Mincle受体蛋白克隆、原核表达与纯化

本研究通过应用基因工程技术,构建融合基因pET14b-Mincle的原核表达载体,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白Mincle,并对其表达产物进行纯化、鉴定、透析复性。采用RT-PCR技术扩增小鼠Mincle的基因片段,将其克隆于载体pMD18-T中,并克隆到带有His-tag的原核表达载体pET14b中;重组质粒经酶切鉴定、序列比对验证正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达目的蛋白。经1mmol/LIPTG在37℃下诱导5h获得了分子量约为22kDa的重组融合蛋白的优化表达,SDS-PAGE、Western Blot和ELISA证实了重组蛋白的特异性。Mincle以包涵体形式在宿主中表达,利用Ni2+亲和柱进行纯化和生物膜透析复性,纯化和透析后的蛋白经WesternBlot、ELISA法定性鉴别以及用白色念珠菌(SC5314)整个灭活细胞对复性后蛋白的活性测定,透析后的Mincle重组融合蛋白能与白色念珠菌的特异性结合体现其生物活性,表明获得了具有活性的蛋白,为后续研究打下基础。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶(catalase,CAT)。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx-HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

带有突变穿膜肽重组凋亡素可溶性表达的研究

目的构建apoptin（凋亡素）-HBDCK-pET28a突变体重组表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现高效可溶性表达,并观察突变后穿膜肽（CPP）在HeLa细胞中的转导活性。方法采用PCR介导突变方法将重组蛋白apoptin-HBD及EGFP-HBD的HBD结构域中的Cys（C）突变为Lys（K）。突变的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,Ni2＋-NTA亲和层析纯化目的蛋白,进一步观察HeLa细胞突变后HBD的转导活性。结果经双酶切鉴定和序列分析,突变后的重组质粒apoptin-HBDCK-pET28a及EGFP-HBDCK-pET28a构建正确。转化E.coli BL21（DE3）后,融合蛋白均获得可溶性表达。EGFP-HBDCK作用于HeLa细胞13 h后,可观察到细胞内强绿色荧光。结论 HBD结构域中C突变为K,可达到融合蛋白可溶性表达的目的,且仍能保持很强的转导活性,可携带EGFP蛋白进入HeLa细胞。     

藤黄微球菌过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的重组与表达

目的应用基因重组技术在大肠杆菌中高效表达藤黄微球菌过氧化氢酶（catalase,CAT）。方法从藤黄微球菌DNA中获得CAT编码基因,并应用pProEx．HTa质粒构建融合表达载体并表达和检测活性。结果通过融合表达获得可溶性带6×His标签重组蛋白,该蛋白经过Ni-NTA纯化后可获得活性物质。结论从大肠杆菌表达体系中表达了具有生物活性的CAT。     

兔血清对氧磷酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达纯化

利用RT-PCR扩增新西兰大白兔肝脏PON1编码区全长序列,克隆入表达载体pET32a中,构建了重组表达载体pET32a-PON1,转化大肠杆菌获得表达菌株.SDS-PAGE表明该重组表达蛋白具有部分可溶性,酶活测定结果显示该可溶性蛋白具有降解芳香酯酶和内酯酶的活性.该研究实现了兔血清对氧磷酶在大肠杆菌中的功能性表达,并获得了纯化的蛋白,为下一步对氧磷酶PON1的功能研究奠定基础.     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

钝齿棒杆菌ArgR蛋白的表达、纯化及其多聚体的形成

通过PCR技术从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)AS1.542基因组中扩增得到长度为516bp的argR基因,将其连接到原核表达载体pET22b(+),并转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株BL21(DE3)/pET22b-argR,以异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在33℃诱导8h实现高效可溶性表达,获得了一个分子质量为20kD的融合蛋白ArgR。用纯化后的目的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价高达1:160000。Western blot分析结果表明,L-精氨酸介导重组蛋白形成的多聚体,可与自制的鼠抗ArgR多克隆抗体进行特异性反应,与预期结果一致,表明ArgR通过与精氨酸共孵育形成了多聚体,该结果有助于采用凝胶阻滞方法对ArgR蛋白与钝齿棒杆菌精氨酸生物合成途径中各操作子的结合情况进行进一步研究。     

重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽在大肠杆菌中的表达纯化及功能鉴定

本研究构建了编码重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽基因的原核表达载体pET28a-rhCⅠ,并将其转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。采用PCR的方法扩增重组类人Ⅰ型胶原蛋白肽的cDNA序列,并将其克隆到原核表达载体pET28a上;重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达,并优化表达条件。利用SDS-PAGE和WesternBlot检测表达产物。大量表达重组蛋白,采用镍亲和层析进行纯化,并对纯化后的蛋白进行体外抗氧化研究以及促细胞增殖分析。结果表明,通过大肠杆菌Rosetta(DE3)诱导表达获得了分子量约为40ku的重组蛋白,与预期相符。经镍亲和层析获得纯度较高的蛋白,通过DPPH实验证明其有一定的抗氧化活性;而且MTT实验证实该蛋白可以促进小鼠成纤维细胞3T3细胞的增殖,为其在食品、化妆品和医疗行业的应用提供一定的理论依据。     

蛇毒类凝血酶基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化

将大连蛇岛蝮蛇毒类凝血酶(Gloshedobin)基因克隆到载体pET32-a(+)上,在T7lac启动子下以N端融合硫氧还蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,诱导条件为:30℃诱导6 h,IPTG浓度为1 mmol/L.利用固定化金属离子(Ni2+)亲和层析分别对胞内可溶物和变性条件下的包涵体进行纯化.通过SDS-PAGE检测融合蛋白的纯度,采用点杂交和纤维蛋白凝结活性检测分析,显示纯化产物具有较高生物活性.