胞周期阻滞。二者呈协同依赖关系。     

小干扰RNA沉默鸟苷酰环化酶C基因促进胃癌细胞的凋亡

目的:利用RNA干扰技术,研究靶向鸟苷酰环化酶C(Guanylyl cyclaseC,GC-C)的小干扰RNA(siRNA)在体外对人胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响。方法:利用pSilencerTM4.1-CMV neo通过siRNA表达载体法制备GC-CsiRNA,将GC-CsiRNA转染胃癌SGC-7901细胞,流式细胞检测技术及原位末端标记(TUNEL)法检测转染前后细胞的凋亡。结果:流式细胞仪结果分析示转染组平均凋亡率为5.48%±0.10%(48h)和5.63%±0.11%(72h),较对照组0.50%±0.09%明显增加(P<0.05)。TUNEL检测见特有的凋亡征象,对照组则无明显变化。结论:沉默鸟苷酰环化酶C基因可促进胃癌细胞凋亡,可能为临床探索胃癌生物治疗提供新的靶点。     

胃癌组织和SGC-7901细胞中nucleostemin基因表达的实验研究

目的检测nucleostemin(NS)基因在胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞中的表达情况。方法21例胃癌手术标本,提取胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞株总RNA,用半定量RT-PCR方法检测胃癌组织和SGC-7901中NS基因的表达情况。用脂质体法将PCDNA4/C-NS-silencer质粒及空载体PCDNA4/C-vector质粒分别转染SGC-7901细胞,分别命名为silencer组和vector组,未转染的SGC-7901细胞记为normal组,RT-PCR方法检测NS基因表达量。用MTT法检测3组细胞的生长增殖情况。结果胃癌组织和SGC-7901细胞中皆有NS基因表达。定性分析显示,与vector组和normal组比较,silencer组细胞趋于分化,NS基因表达量下降。细胞培养24 h、48 h、72 h后,si-lencer组和vector组细胞增殖抑制率间差别均有统计学意义(P<0.01)。结论胃癌组织和SGC-7901细胞中有NS基因表达;NS基因特异性RNA干扰使NS基因表达量下降,抑制SGC-7901细胞株体外增殖。     

沉默Calnexin基因表达对胃癌细胞SGC-7901内质网应激凋亡及其信号通路的影响

目的探讨沉默钙连蛋白（Calnexin）基因对胃癌细胞SGC-7901内质网应激凋亡信号通路的影响。方法构建靶向Calnexin基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,转染人胃癌SGC-7901细胞,并分为转染shRNA-Calnexin的实验组,转染shRNA空白质粒的空白载体组,并将未转染的SGC-7901细胞作为对照组。应用RT-PCR技术检测靶向沉默Calnexin的表达,应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测各组细胞增殖情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡情况;Westernblot检测GRP94、IRE1、ATF6及CHOP表达水平。结果转染shRNA沉默Calnexin基因可明显下调CalnexinmRNA的表达,实验组与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;MTT法检测实验组细胞转染后细胞增殖能力明显下降（P＜0.05）;沉默Calnexin基因可提高细胞凋亡率,转染72h后实验组与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;沉默Calnexin基因使胃癌细胞中GRP94、IRE1、ATF6及CHOP蛋白表达水平明显升高（均P＜0.05）。结论靶向沉默Calnexin基因抑制人胃癌细胞增殖和促进细胞凋亡可能是通过抑制内质网应激信号通路实现的。     

NF-κB途径在舒林酸促人胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用

目的探讨核因子κB（NF-κB）途径在舒林酸促人胃癌SGC-7901细胞凋亡中的作用。方法体外培养人胃癌SGC-7901细胞,舒林酸（0.1、0.3、0.6、1.2、2.4 mmol/L）作用后,苏木精-伊红染色、电镜观察药物作用后细胞形态学变化,免疫组化、Western-blot方法检测药物对人胃癌SGC-7901细胞核因子κB（NF-κB）、bcl-2、bax蛋白表达的影响。结果苏木精-伊红染色检测结果显示舒林酸抑制肿瘤细胞生长,肿瘤细胞出现核固缩、核碎裂、染色质边集等凋亡及坏死的形态学表现;电镜下可看到染色质边集、凋亡小体;免疫组化、West-ern-blot结果显示舒林酸作用48 h后人胃癌SGC-7901细胞NF-κB、bcl-2表达逐渐下降,bax表达逐渐上升,具有剂量依赖性。NF-κB与bcl-2蛋白表达率之间具有相关性（r=0.846 5,P〈0.01）。结论舒林酸可以促进人胃癌SGC-7901细胞凋亡,NF-κB途径在舒林酸促进胃癌SGC-7901细胞凋亡中发挥部分作用。     

