转基因大豆和玉米加工产品的双重精确定量PCR检测方法

在很多国家,转基因生物(GMOs)及其衍生产品必须标有精确的转基因含量.最近研究中,实时定量PCR技术广泛应用于转基因成分的检测.然而,转基因生物的实时定量PCR方法的精确度仍然是一个难以解决的问题,尤其是对于高温处理过的样品.为了更好地准确定量高温处理样品中转基因的含量,对普通的实时定量PCR体系做了一些改进,包括重新设计内源基因和外源基因的引物,使得扩增较短并且大小接近的目标DNA片段,同时引物的GC含量和溶解温度也都相近.此外,采用热处理加工模型(HTPM)的方法,制备了含有转基因大豆GTS 40-3-2的样品,并验证了改进后的实时定量PCR系统.实验结果表明:使用改进后的实时定量PCR体系测定热处理过的样品,发现其中的转基因含量的定量偏差明显降低.同时使用改进的双重实时定量PCR进一步验证转基因大豆的加工食品,结果也显示,转基因含量的定量结果更准确.这些结果表明:改进的双重实时定量PCR将适用于热加工产品的定量检测.     

快速检测小麦和玉米中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇

采用DON快速检测试纸条检测小麦和玉米样品,并对检测过程进行了优化,最后采用ELISA试剂盒进行比较和分析.结果发现14号和15号小麦样品为阳性,其余样品均为阴性,两种方法的检测结果一致;样品的颗粒大小、水质、搅拌时间和静置时间等对试纸条的检测结果无明显影响,显示该试纸条适合现场快速筛查.     

Pygo2转基因小鼠模型的建立及表型的初步分析

主要通过建立Pygo2转基因小鼠的模型对其表型进行初步分析.首先构建K14-2×flag-Pygo的转基因构件,经酶切、纯化后构建Pygo2转基因小鼠.出生后的仔鼠用PCR和Western方法检测基因型,并通过进一步的免疫组化验证Pygo2基因的表达.PCR检测获得7只转基因阳性鼠,6只Western检测为阳性.对转基因小鼠子代的胚胎和成体进行免疫组化证明,Pygo2基因在皮肤和乳腺组织中有过量表达.转基因小鼠的皮肤、乳腺以及鼠尾椎骨等组织出现了异常的表型.乳腺中有肿瘤组织的形成,且Pygo2在肿瘤中有大量表达.该模型的成功建立为进一步研究Pygo2的功能奠定了基础.     

SNF1A转基因果蝇的构建

将质粒GH12596中的果蝇SNF1A cDNA用PCR方法扩增，并与pEGFP-N2质粒中的荧光蛋白CFP编码序列连接入果绳转基因载体pUAST上，构建了UAS-SNF1A-GFP质粒，转入果蝇细胞内，利用mini-white标记基因筛选，得到3个独立的转基因果蝇品系，将这些转基因果蝇品系分别定位平衡，并用单果蝇PCR方法加以佐证，然后将转基因品系分别与eyGAL4，actin-GAL4,pGMR-GAL4等3个GAL4果蝇品系交配，在荧光显微镜下检测到该基因在果蝇中的表达，从而确认了用显微注射技术能够得到稳定的转基因果蝇模型，为开展用果蝇GAL4-UAS系统大规模研究基因功能奠定了基础。     

转AlNHX1基因大豆后代遗传稳定性及耐盐性分析

为了获得耐盐性有所提高的转AlNHX1基因大豆后代材料,以已获得的转AlNHX1基因的6个株系中的3个株系后代为研究对象,通过分别对这3个株系转基因大豆各后代进行PCR分子检测并结合耐盐性鉴定,以分析外源基因在转基因大豆中遗传稳定性和耐盐性.结果表明:AlNHX1基因在转基因植株的后代中遗传;选取3个株系中部分阳性植株做耐盐性检测,结果表明:转基因大豆耐盐性状均好于野生型大豆.在150mmol/L NaCl胁迫下,转基因大豆叶片中维持了相对较高的K+/Na+比值,相对含水量较野生型提高了9%,而渗透势降低了39%,表明转基因大豆具有较好的吸水和保水能力;在盐胁迫下,超氧化物歧化酶(SOD)与过氧化物酶(POD)活性较野生型大豆分别提高了45%与69%.综上,通过耐盐筛选获得的转AlNHX1基因大豆具有较强的耐盐性.     

