RORγt在支气管哮喘小鼠肺组织中的表达及布地奈德对其抑制作用

目的：观察布地奈德（BUD）对支气管哮喘小鼠肺组织中Th17细胞的特异性转录因子RORγt表达的影响,探讨BUD治疗哮喘的机制。方法：采用卵清蛋白（OVA）致敏方法建立支气管哮喘小鼠模型;Balb/c雌性小鼠30只随机分为对照组、哮喘组、BUD组,每组各10只。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)技术检测小鼠肺泡灌洗液（BALF）、血清中白细胞介素-17（IL-17）水平;对BALF中炎性细胞进行计数;苏木精-伊红（HE）染色评价各组小鼠气道炎症程度;逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肺组织中RORγt mRNA表达水平。结果：哮喘组小鼠BALF、血清中IL-17水平较对照组明显升高（P<0.01）,BUD治疗后IL-17水平明显降低（P<0.01）。肺组织中RORγt mRNA在哮喘组较对照组明显升高（P<0.01）,BUP治疗后RORγt mRNA水平明显降低（P<0.01）。哮喘组细胞总数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数均较对照组明显增多（P<0.01）,BUD组细胞总数、中性粒细胞数和嗜酸性粒细胞数与哮喘组比较明显减少（P<0.01）,与对照组比较差异无统计学意义。HE染色表明BUD治疗后气管炎性反应明显缓解。结论：哮喘小鼠RORγt表达水平和IL-17水平增高,导致哮喘小鼠的全身和局部炎症反应增强,可能是导致哮喘发生的机制之一。BUD可通过抑制RORγt和IL-17的表达水平,发挥其免疫抑制功能而起到治疗哮喘的作用。     

哮喘小鼠气道重塑过程中CD4~+CD25~+调节性T细胞和Th17细胞表达的动态变化

目的探讨哮喘小鼠Th17细胞和CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在脾组织中表达水平的变化规律及与气道重塑的关系。方法将SPF级雌性Balb/c小鼠48只随机分为对照组和哮喘组,利用腹腔注射卵清蛋白(OVA)和氢氧化铝混悬液致敏及雾化吸入OVA激发制备哮喘气道重塑模型,对照组应用生理盐水替代。两组分别在雾化2周、4周及8周后的24 h内随机处死8只小鼠,左肺组织病理切片观察肺气道重塑程度;流式细胞仪测定脾组织中Th17、CD4+CD25+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比。结果随着激发时间的延长,哮喘组支气管总管壁面积(Wat/Pbm)及支气管平滑肌面积(Wam/Pbm)逐渐增厚(P0.01);脾组织细胞悬液中Th17细胞水平逐渐升高,与气道重塑的程度呈正相关(P0.01),而CD4+CD25+Treg细胞水平逐渐降低,与气道重塑程度均呈负相关(P0.01)。结论哮喘小鼠气道重塑是动态变化的过程,激发的时间越长,气道重塑越严重,Th17细胞表达越高,CD4+CD25+Treg细胞表达越低,两者间免疫失衡可能是哮喘气道重塑发生的重要因素之一。     

IL-12对小鼠哮喘模型Th亚群和气道炎症的影响

目的观察腹腔注射IL-12对哮喘小鼠Th亚群的调节和气道炎症的影响,并寻找更有效的干预阶段。方法将36只BALB/c小鼠分为4组,每组9只,分别为哮喘组、IL-12干预A组、IL-12干预B组及正常对照组。采用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏加雾化吸入激发的方法制成哮喘模型,正常对照组小鼠同时以等量的生理盐水腹腔注射加雾化吸入。干预A组在致敏和激发阶段均给予IL-12腹腔注射进行干预,干预B组仅在激发阶段给予IL-12腹腔注射进行干预。最后1次激发结束后24h处死所有小鼠,取左肺作病理切片(HE染色),右肺提取总RNA并逆转录成cDNA后,应用半定量RT-PCR法检测肺组织内IFN-γ基因mRNA的转录表达情况,实时定量PCR法检测肺组织内IL-4基因mRNA的转录表达情况。结果与正常对照组相比,哮喘组小鼠肺组织内IFN-γmRNA表达显著减少(P<0.05),IL-4mRNA表达显著增多(P<0.05);与哮喘组相比,IL-12干预A、B组小鼠肺组织内IFN-γmRNA表达均显著增多(P均<0.05),IL-4mRNA表达均显著减少(P均<0.05)。干预A组与干预B组相比,IL-4mRNA的表达水平差异有统计学意义(P<0.05),而IFN-γmRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论IL-12能有效纠正哮喘小鼠失衡的Th亚群及控制气道炎症;致敏、激发阶段同时干预与仅激发阶段的干预均能有效的抑制Th2型免疫反应和气道炎症改变,前者能更有效的降低IL-4mRNA的表达水平。     

