激光捕获显微切割结合RNA线性扩增技术在膀胱移行细胞癌相关基因研究中的应用(英文)

目的当对有间质细胞混杂的膀胱移行上皮细胞与膀胱移行细胞癌进行基因差异表达分析时,激光捕获显微切割技术(laser cap-ture microdissection,LCM)是不可缺少的,然而从 LCM 所得的细胞中获取足够 RNA 量相当困难。本文首次将 LCM 与 RNA 线性扩增结合用于膀胱癌相关基因研究,目的是确定一条切实可行的技术路线,将膀胱移行上皮细胞从膀胱粘膜中分离出来,将膀胱癌细胞从肿瘤间质细胞中分离出来,并对其进行 RNA 体外线性扩增,以备进一步研究。方法采用 LCM 技术分别从正常膀胱粘膜及膀胱癌组织冰冻切片中获取膀胱移行上皮细胞及膀胱癌细胞,提取 RNA,并对微量RNA 进行体外线性扩增。然后用 RT-PCR 验证扩增前、后 RNA 中β-actin 基因表达水平。结果对照实验Ⅰ证实经 LCM 后 RNA 完整性较好;经对照实验Ⅱ初步确定设定条件下 LCM shooting 次数与可获得 RNA 量间对应关系。从膀胱粘膜种捕获膀胱移行上皮细胞25万 shootings;从膀胱癌组织中获取癌细胞20万 shootings。产物 RNA 扩增后获得片段大小为0.5～2.5kb 的 aRNA,且β-actin 基因表达表达完整。结论 LCM 结合 RNA 体外线性扩增技术能成功地获取较为单一的研究目的细胞,扩增后 RNA 完整性较好,能用于进一步研究中。     

激光捕获显微切割技术应用于子宫内膜癌相关基因的研究

目的：摸索一条可行的技术路线，运用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection，LCM)获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞，用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究。方法：采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞，提取微量RNA，并对微量RNA进行纯化及浓缩，用RT—PCR验证捕获细胞RNA中β-actin基因表达水平。结果：分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞各50000 Shootings。对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好。确定了LCM Shooting次数与可获得RNA量间对应关系。捕获细胞所提取的RNA中β-actin基因表达完整。结论：通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞，此过程不会造成细胞RNA明显降解，可以应用于下游的实验研究。     

激光捕获显微切割技术应用于子宫内膜癌相关基因的研究

目的:摸索一条可行的技术路线,运用激光捕获显微切割技术(lasercapturemicrodissection,LCM)获取无间质混杂的人正常子宫内膜腺管上皮细胞与子宫内膜癌细胞,用于进行子宫内膜癌相关基因差异表达的研究。方法:采用LCM技术分别从正常子宫内膜组织及子宫内膜癌组织冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞,提取微量RNA,并对微量RNA进行纯化及浓缩,用RTPCR验证捕获细胞RNA中β-actin基因表达水平。结果:分别从冰冻切片中捕获子宫内膜腺管上皮细胞及子宫内膜癌细胞各50000Shootings。对照实验Ⅰ、Ⅱ证实经LCM后RNA完整性较好。确定了LCMShooting次数与可获得RNA量间对应关系。捕获细胞所提取的RNA中βactin基因表达完整。结论:通过LCM技术可以从冰冻切片中捕获单一类型的目的细胞,此过程不会造成细胞RNA明显降解,可以应用于下游的实验研究。     

显微切割结合RNA线性扩增技术的应用

背景与目的：当对无间质细胞混杂的肿瘤细胞进行选择性分析时,显微切割技术是不可缺少的,然而,从显微切割所得的细胞中获取足够RNA量相当困难,本文的目的是寻找-特异方法,将鼻咽癌细胞从肿瘤间质细胞中分离出来,并对其扩增,以备进一步研究。方法：采用显微切割技术从鼻咽癌组织冰冻切片中获取鼻咽癌细胞。提取RNA并对微量RNA进行体外转录,然后,用RT-PCR分别验证扩增RNA的β-actin和GADPH基因表达水平。结果：从鼻咽癌组织中获取了20000-40000个细胞,抽提RNA,扩增后获得了片段大小为0.5-2.5kb的RNA,在β-actin,GADPH表达完整,结论：显微切割结合RNA线性扩增技术能成功地获取较为单一的鼻咽癌细胞,扩增皇的RNA完整性较好,能运用于进一步研究中。     

