大肠杆菌多重耐药调控基因marA的克隆及其原核表达

根据GenBank中大肠杆菌的marA基因序列设计引物,以大肠杆菌ATCC25922的基因组为模板,PCR扩增出约384 bp的marA基因片段,将所得片段与pMD18-T simple vector连接,转化至JM109大肠杆菌中,筛选阳性克隆,其质粒中插入序列测序结果与GenBank中报道一致.从阳性克隆中提取质粒,经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶解,回收384 bp目的片段,定向克隆到pET-28a表达载体中,提取质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,获得阳性克隆.经IPTG诱导阳性菌,收集表达产物,通过SDS-PAGE分析证实marA基因得到表达.     

鹅细小病毒延边株VP3基因真核表达质粒构建

用碱裂解法对鹅细小病毒延边分离株进行GPV基因组DNA提取.根据已发表的鹅细小病毒VP3基因序列,设计1对含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的引物,以GPV基因组DNA为模板,应用PCR扩增出VP3基因片段,将VP3基因与克隆载体pMD 18-T连接,转化到感受态大肠杆菌BL21中进行克隆.用EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切该片段并回收该片段,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pVAXI真核表达载体中,获得重组质粒pVAXI-VP3,经PCR鉴定,限制性内切酶双酶切分析和克隆片段序列测定比较,证实了重组质粒的正确性.     

猪肌生成抑制素功能区编码基因的原核表达与纯化

根据猪肌生成抑制素基因设计1对引物,PCR扩增出猪肌生成抑制素功能区编码基因片段,将该片段克隆至pGEM-T载体中。重组克隆质粒经序列分析,克隆序列与目的基因序列完全一致。重组克隆质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,目的基因片段克隆到表达质粒径pGEX-4T-1,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,融合蛋白占菌体可溶性总蛋白的18%以上。     

磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因的克隆与原核表达

[目的]检测磷酸丝氨酸转氨酶(serC)基因在大肠杆菌中能否高效表达.[方法]根据GenBank所公布的serC基因序列设计一对特异性引物,以E.coliJM109基因组为模板PCR扩增目的基因片段,将得到的目的基因定向克隆至大肠杆菌/黄色短杆菌穿梭表达载体pEC7中,构建重组表达载体并转化宿主菌E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析.[结果]通过PCR扩增得到约1 100 bp的DNA片段,经测序后分析该基因与已发表的serC基因具有99.27;的同源性;对重组表达载体进行酶切和PCR方法鉴定正确的命名为pEC7- C;重组表达载体转化宿主菌,SDS-PAGE分析可见约41 kD与理论大小一致的目标蛋白条带.[结论]重组表达载体转化后E.coli BL21中蛋白表达量比原始菌株的蛋白表达量高,证明 serC基因在E.coli BL21(DE3)中成功表达,为进一步构建L-丝氨酸高产基因工程菌奠定了基础.     

伪狂犬病毒粤A株gE基因真核表达质粒的构建

根据伪狂犬病毒(PRV)NLA-3和Rice株的gE基因序列，设计了1对含有起始密码子和HindⅢ、BarnHI酶切位点的引物，以PRV粤A毒株（PRV-YA)基因组为模板，利用聚合酶链反应(PCR)扩增获得gE基因片段，将这一片段克隆至PMDl8-T载体中，获得重组质粒PMID18-gE；用HindⅢ和BarnHI酶切该重组质粒，回收得到含有以上2个酶切位点粘端的gE基因，将此基因片段克隆至相同酶切、回收后的pcDNA3．1( )真核表达载体中，获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-gE，经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

脑特异性分子标志物vsnl1基因的克隆及原核表达

从健康BALB/c小鼠脑组织提取总RNA,逆转录获得cDNA.根据GenBank公布的视锥蛋白样基因1(vsnl1)基因序列设计引物,以鼠脑cDNA为PCR模板扩增vsnl1.将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切和测序鉴定重组质粒pMDT-v.将vsnl1基因亚克隆至6×His原核表达载体pROEX-HTb,转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达和Ni-NTA柱纯化,并采样进行SDS-PAGE分析.结果表明:RT-PCR扩增产生了与vsnl1大小吻合的目的片段,测序及BLAST比对提示与已公布序列的同源性为99%,将序列提交GenBank.SDS-PAGE显示,经IPTG诱导,重组质粒pROEX-v转化菌表达了约22ku的蛋白,与预期分子量大小一致.     

