发芽燕麦酶解工艺条件的优化

利用燕麦发芽过程中形成的酶系进行燕麦自身的酶解,分别研究了酶解温度、pH和燕麦浓度对发芽燕麦酶解液中蛋白水解度和还原糖含量的影响。试验结果表明,发芽燕麦酶解液中蛋白酶的最适温度为50℃,最适pH为5.0,燕麦浓度为0.20 mg/mL;淀粉酶的最适温度为60℃,最适pH为5.5,燕麦浓度为0.20 mg/mL。在上述酶解条件的基础上,确定发芽燕麦酶解的优化工艺为:0.20 mg/mL的燕麦酶解液在50℃,pH 5.0的条件下酶解3 h后,将酶解温度升至60℃,pH调至5.5,继续酶解至7 h,酶解结束。此时燕麦酶解液中蛋白水解度和还原糖含量都基本达到最高值,分别为12.18%和34.0 mg/mL。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达及其酶解特性

研究枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因（BsCsn46）在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的高效表达、重组酶性质及其酶解特性。重组菌在5 L发酵罐高密度发酵后胞外酶活力高达50 370 U/mL,蛋白质量浓度15.7 mg/mL。粗酶经强阴离子交换层析纯化,纯酶比活力为4 065.7 U/mg,最适pH 6.0,最适温度55 ℃,在45 ℃以下保持稳定。该酶水解3 g/100 mL壳聚糖得到主产物为二糖、三糖和四糖的壳寡糖,水解率为92.8%,壳寡糖得率为90.9%。本研究的重组壳聚糖酶产酶水平和水解效率高,为工业化制备壳聚糖酶及大规模制备壳寡糖的应用提供了理论支持。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

β-葡聚糖提取过程中果胶类物质分解的研究

在碱法提取β-葡聚糖的过程中,酒精沉淀β-葡聚糖工艺中有大量果胶一同沉淀下来,降低了β-葡聚糖的纯度。实验采用添加果胶酶的方法除去果胶,以西藏青稞和燕麦为原料,经过碱法粗提β-葡聚糖,然后调节pH,加入果胶酶溶液,在一定温度下反应一段时间,反应液浓缩后经酒精沉淀,沉淀物即为较纯的β-葡聚糖。实验中研究了不同的pH、温度、酶加量以及反应时间对酶解β-葡聚糖中果胶的影响,确定了酶解果胶的最佳条件为pH3、温度为50℃、酶加量为120U/g、反应时间为5h。添加果胶酶使燕麦和青稞中β-葡聚糖的提取率分别从0.1%和0.2%提高到1.9%和2.2%。利用黏度法测得青稞中提取的β-葡聚糖分子量为1.8×104,燕麦中提取的β-葡聚糖分子量为2.1×104。     

黄曲霉产胞外β-1 ,3-1 ,4-葡聚糖酶的发酵条件优化

研究发现一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的黄曲霉菌株,优化了其产酶条件并考察了粗酶潜在的工业应用价值。依次采用单因素法和响应面分析法优化该菌发酵产酶条件,得到其优化产酶条件:麸皮19 g/L、磷酸氢二铵30g/L、吐温-60 21 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO_4·7H_2O 0. 5 g/L、KH_2PO_40. 75 g/L、培养基初始pH值8. 0、培养温度38℃、培养时间6d。在此条件下,黄曲霉能够分泌的最高胞外β-1, 3-1,4-葡聚糖酶酶活达155.9 U/mL。水解研究发现,该酶能高效降解大麦粉和燕麦粉中的β-葡聚糖,并直接生成葡萄糖。这些结果表明,黄曲霉能高效分泌β-1,3-1,4-葡聚糖酶,且该酶具有较强的工业应用前景。     

耐热β-1,3(4)-葡聚糖酶源真菌筛选、鉴定及产酶条件优化

利用葡聚糖作为唯一碳源的基础盐培养,在50℃培养条件下,从新乡周围土样及腐殖质中筛选到一株产β-1,3(4)-葡聚糖酶耐热真菌菌株(Paecilomycessp.FLH30)。该菌株在40～60℃能较好生长,最适生长温度45℃。产酶培养优化条件表明:在培养温度为45℃,初始培养基pH6.5,以大麦麸皮为碳源,以蛋白胨、酵母粉和玉米浆为有机氮源,发酵4d,葡聚糖酶活达132.4U/mL,葡聚糖酶最适pH和温度分别为7.0和70℃。     