热休克因子1对过敏性哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症的影响

目的研究热休克因子1(HSF1)对哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症的作用及可能机制。方法 36只小鼠随机分为对照组、哮喘组、HSF1小干扰RNA阴性对照组(siHSF1-NC)和siHSF1组,每组9只。采用卵清蛋白(OVA)致敏和激发建立哮喘模型,siHSF1-NC组和siHSF1组小鼠于激发前分别气管内给予siHSF1-NC和siHSF1。末次激发24 h后采用肺功能仪测定气道反应性;直接计数法计算嗜酸性粒细胞(EOS)的数目;ELISA法检测血清OVA特异性Ig E的含量及肺组织和支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ的表达水平;实时荧光定量PCR检测HSF1 mRNA的表达水平;Western blot法检测HSF1、高迁移率蛋白族1(HMGB1)和磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)的蛋白表达水平。结果与对照组相比,哮喘组HSF1 mRNA和蛋白表达升高(P0.05);与siHSF1-NC组相比,siHSF1组HSF1 mRNA和蛋白表达降低(P0.05),且HSF1缺失导致气道壁增厚、气道高反应性增强、OVA特异性Ig E含量和EOS的数目增加(P0.05)。与siHSF1-NC组相比,siHSF1组小鼠BALF和肺组织中IL-4、IL-5和IL-13水平升高,IFN-γ表达减少(P0.05);HMGB1和p-JNK表达升高(P0.05)。结论 HSF1缺失加重哮喘小鼠的气道高反应性和气道炎症,其机制可能是通过负调控HMGB1和JNK来实现。     

新生期卡介苗接种对实验性哮喘小鼠肺Th17细胞和IL-17的影响

目的：通过实验性哮喘小鼠模型探讨新生期卡介苗（bacillus Calmette-Guérin,BCG）接种对肺Th17细胞和IL-17的影响。方法：新生期小鼠分3组：对照组,卵白蛋白组（OVA）,BCG干预组（BCG/OVA）。除对照组外,其余两组均给予OVA致敏和激发。观察支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中细胞总数及分类,ELISA法检测BALF中IFN-γ、IL-17含量,流式细胞术检测肺Th17细胞。结果：两哮喘组BALF中细胞总数、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞比例均明显高于对照组,而BCG/OVA组上述细胞均显著低于OVA组。两哮喘组BALF中IFN-γ水平明显低于对照组,IL-17显著高于对照组,同时BCG/OVA组IL-17水平明显低于OVA组。流式细胞术显示,两哮喘组Th17细胞比例均明显高于对照组,但两哮喘组间差异无统计学意义。结论：Th17细胞/IL-17在实验性哮喘小鼠发病中起作用,新生期BCG接种可抑制气道IL-17的产生,其抑制的IL-17可能并非主要由Th17细胞产生,而来源于其他细胞。［中国当代儿科杂志,2010,12（8）：650-653］     