坏死梭杆菌白细胞毒素基因SH片段的克隆与表达

坏死梭杆菌白细胞毒素是坏死杆菌病的主要致病因子,白细胞毒素基因（lkt）是其编码基因。以分离到的国内牛源坏死梭杆菌FN（A）菌株F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增白细胞毒素基因SH片段,克隆至pMD18-T载体上,以BamHⅠ和HindⅢ酶切的目的片段SH与相应酶切的pET32a载体连接构建pET32a-SH重组表达质粒,经转化E coli BL21（DE3）后用IPTG进行蛋白诱导,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况。结果表明：扩增基因序列大小为1800bp,SDS-PAGE检测重组蛋白有效表达,表达得到大小为80.2kDa的目的蛋白,采用镍柱亲和层析方法纯化SH重组蛋白,获得了纯度达95%的重组蛋白;经West-ern-blot证实,该蛋白对抗坏死杆菌阳性血清具有反应活性。     

金黄色葡萄球菌多药耐药基因norA的克隆及其原核表达

按金黄色葡萄球菌多重耐药转运蛋白NorA的编码序列设计引物，以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，扩增出norA基因中1155bp cDNA片段，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到感受态大肠杆菌JM109中，成功地筛选到阳性克隆，其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒，经Nde Ⅰ和XhoⅠ酶切，回收1155bp目的片段，定向克隆到pET28a（＋）表达载体中，转化感受态大肠杆菌DH5a，提取质粒，再次转化到BL21（DE3）中，成功地筛选到阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌，通过SDS-PAGE检测出norA基因的表达。     

致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌外膜蛋白A前体蛋白的克隆表达

以致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌分离株G8107菌株基因组DNA为模板,用PCR法扩增ompA precursor基因,PCR产物用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切,酶切产物回收与相同黏性末端的表达载体pET-32a(+)连接构建表达ompA precursor的重组质粒,将此重组质粒转化入表达宿主菌BL21(DE3),抽提质粒,酶切鉴定及测序正确后诱导表达。对转化菌株以IPTG进行诱导后,裂解细菌,离心,上清进行SDS-PAGE鉴定。测序结果显示,ompA precursor基因大小为1 014 bp,编码338个氨基酸残基,蛋白相对分子质量约为36。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,以28℃1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h,该基因表达效果最好。经Western Blot检测,表达的重组蛋白可与抗His标签蛋白单抗反应。     

SARS病毒核蛋白基因的克隆、序列分析及其在E．coil中的高效表达

对SARS病毒核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中已发表的SARS全基因组序列，设计合成了1对特异性引物，对SARS病毒N蛋白基因进行了RT—PCR扩增。将PCR产物纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM—N，进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1269bp，编码422个氨基酸。与Tor2、Urbani和TW1株相比，核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性均为100％。将pGEM—N双酶切．回收目的基因片段并克隆到大肠杆菌表达载体pE328a中，构建了重组质粒pET—N；将其转化表达菌BI21(DE3)用IPTG进行诱导表达。SDS—PAGE结果表明：重组菌可表达相对分子量约为53kD的蛋白。Westem—blotting证实，重组N蛋白可以与SARS免疫血清发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析，重组N蛋白表达量约占菌体蛋白的43％。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA₄提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T : SsXYN载体上,用BamH I和Sal I 双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a : SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

表皮葡萄球菌8-32-B 株aap基因domain B的原核表达

为获得表皮葡萄球菌aap基因domain B片段的原核表达产物,采用PCR方法扩增引起新疆南疆地区奶牛乳房炎的表皮葡萄球菌株aap基因domain B片段,并克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组质粒pET-32a(+)-aap,将重组质粒转化至宿主菌E.coli BL21中诱导表达。结果表明,克隆得到aap基因domain B片段为2 316bp,Aap蛋白分子质量184.5ku。在宿主菌E.coli BL21中表达的最佳诱导时间为4h,IPTG最佳诱导浓度为0.75mmol/L;纯化时洗杂缓冲液中咪唑浓度为40mmol/L,洗脱缓冲液中咪唑浓度为200mmol/L时可以获得单一Aap蛋白。     

同步抑制棉籽 FAD2 1 与FatB基因表达的RNAi载体构建

采用PCR技术,分别扩增获得靶标基因 FAD2 1 与FatB的功能区域片段426与501 bp,通过PCR引物引入特定的酶切位点,采用DNA标准重组技术与Gateway技术相结合的方法,以表达载体pBI121及RNA干扰载体pANDA35HK为基础,利用种子特异性启动子,成功构建出棉籽特异抑制双基因表达的RNAi载体。     