β-葡聚糖提取过程中果胶类物质分解

在碱法提取β-葡聚糖过程中,酒精沉淀β-葡聚糖工艺中有大量果胶一同沉淀下来,降低β-葡聚糖纯度。该实验采用添加果胶酶方法除去果胶,实验以西藏青稞和燕麦为原料,经过碱法粗提β-葡聚糖,然后调节pH,加入果胶酶溶液,在一定温度下反应一段时间,反应液浓缩后经酒精沉淀,沉淀物即为较纯β-葡聚糖。实验中研究不同pH、温度、酶加量及反应时间对酶解β-葡聚糖中果胶影响,确定酶解果胶最佳条件为：pH=3；温度为50℃；酶加量为120 U/g；反应时间为5 h；添加果胶酶使燕麦和青稞中β-葡聚糖提取率分别从0．1%和0．2%提高到1．9%和2．2%；利用粘度法测得青稞中提取β-葡聚糖分子量为1．8×10~4,燕麦中提取β-葡聚糖分子量为2．1×10~4。     

小麦麸皮中β-葡聚糖的分离纯化及组成研究

以小麦麸皮为原料,碱法提取β-葡聚糖。采用硫酸铵沉淀法、DEAE Sepharose CL-6B阴离子交换柱层析法、Sepharose CL-4B凝胶过滤层析法对β-葡聚糖的粗提物进行逐步纯化,得到组分A1和A2。并经紫外分光光度法、高效凝胶渗透色谱法鉴定其纯度,最终获得相对分子质量为4.87×105(纯度为98.57%)的β-葡聚糖A1组分、6.13×104左右(纯度为97.03%)的A2组分。可见,经过一系列的纯化实验,可以获得纯度较高的β-葡聚糖单一组分。采用特异性β-葡聚糖酶对经阴离子交换柱层析获得的β-葡聚糖组分A进行水解,经高效液相色谱法分析其寡糖的组成。结果表明,特异性酶解后的β-葡聚糖组分A主要由麦芽三糖和麦芽四糖组成,除了含有少量葡萄糖外,还含有麦芽糖、麦芽五糖。     

基因突变提高毕赤酵母表达内切β-1,3-葡聚糖酶活性

为构建一株高效表达内切β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母菌株,并用于水解热凝胶生产β-1,3-葡寡糖。作者首先对哈茨木霉来源内切β-1,3-葡聚糖酶基因进行随机突变,并构建BGN13.1a突变库;然后采用高通量技术及刚果红平板筛选高表达菌株;最后采用TLC薄层色谱和MALDI-TOF MS分析热凝胶水解产物,并分析了酶学性质。结果表明,本研究成功筛选得到毕赤酵母突变株K827,酶活较初始菌株提高了25%;其水解产物聚合度为2～10,且寡糖产量为1.492 g/L;其最适pH与最适温度分别为5.5和50℃;相较亲本酶,突变株K827的pH稳定性与温度稳定性都有明显提高。本研究为内切β-1,3-葡聚糖酶的工业化生产及应用提供依据。     

黄曲霉产β-1,4-木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学特性

研究发现一株高产β-1,4-木聚糖酶的黄曲霉,拟优化其产酶条件并分析该酶的酶学特性。采用单因素法优化其摇瓶发酵条件,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合酶谱法判定酶的特性以及薄层色谱分析法(TLC)判定酶的水解特异性。结果表明,产酶最佳培养基为:麸皮3.5%、磷酸氢二铵3.0%、吐温-60 1.0%、NaCl 0.5%、MgSO₄·7H₂O 0.05%和KH₂PO₄ 0.075%;黄曲霉在35 ℃下培养5 d达到最高酶活力115.08 U/mL,为未优化时的9.4倍。该菌能分泌两种β-1,4-木聚糖酶,分子量约为20.1和31.0 kDa,均不同于已有报道。粗酶的最适pH和最适温度分别为MOPS 7.5和55 ℃,在pH5.5~9.0及30~50 ℃范围内能保持酶活力的稳定。该酶不仅能水解榉木木聚糖产生低聚木糖,还能微弱降解大麦葡聚糖,有助于它在木质纤维素降解领域中的应用。     