人膀胱移行细胞癌复发相关基因的筛选

目的：应用基因芯片技术筛选人膀胱移行细胞癌复发相关基因。方法：使用人肿瘤基因表达谱芯片检测11例膀胱移行细胞癌患者的正常膀胱粘膜组织、原发膀胱癌组织及复发膀胱癌组织的基因表达谱．筛选出在原发膀胱癌组织及复发膀胱癌组织中差异表达的基因，并用半定量RT—PCR对部分差异表达基因进行验证。结果：以正常膀胱粘膜组织为对照，11例膀胱肿瘤组织中有87个基因表达明显下调，102个基因表达明显上调．其中有15个基因的表达在原发膀胱癌组织及复发膀胱癌组织呈相反变化。结论：膀胱肿瘤与正常膀胱粘膜组织之间存在大量差异表达的基因，说明膀胱肿瘤的发生与发展是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致：在原发膀胱癌组织及复发膀胱癌组织中呈反向变化的15个基因可能与膀胱癌的复发有关。     

激光捕获显微切割和基因芯片技术用于肿瘤实质细胞转录组的构建

目的：联合应用激光捕获显微切割和基因芯片技术构建纯化肿瘤实质细胞转录组。方法：应用激光捕获显微切割技术从肿瘤组织冰冻切片中获取纯化肿瘤实质细胞，提取RNA并对其进行线性扩增得到aRNA，合成cRNA探针后与全基因组基因芯片Affymetrix HG—U133．Plus 2．0 Gene—Chip杂交构建全基因组表达谱。结果：从5例结肠癌组织样本中各获取了3mm。细胞，抽提获得RNA118．4～300．3ng，混合后取100ng进行线性扩增获得aRNA 7ug。基因芯片各项质控标准符合基因表达谱芯片操作指南，共有18205条转录本表达，代表15276个基因。结论：联合应用激光捕获显微切割和全基因组基因芯片技术可构建纯化肿瘤实质细胞转录组。     

吉西他滨对膀胱癌细胞系增殖、细胞周期、凋亡的影响

背景与目的：吉西他滨（gemcitabine，GEM）单药或与顺铂合用在晚期膀胱癌治疗中显示了较高的反应率，已成为晚期膀胱癌化疗的一线药物，然而其在膀胱癌效应机制方面的研究却不多见。本研究探讨占西他滨体外对人膀胱移行上皮癌细胞系增殖、细胞凋亡以及p53、Bax、Bcl-2和Caspase3基因表达的影响。方法：体外培养膀胱移行细胞癌细胞系BIU-87、5637、T24、EJ细胞，用MTT法检测吉西他滨对各类癌细胞生长抑制的影响，用流式细胞技术（碘化丙啶）检测吉西他滨对癌细胞周期影响，流式细胞仪Annexin—V法测定细胞凋亡率，流式免疫荧光检测用药前后p53、Bax、Bcl-2、和Caspase3基因表达变化。结果：吉西他滨对体外培养的膀胱移行细胞癌细胞系均有抑制作用，具有时间和浓度依赖性，低分化肿瘤和倍增时间短的细胞系对吉西他滨敏感性高。吉西他滨1μg/ml作用5637和EJ细胞24h，导致细胞G1期83．94％与85．46％的阻滞；作用于5637细胞12、24和48h，凋亡率分别为4．8％、11．7％及23．3％。免疫荧光显示p53、Bcl-2表达没有显著性变化，而Bax、Caspase3却随吉西他滨作用时间延长表达升高。结论：吉西他滨对膀胱移行细胞癌具有抑制作用，细胞分化低、倍增时间短的癌细胞系对吉西他滨更敏感。吉西他滨阻滞细胞于G1，诱导Bax表达上调可能是产生膀胱癌细胞凋亡的原因之一。     

