新生隐球菌COP9复合体基因CSN6的敲除与鉴定

目的构建新生隐球菌COP9复合体蛋白元件Csn6的基因同源重组敲除框,并通过基因枪转化系统敲除CSN6基因。方法应用生物信息学方法获得COP9复合体蛋白元件的基因信息,采用套叠PCR的方法,构建包含报告基因NEO和CSN6基因ORF两侧上下游同源DNA片段的同源重组框。应用基因枪将其转化入新生隐球菌感受态细胞,通过PCR和DNA测序对遗传霉素(G418)耐受的阳性克隆子进行筛选与验证。结果成功构建了新生隐球菌基因突变株csn6裣。结论 COP9复合体亚基CSN6基因突变株的构建,为今后新生隐球菌COP9复合体的分子致病机制研究奠定基础。     

新生隐球菌转录共激活因子MBF1基因的鉴定与敲除

目的构建新生隐球菌转录共激活因子MBF1基因缺陷菌株。方法采用套叠PCR方法 ,构建含有抗性基因NEO以及靶基因上下游同源DNA片段的基因敲除框,通过基因枪将重组片段转化入新生隐球菌,应用PCR筛选和DNA序列测序方法对基因突变株进行鉴定与验证。结果成功构建了新生隐球菌基因突变株mbf1裣。结论通过基因突变株mbf1裣的构建,为深入研究新生隐球菌转录辅助因子Mbf1的功能机制奠定基础。     

格特隐球菌HOG1基因的敲除及重建

目的 构建格特隐球菌HOG1基因缺陷株和HOG1基因重建株.方法 从格特隐球菌基因组扩增HOG1基因,通过部分基因缺失方法,获得缺陷基因dHOG1.将获得的HOG1基因及其缺陷基因dHOG1分别亚克隆到真核表达载体pGAPzα-A,构建pGAPzα-HOG1及pGAPzcα-dHOG1质粒.将pGAPzα-dHOG1质粒转染隐球菌原始株,通过筛选获得HOG1基因缺陷菌株;同样方法将pGAPzα-HOG1质粒转染格特隐球菌HOGI基因敲除菌株,获得HOGI基因重建株.结果 RTPCR结果示:格特隐球菌HOG1基因缺陷株不转录表达完整的HOG1基因,而HOG1基因重建株可以转录表达完整的HOG1基因片段.结论 成功获得格特隐球菌HOG1缺陷株和HOG1基因重建株,为后续格特隐球菌毒力和致病机制的研究奠定了基础.     

基因编辑技术在新生隐球菌研究中的进展

<正>新生隐球菌(Cryptococcus neoformans,C.neoformans)是一种广泛分布于土壤、鸽粪等自然环境中的机会性致病酵母菌,在易感患者中可引起危及生命的脑膜脑炎,病死率和致残率高^[1]。全球每年约有近25万例新生隐球菌感染病例,其中约18.1万人死亡^[2]。近20年来,我国的隐球菌病的发病率呈上升趋势^[3],但是隐球菌病的治疗药物种类有限,     

新生隐球菌荚膜研究现状

新生隐球菌是一种专性需氧条件致病菌,它的细胞壁外包绕着一个多糖荚膜,是其主要毒性因子之一。荚膜主要包含两种多糖-葡萄糖醛酸木糖和半乳糖甘露聚糖,此外还有少部分的甘露糖蛋白。这些多糖分子除构成多糖荚膜外,同时也参与新生隐球菌与宿主之间的免疫反应。该文对新生隐球菌荚膜的结构、生物合成、免疫反应及针对荚膜的抗真菌治疗等方面作一综述,旨在为新生隐球菌相关疾病的研究提供新的思路。     

树突细胞与新生隐球菌

新生隐球菌( Cn) 是临床上重要的病原真菌, 树突细胞( DC) 则是最重要的抗原呈递细胞。作为宿主固有免疫和适应性免疫的联系枢纽,DC 对于识别病原、呈递抗原、诱导宿主免疫应答十分重要。许多研究证明,DC 可通过细胞表面的多种受体有效识别新生隐球菌抗原( CnAg) , 诱导宿主产生有效的细胞免疫应答。DC 本身也有一定的杀菌能力, 但DC 的不同亚群以及成熟状态对宿主的免疫防御功能有重要影响。另外, 隐球菌除具有甘露糖蛋白等主要免疫显性抗原外, 还有多种抑制机体保护性免疫应答的毒性因子。本文就近年来国内、外对两者之间复杂机制的研究进行概述。     

