不同抗性马尾松接种松材线虫后针叶内化学信号物质的变化

【目的】研究不同抗性马尾松防御松材线虫病过程中针叶内一些信号分子的变化规律,为阐明马尾松的抗性机制提供理论依据。【方法】对经严格程序选育的高抗和易感马尾松在接种松材线虫后第1、3、7、15、30天时针叶内H2O2、O-·2、NO和Ca2+等信号分子含量进行动态监测。【结果】接种松材线虫后,易感马尾松体不同部位均检测到大量松材线虫,而高抗马尾松体内未发现松材线虫。在接种后第1、3和7天,高抗与易感马尾松针叶内H2O2含量显著升高;但高抗马尾松在接种后15天,针叶内H2O2含量逐渐恢复到正常水平,而易感马尾松针叶内H2O2含量仍继续升高,在接种后30天,易感马尾松针叶内H2O2含量约为高抗马尾松的1.77倍。高抗和易感马尾松针叶内O-·2含量在接种松材线虫后1~15天也显著升高,高抗与易感马尾松针叶内O-·2含量差异不显著,且变化趋势一致;接种后30天,高抗马尾松针叶内O-·2含量较前期显著下降,而易感马尾松针叶内O-·2含量仍继续增加。高抗马尾松针叶内NO含量在接种松材线后1~15天与对照差异不显著,仅在接种后30天才显著高于对照。而易感马尾松在接种松材线虫后每个时间点,针叶内NO含量显著高于对照和高抗马尾松。高抗和易感马尾松在接种松材线虫后针叶内Ca2+含量变化趋势基本一致,呈现"升-降-升-降"趋势,但高抗马尾松除在接种后第1、15天针叶内Ca2+含量显著高于对照和易感马尾松外,其他时间点皆保持在正常水平,而易感马尾松针叶内Ca2+含量在任何时间点均显著高于对照。【结论】接种松材线虫后,针叶内H2O2、O-·2和Ca2+均迅速升高,作为信号分子诱导防卫反应,且高抗马尾松能有效控制其在体内的含量,最终恢复到正常生理代谢水平,而易感马尾松不能有效控制,多余的ROS和Ca2+会对植株产生毒害。接种松材线虫后高抗马尾松针叶内NO含量在体内的变化基本不明显,但易感马尾松体针叶内内在每个时间点均积累了过多的NO,不利于植株正常代谢。     

砧木及抗性马尾松松脂组分对松材线虫的响应

[目的]通过对马尾松接种松材线虫,分析接种前后松脂化学组分的变化,为马尾松抗松材线虫病的研究提供理论基础。[方法]以浙江省临海市5年生马尾松无性系为研究对象,提取接种前和接种松材线虫1、7、15 d的不同砧木(马尾松砧木和湿地松砧木)、不同抗性(高抗和易感)马尾松的松脂组分,分析各松脂组分含量及动态变化;利用松脂内所得有效萜类对松材线虫实施外源处理,测定松材线虫存活率。[结果]从不同砧木(马尾松砧木和湿地松砧木)、不同抗性(高抗和易感)马尾松中检出19种主要化学组分,其中,α-蒎烯、β-蒎烯、水芹烯、海松酸、山达海松酸、长叶松酸/左旋海松酸、去氢枞酸、枞酸和新枞酸含量较高。接种松材线虫1 d时马尾松砧木中β-月桂烯含量显著高于湿地松砧木(p<0.05);接种松材线虫7 d与15 d时上述组分含量在不同砧木间无显著差异。不同抗性马尾松中α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、柠檬烯、龙脑、长叶烯、α-石竹烯、反式-β-金合欢烯和新枞酸含量在接种松材线虫后变化规律不同,接种松材线虫1 d时高抗马尾松中α-蒎烯和β-蒎烯含量显著高于易感马尾松;接种松材线虫7 d时高抗马尾松中α-蒎烯、β-蒎烯...     

松材线虫侵染前后马尾松树体内微生物多样性分析

[目的]以浙江省松材线虫病疫区健康和枯死马尾松(Pinus massoniana?Lamb.)为研究对象,探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染前后马尾松树体内微生物群落结构的差异,同时为利用马尾松内生微生物防治松材线虫病积累微生物种质资源.[方法]采用组织分离法、形态学和分子生物学相...     

松材线虫病危害对马尾松营养物质的影响

在福建省闽侯县南通镇建南村坑柄山场,对30年生健康、感染松材线虫病初期和末期的马尾松树干样品的可溶性糖、总糖、蛋白质等营养物质含量进行测定和比较。结果表明:松材线虫病的侵染可导致马尾松树干可溶性糖、总糖、蛋白质含量下降。与健康植株相比,感病植株的可溶性糖、总糖、蛋白质含量均极显著下降;与感病初期的植株相比,感病末期植株的可溶性糖、总糖、蛋白质含量亦极显著下降。     

针叶矿质营养元素与松材线虫病感病的关系

用ＩＣＰ仪测定１０个有代表性种源的马尾松针叶的矿质营养元素,同时对这１０个种源接种松材线虫,结果发现不同种源的抗性差异显著。马尾松不同时期的矿质元素含量与马尾松对松材线虫的抗性关系不一样,其中休眠期针叶内的Ｍｎ,Ｆｅ,Ｃｏ含量与抗性呈正相关,而Ｎｉ含量与抗性呈负相关。     