紫杉醇对人膀胱移行上皮细胞癌的体外作用

目的:观察紫杉醇对人膀胱移行上皮癌细胞系增殖、细胞凋亡以及p53、bax、bcl-2和caspase3基因表达的影响。方法:体外培养膀胱移行细胞癌细胞系BIU-87、5637、T24、EJ细胞;用MTT法检测紫杉醇对各种癌细胞生长抑制的影响;用流式细胞技术(碘化丙啶)检测紫杉醇对癌细胞周期影响;流式细胞仪Annexin-V法测定细胞凋亡率;流式免疫荧光检测用药前后p53、bax、bcl-2、和caspase3基因表达变化。结果:紫杉醇对体外培养的膀胱移行细胞癌细胞系均有抑制作用,具有时间和浓度依赖性;低分级肿瘤和倍增时间长的细胞系对紫杉醇敏感性高;紫杉醇作用5637和EJ细胞24小时,导致细胞G_2期71.29%与64.57%的阻滞;1μg/ml作用5637细胞12、24、48小时,凋亡率分别为5.0%、12.9%、及27.6%;免疫荧光显示p53、bcl-2表达没有显著性变化,而bax、caspase3却随紫杉醇时间延长表达升高。结论:紫杉醇对膀胱移行细胞癌具有抑制作用,细胞分级低、倍增时间长的癌细胞系对紫杉醇更敏感。紫杉醇阻滞细胞于G_2/M,诱导bax表达上调可能是产生膀胱癌细胞凋亡的原因。     

膀胱移行细胞癌胞核DNA含量测定及临床意义

应用显微分光光度计检测膀耽正常粘膜、膀胱乳头状瘤及膀胱移行细胞癌共23倒(正常粘膜3例、乳头状瘤5例及移行细胞癌15例,移行细胞癌分三级,Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ各5例),其结果显示,正常粘膜上皮细胞和乳头状瘤细胞核及移行细胞癌细胞核Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各组之间胞核DNA含量均值有显著的差别(P<0.05～0.01)。本文通过检测细胞核DNA含量的变化,作者认为对膀胱移行细胞癌的诊断、移行细胞癌分级及判断预后有参考价值。     

细胞黏附分子CD44v6对膀胱癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响

目的:探讨细胞黏附分子CD44v6对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响.方法:免疫细胞化学法检测正常膀胱移行上皮细胞和膀胱癌T24细胞中CD44v6蛋白的表达.用不同浓度的抗CD44v6单克隆抗体封闭细胞24、48和72 h后,MTT法检测细胞的生长抑制率.FCM检测封闭前后细胞凋亡率,并通过免疫细胞化学法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平的变化;Transwell小室检测细胞迁移特性的变化.结果:膀胱癌T24细胞表达CD44v6蛋白,而正常膀胱移行上皮细胞几乎不表达.MTT法检测结果显示,抗CD44v6单克隆抗体可抑制T24细胞的生长(P＜0.01).抗CD44v6单克隆抗体能增加T24细胞的凋亡率(P＜0.01),并且Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增加(P＜0.01).抗CD44v6单克隆抗体封闭后T24细胞的迁移能力受到抑制,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:抗CD44v6单克隆抗体封闭可以抑制膀胱癌细胞的增殖及迁移能力,同时诱导膀胱癌细胞凋亡,其机制可能与Bcl-2和Bax基因表达水平变化有关.     