获得性免疫缺陷综合征患者的新生隐球菌基因多态性研究

本文旨在调查2003 年1 月― 2007 年12 月分离自上海地区获得性免疫缺陷综合征( AIDS) 患者的新生隐球菌临床株的配型及基因型分布特征, 为隐球菌病的诊疗提供科学依据。首先以M13 为单引物对模板DNA 进行聚合酶链反应( PCR) 扩增, 参照标准株指纹图将临床株鉴定至基因型; 同时对12 株来自AIDS 患者的新生隐球菌临床株的内转录间隔区( ITS) 基因进行PCR 扩增、序列分析, 以CLUSTAL W1. 83 软件多重比对分析ITS序列的差别,MEGA3. 1 软件处理数据, NJ 法绘制系统进化树, Bootstrapping 法对系统进化树结果进行统计学检验, 区分新生隐球菌格鲁比变种、新生变种及格特变种菌株; 最后选用特异性引物PCR 特异性扩增相关基因, 鉴定α和a 配型。结果显示, 分离自上海地区的12 株隐球菌临床株中, 9 株( 75% ) 为VNⅠ基因型/ α配型菌株,3 株( 25%) 为VNⅡ基因型/ α配型菌株, 且ITS基因序列分析可将各临床株鉴定至变种水平。本研究提示, 分离自上海地区AIDS患者的新生隐球菌临床株存在一定的遗传多态性, 以VNⅠ基因型/ α配型菌株为主, 有少量VNⅡ基因型/ α配型菌株。     

天然免疫系统与新生隐球菌感染

天然免疫系统是宿主免疫防御体系中对抗微生物侵染的第一道屏障。天然免疫细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别外源微生物及其成分,其中NOD样受体(NOD like receptors,NLRs)是定位于细胞内的一类PRRs。NLRP1、NLRP3和NLRC4等NLRs家族成员可以形成叫做炎症小体的分子复合体,介导炎症因子IL-1β和IL-18的成熟。目前已经确定多种炎症小体参与抗真菌的免疫反应。新生隐球菌是一种重要的条件性致病真菌,该菌主要感染AIDS等免疫缺陷患者,感染死亡率很高。目前,人们对天然免疫系统抗新生隐球菌的机制有了一定的了解。该文将对宿主抗新生隐球菌的天然免疫机制进行总结。     

新生隐球菌的AFLP分析

目的评估AFLP-DNA指纹技术在新生隐球菌分类中应用情况。方法新生隐球菌基因组DNA用双酶酶切,双链接头连于其酶切末端,用与接头和酶切位点互补的引物扩增DNA片段,其产物在高分辨的变性聚丙酰胺凝胶上电泳分离,然后进行银染。结果分析来自5种血清型和临床分离株的18株新生隐球菌,可见有30多条大小在30～500bp的DNA-AFLP指纹,相同的血清型有不同的指纹图谱,来自同一患者不同病期的两株分离株和来自同一患者患者的不同部位的两株分离株都显示出相同的带型。结论显示了AFLP的高分辨率,是适用于新生隐球菌流行病学调查的有力工具。     

新生隐球菌感染与细胞因子的相互关系

新生隐球菌是重要的条件致病真菌,可导致免疫抑制患者产生致命的新生隐球菌性脑膜炎;继而在脑部损伤部位有多种细胞因子的表达和炎症细胞的浸润,形成了一个细胞因子网络,介导一系列致病机制和防御机制的产生。为明确细胞因子与新生隐球菌在致病和防御过程中的相互作用,本文就新生隐球菌与细胞因子的关系进行综述。     

新生隐球菌细胞通讯研究进展

细胞通讯系统调控多细胞生物的细胞增殖与分化等多种基础生物学过程,也是调控单细胞生物群体或社会性行为的重要策略。新生隐球菌是一种重要的环境来源病原真菌,主要感染免疫缺陷人群,具有很高的致死率。作为环境致病真菌,新生隐球菌进化出丰富的环境适应性策略。新生隐球菌细胞呈现出高度的异质性和社会性,不同形态的细胞承载着不同生物学功能和病原学特征。越来越多的研究表明,通过细胞通讯系统调控其群体或社会性行为,既是新生隐球菌适应多变的外界环境和宿主环境的关键策略,也与其致病能力密切相关。本文介绍新生隐球菌中细胞通讯系统的研究进展及其在有性生殖、细胞形态转换、适应环境及宿主压力等社会性行为中的调控作用。     

新生隐球菌毒性因子研究进展

新生隐球菌为环境中的真菌,是引起免疫损伤患者脑膜脑炎的主要病原体。新生隐球菌有毒株能够快速适应宿主环境的诸多变化,改变基因/蛋白的表达,利用多种策略在宿主防御和治疗药物的压力下可塑性地适应和生存,并在宿主不同的组织器官中顽强生存,某些免疫系统完好的宿主也不能幸免。新生隐球菌应用伪装躲避识别、逃避固有免疫和适应性免疫应答、改变细胞内转运等手段使病原体穿越天然屏障在脑中生长/持续感染。了解其中的毒性因子在持续感染中的作用,有助于揭示新生隐球菌的致病机理。     