溴化结构域蛋白抑制剂JQ1对哮喘小鼠气道重塑作用机制研究

目的探讨溴化结构域蛋白抑制剂JQ1对哮喘小鼠气道重塑治疗的分子学机制。方法将24只小鼠随机分成对照组、OVA诱导哮喘组(OVA组)、JQ1干预哮喘组(JQ1+OVA组)(n=8)。采用OVA致敏/激发制备哮喘小鼠模型,雾化激发前1h,JQ1+OVA组小鼠经腹腔注射JQ1溶液(50μg/g)。末次激发24h后留取支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织,计算各组BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞百分比,肺组织行病理染色观察各组小鼠肺组织病理改变;采用RT-PCR及Westernblot法分别检测小鼠肺上皮间质转化(EMT)过程中钙黏蛋白(E-Cadherin)、波形蛋白(vimentin)m RNA及蛋白水平的表达变化。结果与对照组比较,OVA组小鼠气道炎性细胞明显浸润,气道壁增厚,黏液渗出增多;BALF中细胞总数增加,嗜酸性粒细胞百分比增多(P0.01)。与OVA组比较,JQ1+OVA组小鼠气道炎症反应明显减轻;BALF中细胞总数明显减少,嗜酸性粒细胞百分比降低(P0.01)。与对照组比较,OVA组小鼠肺组织气道上皮E-Cadherinm RNA及蛋白表达水平明显下调,vimentinm RNA及蛋白表达水平明显上调(P0.01);与OVA组比较,JQ1+OVA组E-Cadherinm RNA及蛋白表达水平升高,vimentinm RNA及蛋白表达水平下降(P0.01);JQ1+OVA组与对照组上述指标表达水平比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 OVA哮喘小鼠存在EMT气道重塑;溴化结构域蛋白抑制剂JQ1可降低哮喘小鼠气道炎症,抑制EMT,减轻气道重塑,为哮喘治疗提供了一个潜在的新方向。     

Th17细胞及其特异性转录因子RORγt在儿童过敏性紫癜发病机制中的作用

目的探讨Th17细胞及其特异性转录因子RORγt在儿童过敏性紫癜(HSP)发病机制中的作用,为儿童HSP的治疗从调控Th17细胞作为切入点提供一条新思路。方法研究对象为2012年2月-2013年3月在我院儿科诊治的初次发病HSP急性期患儿40例,以及同期来我院体检的健康儿童40例,采用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术测定外周血单个核细胞中RORγt mRNA的表达水平;用流式细胞术测定外周血T淋巴细胞中Th17细胞的表达;用双抗夹心ABCELISA技术测定血清IL-17A、TGF-β_1、IL-6浓度。结果 HSP组的Th17细胞(2.75%±0.60%)和RORγt mRNA(1.11±0.51)明显高于对照组的Th17细胞(1.41%±0.29%)和RORγt mRNA(0.65±0.24)(P0.01);HSP组血清IL-17A(40.40±11.81 pg/mL)、IL-6(75.38±27.19 pg/mL)、TGF-β_1(309.41±81.03 pg/mL)与对照组IL-17A(20.32±10.70 pg/mL)、IL-6(25.16±8.31 pg/mL)、TGF-β_1(236.34±66.01 pg/mL)相比明显升高(P0.01);在HSP组Th17细胞表达与RORγt mRNA、IL-17A、IL-6表达呈正相关,相关系数分别为0.887,0.938,0.934(P0.01)。结论急性期HSP患儿存在Th17细胞、RORγt mRNA及IL-17A表达水平升高,提示Th17细胞、RORγt及IL-17A均参与了HSP的发病机制;急性期HSP患儿存在血清TGF-β_1、IL-6水平增高,且Th17细胞表达水平与IL-6表达呈正相关,提示TGF-β_1、IL-6可能通过对Th17细胞的调节参与HSP发病机制。     