PTEN与FHIT在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义

目的：探讨PTEN与FHIT在膀胱移行细胞癌（bladder transitional cell carcinoma,BTCC）组织中的表达及其临床意义。方法：应用免疫组化技术（SP法）检测62例膀胱移行细胞癌和13例正常膀胱黏膜标本中PTEN与FHIT蛋白的表达情况。结果：PTEN、FHIT蛋白在BTCC表达率分别为56.5%和51.6%,明显低于二者在正常膀胱黏膜中的表达,差异有统计学意义（P〈0.05）;在BTCC中PTEN与FHIT蛋白表达均与肿瘤病理分级和分期密切相关（P〈0.05）,在BTCC标本中PTEN蛋白表达与FHIT蛋白表达呈正相关（r=0.448,P〈0.05）。结论：PTEN、FHIT在BTCC的发生、发展中发挥了重要作用。PTEN、FHIT联合检测可作为预测BTCC生物学行为和预后判断的重要指标。     

腺性膀胱炎及膀胱移行细胞癌中MMAC1的表达及意义

[目的]研究MMAC1在腺性膀胱炎和膀胱移行细胞癌中的表达，探讨其与肿瘤发生、发展的关系。[方法]采用免疫组化方法测定20例腺性膀胱炎和40例膀胱移行细胞癌标本中的MMAC1蛋白的表达，以10例正常膀胱黏膜作为对照。[结果]正常膀胱黏膜中MMAC1的阳性表达率高于腺性膀胱炎和膀胱移行细胞癌，MMAC1表达缺失与膀胱移行细胞癌病理分级、临床分期明显相关。[结论]MMAC1表达缺失可能与膀胱移行细胞癌的发生、发展有关，检测MMAC1的表达将有助于评估膀胱移行细胞癌的恶性程度及预后。     

MDR1/P-Glycoprotein Overexpression in Bladder Transitional Cell Carcinoma and its Correlation with Expression of Survivin and Fas

Bladder transitional cell carcinomas (BTCC) are the most com- mon urologic tumors in China and the sixth most common ma- lignancy in developed countries.[1] One characteristic feature of BTCC is the high recurrence incidence which is about 75-80% after op…     

COX-2与VEGF在膀胱尿路上皮癌中的表达及相互关系

目的：研究二型环氧化物酶（COX-2）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）在膀胱尿路上皮癌中的表达,探讨它们之间的相互关系及与膀胱癌病理分级的关系和临床意义。方法：应用免疫组化方法检测COX-2、VEGF在68例膀胱尿路上皮癌及13例膀胱正常粘膜中的表达,分析它们的表达情况与膀胱尿路上皮癌病理分级及是否浸润的关系、以及各指标之间的相互关系。结果：COX-2与VEGF在膀胱尿路上皮癌中均表达,COX-2的表达随着膀胱癌病理分级的上升而呈上升趋势（P〈0．05）,且两者之间存在明显的正相关性。结论：COX-2与VEGF在膀胱癌中均高表达,在其发生发展中起重要作用,有望为膀胱癌的靶向治疗提供新的途径。     

Differential gene expression profiling in aggressive bladder transitional cell carcinoma compared to the adjacent microscopically normal urothelium by microdissection-SMART cDNA PCR-SSH

Identifying novel and known genes that are differentially expressed in aggressive bladder transitional cell carcinoma (BTCC) has important implications in understanding the biology of bladder tumorigenesis and developing new diagnostic and therapeutic agents. In this study we identified the differential gene expression profiles comparing tumor to the adjacent microscopically normal mucosa by manual microdissection on frozen sections. The RNAs extracted from microdissected tissues were amplified by SMART cDNA PCR technology to generate forward subtractive cDNA library by suppressive subtractive hybridization (SSH). We obtained 376 positive clones, one hundred clones of aggressive BTCC subtracted cDNA library were selected at random and inserts were reamplified by PCR. After differential screening by reverse dot blotting, 73 positive clones, that contend inserts putatively upregulated in aggressive BTCC, were further analysed by DNA sequencing, GenBank and EST database searching. Sequencing results showed that 66 clones stand for 23 known genes and 7 clones for three new EST (Genbank number: DN236875, DN236874 and DN236873). In conclusion, microdissection-SMART cDNA PCR-SSH allowed for an efficient way to identify aggressive BTCC-specific differential expressed genes that may potentially be involved in the carcinogenesis and/or progression of aggressive BTCC. These differentially expressed genes may be of potential utility as therapeutic and diagnostic targets for aggressive BTCC.     