STE12α基因对新生隐球菌形态学影响的初步研究

目的研究STE12α基因对新生隐球菌形态学的影响。方法分别敲除血清A型和血清B型新生隐球菌菌株的STE12α基因,建立缺陷株,再将STE12α基因重新导入建立重建株。观察并比较野生株、STE12α基因缺陷株及重建株在体内、外孵育后菌落和菌落的形态学差异。结果 STE12α基因缺陷株组形成的菌落明显偏少,菌株直径偏小,荚膜发育不良,而重构株组这些方面的改变都得到了恢复。结论 STE12α基因对新生隐球菌的形态学改变有着重要的影响,可能直接影响其毒力。     

绿色荧光蛋白GFP基因与新生隐球菌荚膜基因的融合表达系统

目的构建新生隐球菌荚膜基因与绿色荧光蛋白的融合表达系统。方法PCR法扩增CAP60基因片段,测序验证其准确性。将其与多个必需基因共同连人穿梭质粒。结果获得6150bps大小的质粒,该质粒含有荚膜基因启动子、终止子及荧光蛋白的基因。结论将新生隐球菌荚膜基因与荧光蛋白基因融合表达,将会有利于对荚膜的生化合成途径作进一步研究。     

新生隐球菌RBP1基因克隆与功能分析

新生隐球菌是自然界广泛存在的具荚膜的酵母型病原真菌,能侵染人类中枢神经系统引起真菌性脑膜炎,每年导致全球大约18万人死亡。本研究在前期隐球菌交配表达谱的基础上,选择一上调表达的RNA结合蛋白基因（CNAG_04772）,进行克隆和功能分析。结果表明该基因全长2 247bp,cDNA全长1 518bp,编码505个氨基酸组成的蛋白,含有2个RNA识别基序RRM1和RRM2,命名为RBP1。基因表达模式分析表明RBP1在隐球菌酵母细胞、担子以及担孢子阶段都有表达,交配菌丝阶段不表达;亚细胞定位分析表明Rbp1蛋白定位于隐球菌的细胞核和细胞质中。与野生型菌株H99相比,敲除突变体菌株能够交配并产生双核菌丝,但丧失产生担孢子的能力,而互补菌株与野生型菌株H99间无显著差异。致病力测定结果显示,敲除突变体菌株致病性显著降低。     

转化生长因子对巨噬细胞抗新生隐球菌功能的影响

目的研究转化生长因子对巨噬细胞吞噬和杀伤新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)功能的影响。方法采用TGF-β干预体外活化巨噬细胞吞噬和杀伤实验,分别观察巨噬细胞吞噬率和巨噬细胞内隐球菌生长情况,采用Griess regent试剂盒检测巨噬细胞NO(Nitric oxide)生成量,并比较TGF-β干预下巨噬细胞NO生成量变化。结果 TGF-β干预后巨噬细胞吞噬率下降了43.9%,差异有统计学意义(P0.05)。巨噬细胞在转化生长因子干预下NO生成量增加,胞内隐球菌负荷降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论体外细胞实验中,在TGF-β干预下活化巨噬细胞的趋化作用和吞噬能力受抑制,但巨噬细胞合成NO量增加,杀伤隐球菌能力增强。     

新生隐球菌通过血脑屏障的机制

隐球菌是一种机会致病性真菌,因其有嗜中枢特性,常导致隐球菌脑膜炎或脑膜脑炎,所以其穿过血脑屏障的机制长期受到关注。许多因素可以影响隐球菌穿越血脑屏障,如单核细胞、脑微血管内皮细胞、隐球菌荚膜、尿素酶及 CPS1基因等,该文就血脑屏障体外模型的研究进展及影响隐球菌通过血脑屏障的因素逐一详细介绍。     

新生隐球菌的荚膜多糖合成研究进展

新生隐球菌是一重要的致病真菌,其细胞壁外层的多糖荚膜是第1个被公认的新生隐球菌毒性因子。本文总结了在荚膜生理和生化合成方面的研究进展,介绍了研究新生隐球菌荚膜合成的常用方法以及在新生隐球菌的荚膜代谢途径、生化合成酶、分泌、组装和调节这些广泛的研究领域存在的许多未解决的问题。     

新生隐球菌交配型的研究进展

新生隐球菌是担子菌类的真菌病原体,有明确的有性周期,有性生殖过程由两条等位基因MATα和MATa控制。MAT编码的产物包括信息素和信息素受体,丝裂原活化蛋白激酶信号级联放大系统的组成部分,还有一些在有性周期中没有明确功能的蛋白,这些蛋白都是其他真菌相应蛋白的同系物。     

新生隐球菌通过血脑屏障的研究进展

隐球菌是一种机会感染性真菌,主要侵犯中枢神经系统,隐球菌脑膜炎约占隐球菌感染的80%,死亡率高。研究隐球菌如何侵袭血管内皮细胞,穿过血脑屏障,是揭示隐球菌嗜中枢性的关键。许多因素影响了隐球菌穿越脑血管内皮细胞,如隐球菌毒性因子降解酶、尿素酶使脑血管内皮细胞通透性增加,脑血管内皮细胞CD44分子、HIV-1gp41蛋白能提高隐球菌对大脑血脑屏障的侵入能力等。现就隐球菌通过血脑屏障的机制做一综述。