一种麦芽β-淀粉酶的纯化和特性研究

主要对一种麦芽中提取的β-淀粉酶进行特性的研究。纯 化研究发现,采用乙醇分级和Sephadex G—75相结合的 方法,可使酶的比活从389U/mg提高到1410U/mg,纯化 后酶的性质与原粗酶基本相似:最适温度都是50℃,最适 pH分别是5.8、5.6;高效液相色谱对粗酶水解产物分析, 水解产物里主要是麦芽糖,仅有少量的葡萄糖和少量麦 芽四糖或五糖,说明该麦芽β-淀粉酶酶系较纯。     

不同β-葡萄糖苷酶性能分析及对罗汉果苷的转化

以Pichia pastorisGS115为宿主,对来源于特异腐质霉Humicolainsolens、棘孢曲霉Aspergillus aculeatus和黑曲霉Aspergillus niger的β-葡萄糖苷酶基因bglHi、bglAa和bglAn进行异源表达。以对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,分析了3种酶的酶学性质,其中BglAn的酶活力最高,为90.83U/mg。3种酶的最适反应温度和最适pH值范围分别为55~65℃和5.0~6.0。在pH值为6.0、温度50℃、酶量2U的条件下,利用3种酶水解不同浓度的罗汉果苷Ⅴ。结果表明:不同来源的酶水解底物的特异性差别较大,其中BglHi和BglAa水解罗汉果苷Ⅴ生成罗汉果苷ⅢE的转化率较低,仅为5%~7%;而BglAn在底物质量浓度1mg/mL,反应20min时转化率为96.5%;提高底物质量浓度到5mg/mL,反应1h时转化率也可达97.9%,基本实现完全转化。通过酶法转化罗汉果苷Ⅴ,获得了较高纯度的产物罗汉果苷ⅢE,为后期开发不同结构、不同功能罗汉果苷类甜剂提供了新的途径。     

扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的分离和性质研究

以扇贝加工废弃物消化腺为原料,经磷酸缓冲液抽提、80%饱和度硫酸铵沉淀、DE52纤维素离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析等步骤,获得β-1,3葡聚糖酶.经SDS-PAGE检测,扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的相对分子质量为157kDa.β-1,3-葡聚糖酶水解木耳多糖(β-1,3-葡聚糖)的最适pH为7.0,最适温度为30℃.通过Lineweaver-Burk作图,得到其米氏常数Km为13mg/mL.     

高通量MBTH法测定β-葡聚糖酶的活力

本文建立了一种以3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)为氧化剂,以微孔板测定β-葡聚糖酶活力的新方法,该法特别适合于成分复杂的材料中痕量β-葡聚糖酶活力的测定。根据MBTH法测定β-葡聚糖酶解产物还原端基的特点,设计并优化了酶活力测定的关键参数。结果表明,在最适p H 5.0和30℃条件下测定β-葡聚糖酶活力,所得酶的工作浓度范围为0~12.3 m U/m L,饲料中酶的工作浓度范围均为0~2.94 U/g,本法测β-葡聚糖酶和四种饲料样品中酶的平均回收率分别为93.1%、97.5%、104.3%、97.0%、106.4%,β-葡聚糖酶活力检测限为0.37 m U/m L,定量限为1.24 m U/m L,四种饲料酶活力检测限分别为0.10 U/g、0.09 U/g、0.14 U/g、0.09 U/g,定量限分别为0.33 U/g、0.30 U/g、0.46 U/g、0.31 U/g。该法准确、低成本、省时、省力,特别是其灵敏度远高于DNS法,可极大程度上避开饲料中其它成分对测定的干扰。     

离子色谱-脉冲安培检测法测定酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露寡糖

建立了高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法分离测定酵母细胞壁中β-葡聚糖和甘露寡糖的方法。以NaOH为淋洗液,在CarboPac PA10阴离子交换柱上同时分离甘露糖醇、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、葡萄糖和甘露糖。样品中的低聚糖在优化的水解条件下水解得到葡萄糖和甘露糖,通过测定2种单糖的含量而得到β-葡聚糖和甘露寡糖的含量。这2种单糖即对应低聚糖的检出限(25μL进样,S/N=3)分别为0.4和0.5μg/L,且均具有较宽的线性范围(0.002~50mg/L),3个样品测定的相对标准偏差在0.3%~1.0%。该方法检测糖简便快捷、分离效果好、无需衍生、灵敏度高,适用于多种复杂样品中的低聚糖分析。     