哮喘患儿外周血调节性T细胞和 Th1/Th2 的变化及其与哮喘病情的关系

目的：通过测定哮喘患儿外周血 CD4+CD25+Foxp3+ 调节性T细胞（Treg）以及 Th1/Th2 比值变化,探讨其与哮喘病情的关系。方法：150 例哮喘患儿按临床表现分为急性期组 (94 例) 和缓解期组 (56 例), 其中急性期组按病情再分为轻度组 (54 例) 和重度组 (40 例)。应用流式细胞仪检测各组外周血 CD4+CD25+Foxp3+ Treg、CD4+IFN-γ+ Th1 和 CD4+IL-4+ Th2 水平,并与正常儿童（对照组,n=50）进行比较。结果：哮喘组 Treg 水平明显低于对照组 (P<0.01)：其中急性期组 Treg 水平明显低于缓解期组和对照组(P<0.01),重度组 Treg 水平则明显低于轻度组(P<0.01)。哮喘组 Th1/Th2 比值显著低于对照组 (P<0.01)。哮喘急性期组 Th1/Th2 比值显著低于缓解期组和对照组 (P<0.01)。哮喘患儿外周血 Treg 水平与哮喘的病情严重程度呈负相关 (r=-0.737, P<0.01),Th1/ Th2 比值与哮喘病情严重程度亦呈负相关 (r=-0.615, P<0.01),且Treg 的水平与 Th1/ Th2 比值呈正相关(r=0.856, P<0.01)。结论：哮喘患儿外周血Treg 水平明显降低,Th 亚群失衡,提示 Treg 和 Th 免疫在哮喘发病中具有重要作用。外周血Treg 水平与 Th1/Th2 比值可用来评估哮喘病情。     

T-bet在哮喘小鼠中的表达及卡介苗干预的实验研究

目的 研究T-bet在卵白蛋白(OVA)致敏小鼠、哮喘小鼠中的表达及卡介苗(BCG)干预对其表达的影响.方法 雄性昆明小鼠随机分成致敏组、哮喘组、卡介苗干预组和正常对照组.用OVA致敏、激发,建立哮喘模型.免疫印迹法检测肺组织中T-bet蛋白的表达水平,ELISA法测定肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4的水平.结果 致敏小鼠肺组织中T-bet蛋白表达0.463±0.369,较正常对照组小鼠明显下降,哮喘小鼠肺组织T-bet蛋白表达0.658±0.345,与致敏组比较,差异无统计学意义;BEG干预后,肺组织T-bet表达1.322±0.349,较哮喘组明显增加.致敏小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ水平为(15.50±2.25)pg/ml,较正常对照组小鼠明显减少,IL-4为(39.90±2.12)pg/ml,较正常对照组小鼠明显增多;哮喘小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ为(12.64±2.92)pg/ml,与致敏小鼠比较,差异无统计学意义,IL-4为(48.34±3.83)pg/ml,较致敏小鼠明显增多;BCG干预后,IFN-γ明显增多,IL-4明显减少.结论 卡介苗能在转录因子水平促进T-bet表达,从而在转录因子水平纠正Th1/Th2比例失衡,对哮喘起保护作用.     

Tc17细胞在中性粒细胞哮喘小鼠的表达及意义

目的 检测中性粒细胞(NEU)哮喘小鼠肺脏Tc17细胞比例,初步探讨Tc17细胞在NEU哮喘发病机制中的作用。方法 32只清洁级C57B/6小鼠,随机分成NEU哮喘组和对照组。NEU哮喘组用卵蛋白(OVA)和脂多糖(LPS)气道滴入致敏,予OVA雾化激发,对照组用生理盐水致敏和激发。在最后一次雾化结束后24 h,收集支气管肺泡灌洗液(BALF)并检测其有核细胞总数及分类比例,分离肺组织行HE染色,流式细胞术检测小鼠肺脏Tc17细胞与Th17细胞百分比,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF中IL-6、TGF-β、IL-17水平。结果 NEU哮喘组小鼠BALF中有核细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)及中性粒细胞百分比均明显高于对照组(PPr=0.7932,PP结论 NEU哮喘组肺脏Tc17细胞表达增高,Tc17细胞可能参与了中性粒细胞哮喘的发病,IL-17很可能是Tc17细胞在NEU哮喘中发挥作用的方式之一。     