种植密度对抗虫转基因杂草稻分离后代适合度的影响

杂草稻是栽培稻田中的同种杂草,栽培稻基因通过天然杂交逃逸到杂草稻群体难以避免,但转基因的适合度效应决定其逃逸后能否在杂草稻群体中扩散.为了评估抗虫转基因(Bt/CpTI)的适合度效应,本实验以一个转基因栽培稻品系和两个杂草稻群体的杂交F2代为材料,对含有转基因和不含转基因的F2代群体田间表现进行了分析.结果表明,在自然高虫压环境中,含有抗虫转基因F2代群体的田间表现显著好于不含转基因F2代群体的表现.此外,含有转基因的和不含转基因的F2群体在田间混种时,在15cm×15cm混种密度下群体的表现明显差于20cm×20cm混种密度下的表现,表明存在竞争效应.含有转基因的F2群体在竞争条件下比不含转基因的F2群体有更多性状表现出优势.上述发现对转基因逃逸所带来的生态影响评估提供有价值的参考.     

2010年八师品比试验棉花品系性状差异及聚类分析

对2010年八师品比试验参试的21个棉花品系和1个对照进行性状差异及聚类分析,性状差异表明,各参试品系生育期分为晚熟和中、早熟材料,株高除田苗1较矮外,其它品系差异不大,产量差异较大,其中有惠远2号和西部9号两个高产品系,其它综合性状也较好,同时也筛选出产量较低的品系,有万氏472、天昆T10、万氏607。聚类分析表明,所选品系被分为了两大类,主要是依据各品系的生长势和产量进行分类,其结果与性状差异和产量分析结果基本一致,说明聚类分析是一种比较直观的分析方法,同时指出如果能结合分子技术,在DNA水平上进行聚类分析,结果可能更准确。     

植物性转基因食品的检测与验证方法

根据转基因农作物中最常用的花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列，设计并合成了两对不同的引物，建立了PCR-酶切分析-Southern杂交检测并确认转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法．并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等实物样品进行了检测，发现13份样品中有6份检出35S启动子和NOS终止子，7份样品结果为阴性．结果表明建立的检测与验证方法能有效检出转基因作物及其食品中的35S启动子和NOS终止子，具有灵敏度高、特异性好和结果准确的特点，可应用于进出境产品的转基因成分检测．     

小鼠转基因及传代研究

综述了湖北省农科院生物技术研究所近年来有关转基因小鼠的主要研究进展。应用原核注射技术 ,将POMT PGH、hDAF、pBHSA、pSHSA、PT HBV 1 3、Bcl xL、hCD5 9、hCD5 9+hMCP等 8种外源基因 ,注入并移植 4 874枚小鼠的受精卵 ,得到 5 5 6只小鼠 ;经PCR和Southern杂交检测 ,确认原代转基因小鼠 10 8只。基因整合率平均 19.4 % ,转基因效率平均 2 .2 %。应用混合注射的方法得到了转双基因小鼠 ,双基因共整合率 2 2 .2 %。表达外源蛋白的转基因小鼠在 5 0 %～ 10 0 %之间。研究了小鼠的超数排卵和影响转基因效率的几个因素。通过转Bcl xL小鼠与非转基因小鼠连续五个世代的传代交配和检测 ,研究了转基因小鼠外源基因的遗传规律 ,表明四只原代小鼠中 ,只有一只能稳定地将外源基因传递给后代。并非所有的转基因小鼠都具有遗传的稳定性 ,欲建立小鼠的转基因品系 ,尚需对原代转基因小鼠进行筛选。     