食源性大肠杆菌的PCR检测

为了将PCR技术更好地应用于食品安全检测,利用多重PCR对大肠杆菌uidA基因和7种毒理基因进行扩增,并对人为污染大肠杆菌的水和牛奶进行普通和实时定量PCR限度检测。结果发现,2组多重PCR反应即可完成uidA和7种毒理基因的检测;普通PCR和实时定量PCR检测限度相同,对人为污染水检测限度为2.8×10 cfu/mL, 对人为污染牛奶的检测限度为2.8×10⁴ cfu/mL。     

棉铃虫细胞色素P450家族 CYP6AE14 基因克隆、序列分析及蛋白原核表达

采用同源克隆技术克隆石河子棉区棉铃虫抗性品系的P450家族解棉酚基因 CYP6AE14 。克隆获得的目的基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸。序列分析表明,该抗性品系的 CYP6AE14 有1个氨基酸发生突变,即Y25F;其与烟草天蛾的CYP6AE32同源性较高,达60%。利用原核表达载体pET28 a在大肠杆菌中成功表达棉铃虫P450 CYP6AE14 基因,为进一步的基因功能验证奠定基础。     

致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05 Pfs基因的克隆、功能序列分析及原核表达

采用PCR技术从致羔羊脑炎粪肠球菌XJ05基因组中扩增得到甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)基因的全序列,对其功能序列进行分析,同时与其他细菌相应序列及编码的氨基酸进行同源性分析,构建该基因的原核表达载体,对表达蛋白进行反应原性分析。结果显示:XJ05的Pfs基因全长696bp,与XJ01、XJ08、XJ11,与屎肠球菌TX 2466之间的同源性在99.1%以上,其中,XJ05与V583为100%,且关键的功能序列相同,与肺炎链球菌同源性在55.8%以上、霍乱弧菌同源性在55.0%以上;pfs基因编码231个氨基酸,XJ05、XJ01、XJ08、XJ11与肺炎链球菌、霍乱弧菌、粪肠球菌V583、屎肠球菌TX 2466的同源性在86.43%以上;构建的重组质粒经诱导后表达蛋白分子量为28ku,Western blot检测显示特异性条带。结果表明,表达的融合蛋白具有良好的反应原性。     

PCV2 Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建及淘选

用重组的PCV2Cap蛋白免疫Balb/c小鼠,从免疫小鼠脾细胞中提取总RNA,经反转录后,扩增抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,利用Overlap PCR方法将VH基因和VL基因组装成单链抗体(ScFv)基因,将ScFv基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB-5E中,并将重组载体转化至感受态大肠杆菌TG1中,获得PCV2Cap蛋白的单链抗体文库,经测定抗体库库容为3.58×106。通过辅助噬菌体M13K07拯救,构建鼠源PCV2Cap蛋白的噬菌体单链抗体库。4轮生物淘选后,经ELISA方法检测,最终获得3株能与Cap蛋白特异性结合的噬菌体克隆。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

新城疫病毒Roakin株HN基因的克隆及真核表达载体的构建

克隆新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)Roakin株HN基因,并构建真核表达载体.应用RT-PCR扩增出NDV Roakin株HN基因,将其克隆入pMD18-T载体,并进行了测序鉴定和HN基因的序列分析.然后分别将NDV的HN基因和选择标记基因-二氢叶酸还原酶(dhfr)基因插入到真核表达载体pCI-neo中,通过PCR扩增、酶切分析和测序分析等鉴定所构建的重组真核表达载体.RT-PCR扩增的NDV Roakin株HN序列与GenBank中标准毒株(登录号AY289000)HN序列同源性为99.8%,构建了HN基因的真核表达质粒pCI-HN-D.成功构建了含有NDV Roakin株HN基因和dhfr基因的真核表达载体.     

1型鸭甲型肝炎病毒3D基因的原核表达与多抗制备

根据血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)SH株3D基因序列设计并合成1对特异性引物,通过RT-PCR方法扩增3D基因,将其克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为68 k D,Western blot分析显示该重组蛋白能与多聚组氨酸标签单抗发生特异性反应。将切胶后纯化的目的蛋白免疫ICR小鼠,制备针对重组蛋白的多抗血清,Western blot结果显示制备的抗血清能够与DHAV-1感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,3D基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于3D蛋白的检测,为3D蛋白的功能研究奠定了基础。