减毒卡介活菌疫苗干预对哮喘小鼠肺GATA-3表达的影响

目的研究减毒卡介活菌疫苗（BCG）干预对哮喘小鼠呼吸道炎症及肺组织GATA-3表达的影响。方法昆明小鼠24只随机分为哮喘组、BCG治疗组、正常对照组。以卵清蛋白（OVA）致敏激发建立哮喘模型,于OVA致敏前及后5 d分别以BCG皮内注射干预。计数肺泡灌洗液（BALF）中的细胞总数及嗜酸性粒细胞（EOS）个数。酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定BALF中IL-4水平。免疫组织化学法观察BCG对哮喘小鼠肺组织GATA-3表达的影响。结果1.哮喘组小鼠BALF中的细胞总数及EOS计数较正常对照组明显增高（Pa〈0.001）,而BCG治疗组BALF中的细胞总数及EOS的计数较哮喘组显著降低（Pa〈0.001）。2.哮喘组小鼠BALF中IL-4的水平较正常对照组明显上升,二组比较差异有显著性（P〈0.01）;而BCG治疗组小鼠BALF中IL-4的水平较哮喘组明显下降,差异有显著性（P〈0.01）。3.BCG治疗的哮喘小鼠其肺部组织GATA-3的表达较哮喘小鼠明显减弱。结论BCG能抑制哮喘小鼠肺组织GATA-3的表达,导致IL-4等TH2型细胞因子的减少,从而减轻呼吸道的炎症反应。     

瞬时电位感受器香草酸受体1在哮喘小鼠气道炎症中的作用研究

目的观察瞬时电位感受器香草酸受体1(TRPV1)通道活性改变对哮喘模型小鼠气道炎症程度的影响。方法将BALB/c小鼠随机分为对照组、哮喘组、辣椒素(TRPV1激动剂)组、辣椒平(TRPV1拮抗剂)组、地塞米松组。采用卵清蛋白-氢氧化铝混合液腹腔注射致敏并雾化激发构建哮喘小鼠模型。辣椒素、辣椒平和地塞米松组分别在每次激发前30min腹腔注射辣椒素(30μg/kg)、辣椒平(10μmol/kg)及地塞米松(2mg/kg)。采用苏木精-伊红染色观察各组小鼠肺部炎症程度;ELISA法检测肺泡灌洗液(BALF)中IL-8和IL-13的含量;Real-Time PCR法检测小鼠肺组织中TRPV1m RNA的相对含量。结果与哮喘组比较,辣椒平组和地塞米松组肺部炎症程度减轻,辣椒素组炎症程度明显加重。与对照组比较,哮喘组、辣椒素组小鼠BALF中IL-13、IL-8含量及肺组织TRPV1m RNA表达明显增加(P0.05);与哮喘组比较,辣椒平组、地塞米松组BALF中IL-13、IL-8含量及肺组织TRPV1m RNA表达明显降低(P0.05),辣椒素组BALF中IL-13、IL-8含量明显增加(P0.05)。结论 TRPV1通道激活剂和通道抑制剂可影响哮喘小鼠肺部炎症程度。地塞米松可能通过调节TRPV1水平减轻气道炎症。     

GATA-3在支气管哮喘小鼠肺组织表达及地塞米松对其抑制作用

目的探讨转录因子GATA-3在支气管哮喘小鼠肺组织中表达及地塞米松（Dex）对其干预作用。方法采用卵清蛋白（OVA）致敏方法建立支气管哮喘小鼠模型;Balb/c小鼠24只随机分为对照组、哮喘组、Dex治疗组各8只。采用免疫组织化学方法检测肺组织GATA-3蛋白表达;反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测肺组织GATA-3 mRNA相对水平;流式细胞技术检测小鼠脾CD4 T细胞白细胞介素-4（IL-4）水平;HE染色评价各组小鼠气管炎性反应变化。结果哮喘组小鼠肺组织GATA-3及mRNA水平、IL-4水平均明显高于对照组（P〈0.05）,Dex治疗组GATA-3阳性细胞数及mRNA水平、IL-4水平均明显低于哮喘组,具有显著性差异（P〈0.05）。HE染色结果表明Dex治疗组气管炎性反应明显缓解。结论GATA-3在支气管哮喘小鼠肺组织呈高表达。Dex可阻断哮喘鼠肺组织GATA-3表达,抑制Th2型细胞因子释放,减轻气管炎性反应。