腺病毒介导的ING4基因抑制胃癌细胞生长及其分子机制

目的:研究肿瘤生长抑制基因4(inhibitor of growth family4,ING4)体外对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制及其分子机制。方法:将携带有人ING4基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-hING4)感染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR法检测腺病毒介导的外源性hING4基因的转录,MTT法检测hING4基因对SGC-7901细胞的生长抑制作用,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察hING4基因诱导SGC-7901细胞凋亡的形态学改变,流式细胞仪(FACS)检测hING-4基因诱导胃癌细胞SGC-7901的凋亡率及细胞周期改变,免疫细胞化学分析凋亡相关因子bcl-2和bax的改变。结果:Ad-hING4感染SGC-7901细胞后,RT-PCR结果提示有hING4目的基因的转录,该基因表达可以显著抑制SGC-7901细胞的生长,诱导S期减少、G2/M期阻滞和凋亡,hING4基因能使SGC-7901细胞中bcl-2的表达下调和bax的表达上调。结论:重组腺病毒Ad-hING4对胃癌细胞SGC-7901具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用,其作用机制可能与下调bcl-2基因和上调bax基因的表达有关。     

AHVAC-Ⅰ对人胃癌细胞株SGC-7901生长增殖的影响及作用机制

目的:探讨皖南蝮蛇毒抑瘤组分Ⅰ(AHVAC-Ⅰ)对人胃癌细胞株SGC-7901生长增殖的影响及作用机制。方法:AHVAC-Ⅰ处理SGC-7901细胞。CCK-8法检测其生长抑制作用,光镜观察细胞形态变化,TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果:AHVAC-Ⅰ抑制SGC-7901细胞的生长增殖,并呈浓度依赖性,半数抑制浓度(IC50)为58.197μg/ml;镜下可见SGC-7901细胞悬浮、胞核固缩等典型凋亡形态学变化;TUNEL法显示凋亡指数随浓度增加而增加。结论:AHVAC-Ⅰ对人胃癌细胞株SGC-7901具有生长抑制作用,诱导凋亡可能是其主要的作用机制之一。     

HERG K+ channels expression in gastric cancers and analysis of its regulation in tumor cell proliferation and apoptosis

Objective: To investigate the expression of herg 1 gene in tumor tissues from gastric carcinomas and gastric carcinoma cell lines, and study the relationship between HERG K+ channel expressions and tumor cell proliferation and apoptosis. Methods: RT-PCR and PCR assays were used to detect the expression of herg 1 gene in 64 gastric carcinomas and the gastric cancer cell line SGC-7901. Blocking the HERG K+ channels was used to evaluate their effects on tumor cell proliferation and apoptosis. Results:The statistically significant expression of herg 1 gene was detected in all the gastric cancers and SGC-7901 cells, but not in normal tissues. The HERG K+ channel blocker, E-4031, increased the cell population in G0/G1 (P＜0.05) and the number of apoptotic tumor cells(P＜0.05). Conclusion: HERG K+ channels were expressed in all gastric carcinomas tested and these channels appear to modulate tumor cell proliferation and apoptosis.     

苦参素对胃癌SGC-7901细胞凋亡及细胞骨架改变的研究

目的 探讨苦参素对胃癌细胞株SGC-7901的抑制增殖效应及凋亡诱导作用。方法 用苦参素处理SGC-7901细胞,采用MTT法检测苦参素对细胞的抑制作用,透射电镜观察微丝的变化,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期。结果 苦参素使SGC-7901细胞呈凋亡改变,细胞的活力下降,微丝几近消失,不同浓度的苦参素均可导致细胞凋亡和细胞周期阻抑。结论 苦参素能抑制胃癌细胞增殖,能诱导胃癌细胞凋亡。     

靶向COX-2的siRNA抑制三种不同分化程度胃癌细胞生长及作用机制

目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在体外抑制COX-2表达,研究其抑制三种不同分化程度的胃癌细胞(MKN-28,SGC-7901,BGC-823)的可能性,探讨RNAi抑制胃癌生长与胃癌细胞分化程度的相关性. 方法:设计靶向COX-2基因的siRNA,构建重组表达质粒pTZU6 1-siRNA-COX-2并导入胃癌细胞株,体外诱导RNAi,采用逆转录PCR(RT-PCR)和Western blotting检测COX-2基因表达变化,MTT法检测细胞活力,原位末端标记(TUNEL)及透射电镜检测细胞凋亡,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的改变. 结果:pTZU6 1-siRNA-COX-2质粒导入细胞后,SGC-7901和BGC-823中COX-2表达明显下调,细胞生长被抑制,并出现特征性的细胞凋亡,同时有Bax蛋白上调和Bcl-2蛋白下调. 对照组则无明显变化. 结论:RNAi显著抑制胃癌细胞生长,可能与下调COX-2基因表达和诱导细胞凋亡有关,其对中分化胃癌细胞的抑制作用最为显著,提示RNAi的作用可能依赖于胃癌细胞的分化程度.     