转基因花卉的DNA提取与多重PCR分析

分别以CTAB法、DNA提取试剂盒提取菊花、矮牵牛、非洲菊3种花卉的基因组DNA，凝胶电泳结果表明试剂盒提取的效果较好。设计合成了3对引物，分别扩增花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus,CaMV)35S启动子、根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因（nos）终止子、大肠杆菌K12菌株新霉素磷酸转移酶Ⅱ(nptⅡ）基因。普通PCR检测结果表明，3种花卉6个样品中仅矮牵牛的1个样品含有这3种转基因成分，酶切鉴定结果验证了PCR产物为非假阳性。尝试以多重PCR同时检测转基因矮牵牛与对照阳性质粒中的2个或3个转基因成分，得到预期结果。     

灰色关联分析在大豆育种中的应用研究

采用灰色关联分析的方法,研究了35个大豆品系的24个农艺性状与单株产量之间的关系.结果表明,英粒重、株重、总英数、总粒数、3粒英数等性状与单株产量关联度较高,而与株高等则较低,此结果可做为大豆育种性状选择的参考依据.通过本研究可为大豆育种高产品种的选择提供理论参考.     

溴氰菊酯胁迫下小菜蛾差异表达基因的筛选与分析

通过双向cDNA RDA,即分别以敏感品系为检测子(tester)、抗溴氰菊酯品系为驱赶子(driver)和以抗溴氰菊酯品系为检测子(tester)、敏感品系为驱赶子(driver)筛选2种品系中的差异表达基因,初步分析小菜蛾敏感品系和抗性品系之间的遗传差异.经过3轮消减杂交后,将所得的差异片段克隆于PMD 18-T载体,氨苄筛选阳性克隆,经菌落PCR鉴定后送样测序.得到2条序列与GenBank数据库中的部分已知序列有一定同源性,其中1条序列与编码S3a蛋白基因有较高的同源性.     

硼、锰对大豆主要农艺性状的影响

以2个大豆品种浙春3号和1601为材料,研究了不同硼、锰营养水平下大豆的农艺性状在2个生育期(三叶期和盛花期)的变化以及硼、锰对大豆相关产量性状的影响.结果表明:适量地施硼或锰,促进了大豆株高、叶面积、地上部分生物量和比叶重的增长,增加了大豆的单株粒数、单株荚数、单株粒重和百粒重,提高了大豆的产量;而硼或锰的缺失或过量对大豆均会产生不利的影响.从总体上看,适量硼的作用大于适量锰;适量的硼锰同施对大豆生长最好.2个品种比较,浙春3号抗硼锰丰缺胁迫的能力大于1601.     

基于顶空固相微萃取GC-MS分析不同蜂蜜的挥发性成分

不同品种蜂蜜经顶空-固相微萃取(HS-SPME),萃取得到的样品经气相色谱-质谱(GC-MS)分析确认得到蜂蜜中挥发成分种类.以糖浆作为蜂蜜模拟物,通过在其中添加不同量的苯甲醛建立HS-SPME GC-MS标准工作曲线.结果表明,定量模型苯甲醛的线性范围为0.022 4～0.224μg·g-1,r2=0.995 6,测定方法的相对标准偏差(RSD)为5.45%;采用质谱谱库检索结合文献资料定性确认7种不同品种蜂蜜挥发性成分,得到了135个组分信息,其中7种蜂蜜中共有的化合物仅有44种,其中主要成分脱氢芳樟醇的含量为6.86×10-3～1 222.7×10-3μg·g-1,不同品种的挥发成分及同一蜂蜜样品中的不同结构特征的挥发成分相对含量差别较大.     

Fibrillin转基因油菜的再生及其光合特性的检测

用根癌农杆菌共培养法，以带有1～2 mm子叶柄的完整子叶为转化受体，将连有35S启动子和NPTⅡ标记基因的Fibrillin cDNA导入甘蓝型油菜主要栽培品种“2005南系”中，获得抗卡那霉素的转基因植株.对部分经卡那霉素筛选得到的再生植株进行PCR检测，有来自3个株系的植株表现为阳性，初步证实外源基因已整合到植物细胞基因组中.将转基因植株炼苗后移入大田，在3月初到4月末油菜开花结果期间，对叶片和角果进行光合指标和叶绿素荧光指标的检测以及产量性状分析，发现转基因植株和非转基因植株之间存在明显差异.     