HER-2和MMP-2在膀胱移行上皮癌组织中的表达及意义

目的：探讨膀胱移行细胞癌（bladder transitional cell carcinoma,BTCC）组织中HER-2和MMP-2蛋白的表达、相关性及意义。方法：应用免疫组织化学链酶卵白素-过氧化物酶复合物（SP）方法,检测82例BTCC组织标本中HER-2和MMP-2蛋白的表达,并与10例正常膀胱组织进行对照研究。结果：82例BTCC组织中,HER-2蛋白的阳性表达率为51.2%,MMP-2阳性率70.7%;正常膀胱组织中未见HER-2和MMP-2蛋白阳性表达。HER-2和MMP-2蛋白的阳性表达随着BTCC的病理分级和临床分期的增高而增加（P〈0.05）;HER-2和MMP-2两者在BTCC组织的表达存在正相关（P〈0.05）。结论：HER-2与MMP-2在膀胱移行上皮癌组织中高表达,两者的表达密切相关,与促进癌浸润和转移有关,可能提示预后较差。     

紫铆因抑制膀胱癌细胞增殖的体内外研究

目的 观察紫铆因对膀胱移行细胞癌细胞BLS增殖的影响以及对膀胱癌裸鼠移植瘤生长的 影响。方法 不同浓度紫铆因处理细胞,四甲基偶氮唑蓝比色实验（MTT）及平板克隆形成实验观 察细胞增殖能力,流式细胞仪分析细胞周期,蛋白印迹检测核转录因子κB (NF-κB)p65核内表达及 细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化程度,并检测NF-κB下游靶基因细胞周期素D1（Cyclin D1）及环氧合酶-2（COX2）的表达。建立膀胱癌裸鼠皮下移植瘤,采用腹腔注射的给药途径,测 量移植瘤的体积和重量。结果 紫铆因抑制了膀胱癌细胞增殖并诱导G2/M期细胞周期阻滞。紫铆因 处理后NF-κB p65的核内表达及ERK1/2的磷酸化程度下降（P<0.05）,Cyclin D1及COX2基因表达下 调（P<0.05）,体内实验发现紫铆因治疗组较对照组皮下移植瘤的生长明显受抑制（P<0.05）。结 论 紫铆因具有抗膀胱癌细胞增殖作用,可能与其抑制ERK及NF-κB信号激活有关。     

Cyclin E和p27~(kip1)在膀胱移行细胞癌中的表达及其意义

目的　探讨CyclinE和p2 7kip1在膀胱移行细胞癌 (BTCC)中的表达 ,并评价其相关性和意义。方法　应用鼠抗人CyclinE和 p2 7kip1单克隆抗体对 65例BTCC和 12例正常粘膜进行免疫组化SP法染色。结果　CyclinE在BTCC中阳性表达率随着病理分级 (P <0 .0 5 )和临床分期 (P <0 .0 1)的升高而增高 ,有淋巴结转移组非常显著高于无淋巴结转移组 (P <0 .0 1) ;而p2 7kip1在BTCC中的阳性表达率随着临床分期和病理分级的增高而降低 (P <0 .0 5 ) ,有淋巴结转移组显著低于无淋巴结转移组 (P <0 .0 5 )。CyclinE和 p2 7kip1在BTCC中表达具有负相关性 (r =-0 .2 62 ,P <0 .0 5 )。结论　CyclinE对BTCC的分化、增殖、浸润和转移可能起促进作用 ;而p2 7kip1则对BTCC的分化、增殖、浸润和转移可能起抑制作用 :两者在细胞周期进展中的共同表达失调 ,可能是导致BTCC发生发展和向恶性表型转化的机制之一。