小白菊内酯对人胃癌细胞株SGC-7901增殖及Livin和Ki67蛋白表达的影响

目的观察小白菊内酯(Par)对人胃癌细胞株SGC-7901增殖及Livin、Ki67蛋白表达的影响。方法将人胃癌细胞SGC-7901分为空白对照组、阳性对照组和Par作用组,分别用普通培养液、氟尿嘧啶培养液、Par培养液进行培养。采用MTT法测定Par对人胃癌细胞SGC-7901的体外生长抑制率,并用免疫组化法检测3组细胞的Livin、Ki67蛋白表达量。结果细胞培养24、48、72 h,Par作用组SGC-7901体外生长抑制率显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);而与阳性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Par作用组Livin和Ki67蛋白表达量均较空白对照组显著降低,差异有统计学意义(P<0.01);而与阳性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论Par可抑制人胃癌细胞株SGC-7901的生长,其机制与降低Livin、Ki67蛋白表达量有关。     

乙酰肝素酶反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的：探讨乙酰肝素酶(HPA)反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)对人胃癌细胞株SGC-7901细胞凋亡的影响及其作用机制。方法：设计合成HPAAS-ODN．用脂质体介导法转染SGC-7901细胞,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染前后细胞HPA-mRNA及p53、bcl-2基因的表达;用倒置相差显微镜及扫描电镜观察转染前后细胞的形态学变化;用DNA末端原位标记染色法(TUNEL)检测转染前后细胞的凋亡指数;用流式细胞仪检测转染前后细胞凋亡率的变化。结果：HPAAS-ODN转染后,SGC-7901细胞内HPA-mRNA表达下降,p53的表达量升高,bcl-2的表达量降低;细胞凋亡指数和凋亡率升高;出现了典型的凋亡细胞的形态学变化。结论：HPAAS-ODN可有效地抑制胃癌细胞HPA mRNA的表达：并通过下调bcl-2,上调p53的表达,诱导胃癌细胞凋亡。     

大豆异黄酮诱导人胃癌细胞株SGC-7901凋亡的研究

目的:探讨大豆异黄酮对体外培养的人胃癌细胞SGC-7901生长的抑制和诱导细胞凋亡的作用.方法:用MTT法检测药物效应,透射电镜及流式细胞仪观察大豆异黄酮处理SGC-7901细胞后细胞周期和细胞凋亡.结果:(1)MTT法证实大豆异黄酮对SGC-7901细胞生长有抑制作用,并呈剂量-效应关系.(2)流式细胞仪分析大豆异黄酮处理SGC-7901细胞后细胞滞留于G2/M期,并可见凋亡峰.(3)透射电镜可见SGC-7901细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变.结论:大豆异黄酮对人胃癌细胞SGC-7901有抑制作用,抑制作用与诱导胃癌细胞凋亡、阻抑细胞周期进程有关,诱导胃癌细胞凋亡、阻抑细胞周期进程是大豆异黄酮抗胃癌作用的机制之一.     

苦参碱诱导人胃癌细胞凋亡及对端粒酶活性的影响

目的 研究苦参碱对人胃癌细胞诱导凋亡作用及端粒酶活性变化。方法苦参碱处理人胃癌细胞株SGC-7901后，用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长抑制效应，显微镜下观察胃癌细胞形态变化，应用流式细胞仪(FCM)检测细胞周期和凋亡，用PCR-ELISA法对胃癌细胞端粒酶活性进行检测。结果不同浓度的苦参碱对SGC-7901有明显抑制作用，且呈时间依赖性及剂量依赖性，形态学观察也发现大量神经细胞的染色质凝聚，核碎裂，凋亡小体产生，细胞即出现明显的凋亡形态特征，FCM检测结果显示苦参碱作用后，G0／G1期细胞比例增高，S期、G2／M期细胞比例下降，苦参碱在诱导细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调，且随苦参碱浓度增大和时间延长，抑制作用逐渐增强。结论苦参碱对人胃癌细胞具有明显抑制作用，诱导细胞凋亡并抑制端粒酶活性可能是其发挥抗癌作用的机制之一。