多重荧光PCR同时检测转基因成分35S和Nos方法的建立

根据商品化转基因作物中常用的花郴花花叶病毒启动子（CaMV35S）和根癌农杆菌终止（Nos）的序列特点，设计并合成了两对引物和相对应的荧光双链探针，建立一种应用荧光双链探针的多重荧光PCR同时检测转基因成分35S启动子和Nos终止子的方法，并利用该方法对马铃薯、大豆、玉米、甜椒、番茄等11份实物样品进行了检测，其中有5份样品结果阳性，结果表明所建立的多重荧光PCR方法能同时检测了35S方法同时检测出35S和Nos双组分，较常规PCR技术更为简便、快速、准确，有很很好的应用前景。     

TaqMan MGB实时荧光PCR对转基因大豆定量检测的研究

 利用实时荧光定量PCR技术,根据转基因大豆（Roundup Ready^TM）的外源基因35S启动子序列设计引物和TaqMan MGB探针,对大豆粉中Roundup Ready^TM大豆含量进行了定量检测,根据这个检测体系建立了35S启动子Ct值与样品中转基因成分数量之间的标准曲线和线性回归方程(相关系数r²: 0.9942)。本研究设计的方法还可以应用到多组分的食品、饲料等加工产品,检测转基因成分的含量,并可作为转基因食品常规PCR定性检测方法。     

转SOD基因烟草的光合特性初探

 以转基因Fe-SOD,Mn-SOD高表达、转基因Mn-SOD反义低表达烟草及非转基因品系为供试材料,比较CO₂光强对烟草光合作用和蒸腾作用的影响及不同叶位叶片的光合差异.在相同条件下,Mn-SOD高表达烟草CO₂补偿点最高(105μmol·mol^-1),Mn-SOD低表达烟草最低(78μmol·mol^-1),CO₂浓度对非转基因烟草蒸腾作用的影响比对其他三个转基因品系的影响要强.Mn-SOD低表达烟草的光补偿点最高(45μmol·m^-2·s^-1),而Mn-SOD高表达烟草最低(25μmol·m^-2·s^-1),并且强光对非转基因烟草的光合作用抑制大,转基因品系对强光具有较强的耐受力.同一叶位叶片,转基因烟草的光合速率、蒸腾速率更强.但转基因SOD高表达烟草在整体上并没有表现出明显的光合作用优势.     

转基因烟草CMV-CP定性标准样品的研制

讨论了研制实验室检测用转基因烟草CMV-CP品系定性标准样品,并获得了国家标准样品证书.研制内容包括标准样品的制备、最小取样量、均匀性和稳定性评价.首次采用G-S指数法评价定性标准样品的均匀性及最小取样量,确定了该批样品最小取样量为80mg,此取样量下该批样品均匀性符合标准样品制备的要求.相比传统方法,此种方法使定性标准样品的均匀性评价更具科学性、可靠性.     

3个茶树品种(品系)鲜叶香气特征及萜烯指数分析

运用顶空固相微萃取-气质联用法分析福鼎大白茶、黔茶1号、黔茶8号茶树鲜叶的挥发性香气物质.结果表明:共检测到73种不同的挥发性芳香物质,其中福鼎大白茶44种,黔茶1号35种,黔茶8号50种,共有香气成分17种,占全部香气物质的百分比达到90%以上.芳樟醇及其氧化物、香叶醇、青叶醇、乙酸叶醇酯、水杨酸甲酯和己醛在3个茶树品种(品系)鲜叶中含量较为丰富,共同作用形成茶树鲜叶清香;芳樟醇、香叶醇、4-戊烯醛、青叶醛、壬醛、乙酸叶醇酯、水杨酸甲酯等物质在3个茶树品种(品系)间含量差异较大,可作为关键香气物质进行茶树品种的鉴定区分.3个茶树品种(品系)的萜烯指数为福鼎大白茶(0.73)、黔茶8号(0.65)、黔茶1号(0.89),黔茶1号萜烯指数接近野生大树茶,说明筛选出黔茶1号的湄潭苔茶群体品种是较为原始的茶树资源.