产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用

将产黄青霉（Penicillium chrysogenum）来源的β-甘露聚糖酶（PcMan26A）在毕赤酵母中高效表达,经高密度发酵,发酵液酶活力达25 200 U/mL。该酶属于GH26家族,与黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶同源性最高（67.8%）,是一个新型β-甘露聚糖酶。PcMan26A的最适催化条件为pH 6.0和50?℃,在pH?4.0～8.0和45?℃下具有良好的稳定性。该酶对魔芋粉具有最高的比活力,为3?581.0?U/mg。进一步利用该酶水解魔芋粉得到魔芋甘露寡糖,产品得率为86.2%;经分析,其主要组分为聚合度大于4的甘露寡糖。该β-甘露聚糖酶适用于生产魔芋甘露寡糖,为魔芋甘露寡糖的酶法生产提供了更多的选择。     

芽枝霉菌Lcxs9产两种耐热β-葡萄糖苷酶的快速纯化及酶学特性研究

以高产β-葡萄糖苷酶的芽枝霉菌（Cladosporium cladosporioides）Lcxs9为研究对象,对其进行固态发酵,采用硫酸铵沉淀及强阴离子交换柱对其所产β-葡萄糖苷酶进行分离纯化,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测其分子质量,并研究其酶学性质。结果表明,快速纯化获得两种β-葡萄糖苷酶,分别命名为BG CC1和BG CC2,分子质量分别为41 kDa、53 kDa,比酶活力分别为8.6 U/mg、12.2 U/mg。两种酶都具有水解活性,可以水解纤维二糖得到葡萄糖;同时具有转苷活性,可以利用低分子质量的单糖合成纤维三糖和纤维四糖。两种酶的最适作用pH及温度均分别为6.0、60 ℃,均在pH 4～10和20～80 ℃条件下较稳定,Ag2+、Co2+、Cu2+、Hg2+对两种酶均有抑制作用,而Mn2+、Ca2+和Mg2+均有明显的激活作用,Zn2+和Ni+无明显影响。利用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）为底物,两种酶的动力学常数Km和最大反应速率（Vmax）均分别为2.76 mg/mL、20.6 U/mg。     

节杆菌β-1,3葡聚糖内切酶的分离纯化与特性研究

通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和柱层析从节杆菌（Arthrobacter sp．）粗酶制剂分离纯化得到β-1,3葡聚糖内切酶。经SDS凝胶电泳和柱层析测得纯化酶为单体酶,分子量为32．5kDa;纯化酶N末端的10个氨基酸序列为APGDLLWSDE,在pH5～8之间稳定,最适pH6．5,最适温度55℃,但50℃以上失活很快。纯化酶对昆布4,5,6,7糖及昆布多糖底物的米氏常数分别为0．12,0．11,0．067,0．066mM和0．16mg／mL,也可水解热凝胶和地衣多糖,葡糖苷内切酶H（Streptomyces griseus）不能分解它,证明该酶不含糖基。该酶属于糖基水解酶16族系。     

重组β-甘露聚糖酶制备低聚葡甘露糖工艺条件的优化

研究了利用自主构建的重组毕赤酵母菌株GS115/Auman26A所产β-甘露聚糖酶水解魔芋粉制备低聚葡甘露糖的工艺条件。以底物魔芋粉的水解率为指标,通过单因素试验确定酶法制备低聚葡甘露糖的酶解条件如下:加酶量60 U/g,酶解温度40℃,魔芋粉质量浓度30 g/L,酶解时间5 h。魔芋粉水解率和酶解液还原糖质量浓度分别为53.3%和10.45 mg/m L。超滤后的酶解产物经高效液相色谱检测可知组分主要以低聚葡甘露糖为主,其中还原性单糖占9.83%,二糖以上的低聚葡甘露糖占90.17%。     

β-甘露聚糖酶产生菌的筛选和酶学性质研究

从土壤中分离筛选出5株产胞外β-甘露聚糖酶的菌株,其中DK3菌株的摇瓶培养液的酶活力达3.85U/mL。该酶水解葡甘露聚糖的最适温度为37℃,最适pH为6.0,pH稳定范围为5.0～9.0,在低于40℃的温度下基本稳定。Fe2+、Cu2+、EDTA和NH4+对该酶有抑制作用,Na+则有激活作用。