松材线虫病树早期诊断的研究 Ⅱ.松树品种、接种量及线虫来源对流胶法的影响

１９９７～１９９８年用不同量的松材线虫接种黑松和马尾松,用３个来源的松材线虫接种马尾松,用松材线虫接种７种松树,接种后对松树的流胶情况定期进行观察。结果表明,接种量小的,松树流胶异常出现得晚,全部供试松树流胶出现异常的时间长;用南京的松材线虫接种的松树和用其它来源松材线虫接种的松树相比较,其流胶异常出现得快,全部供试松树表现流胶异常的时间短;感病松树流胶异常出现后,很快全部供试松树均表现异常并死亡。中度感病松树流胶异常出现后,到全部供试松树流胶表现异常的时间长,部分死亡。抗病松树的全部供试植株表现流胶异常的时间长,而且流胶异常的等级低,无松树死亡。虽然各处理中流胶异常的时间不同,但９８％以上的供试松树在感染松材线虫后流胶均出现异常。这进一步证明了流胶法可作为松材线虫病树的早期诊断方法。冬季为清理病死树的最佳时期。     

松材线虫病感病松树中致萎毒性物质的研究

本研究用我国自然感染松材线虫病的15年生以上黑松和马尾松以及人工感染松材线虫病的3年生黑松的木质组织进行萃以和粗提纯，方法为高压蒸煮法和氯仿碱法。生物测定结果显示，有致萎活性的毒性物质仅存在于自然感病未死的黑松和马尾松以及人工感病未死的黑松木质组织中。自然感病死后1年的黑松和马尾松以及健康松树不中含有这些毒性物质。通过气相色谱－质谱联用仪（GC／MS System）对上述木质组织萃取物作定性分析发现，自然感病未死的黑松、马尾松和人工感病未死的黑松有致萎活性的萃取物中均含苯乙酸和2－甲氧基肉桂酸，自然感病死后1年的松树和健康松树中则无。而在健康松树和感病松树中都发现有苯甲醛存在。表明毒性物质与苯乙酸和2－甲氧基肉桂酸有关，苯甲醛则是松树正常的代谢产物。苯乙酸和2－甲氧基肉桂酸均为酚类化合物，是植物体内重要的次生物质。说明感病松树中的毒性物质是松树组织由于松材线虫侵染而产生的异常代谢产物，应称之为致萎毒性物质。     

不同松树感染松材线虫后NO和核酸酶变化与其抗病性的关系

以黑松、马尾松和火炬松为研究对象,对其接种松材线虫后4,12,24,48,72,96和120 h的NO和核酸酶的活性进行测定.3种松树接种松材线虫后,针叶内NO平均含量的积累为火炬松＜马尾松＜黑松,这种差异在12 ～48 h尤为明显;48h后较其割伤处理(CK1)的增加幅度为火炬松＞马尾松＞黑松.同时3种松树接种后的核酸酶变化趋势存在差异,单链核酸酶活性在4～48 h为火炬松＞马尾松＞黑松,而火炬松双链核酸酶活性在4～96h时却一直低于马尾松和黑松,这表明不同松树体内单链或双链核酸酶的活性变化与其抗病性有关.且3种松树在接种松材线虫后,表现出症状的时间顺序为黑松最早,马尾松次之,火炬松最晚.这表明NO和核酸酶的变化与松树感染松材线虫后的病程发展密切相关.     

基于高通量转录组测序筛选马尾松抗松材线虫病相关基因

[目的]研究马尾松抗松材线虫病相关基因,为解析马尾松抗性机理和高抗马尾松早期选择提供理论依据。[方法]对高抗和易感2种马尾松基因型接种松材线虫,在接种后第1、15和30天取样进行转录组高通量测序,通过对高抗和易感马尾松差异基因识别以及富集分析,以筛选与抗松材线虫病相关的组成型差异基因。[结果]对高抗和易感马尾松接种松材线虫后的转录组进行比较,在接种后第1、15和30天分别获得2 866、679和1 657个差异基因,且在接种松材线虫后不同时间点间,共有差异基因相对较少。对差异基因进行GO富集分析,结果显示:在接种后第1、15和30天,最显著的生物学进程是氧化-还原过程,而GO项刺激反应、转录调节以及香叶基二磷酸代谢过程也显著富集。对这几类GO项相关基因进一步分析,发现接种后3个时间点GO项刺激反应中共包括26个R基因,除了2个R基因外,其它R基因表达皆为组成型,在接种松材线虫和对照间差异不显著,而GO项转录调节中仅2个差异基因被nr注释为ERF转录因子,其余为未知基因。接种松材线虫后,ERF转录因子在高抗马尾松上的表达量始终高于易感马尾松上的表达量,且在接种松材线虫和对照间表达量变化不显著,也为组成型基因表达。GO项香叶基二磷酸代谢过程中,GGPPS 3个基因也在高抗马尾松上具有更高表达量,为组成型基因表达。这些基因中TIR-NBS-LRR基因(c65785.graph_c0)、ERF转录因子(c78073.graph_c0)和3个GGPPS基因在高抗马尾松中表达量较高,而在易感马尾松中表达量较低,甚至为0,可作为开发分子标记的候选基因用于鉴定抗性马尾松。[结论]高抗和易感马尾松在接种松材线虫后第1天其表达量差异达到显著水平的基因最多,其中,LRR基因、ERF转录因子和GGPPS与马尾松的抗性相关,部分TIR-NBS-LRR基因、ERF转录因子和GGPPS有望被开发为鉴定高抗马尾松的分子标记。     

马尾松不同种源氨基酸含量与抗松材线虫病的关系

在选出和验证抗病马尾松种源的基础上,研究了马尾松不同抗病性种源的树体内氨基酸含量的差异。结果表明,抗病种源在接种松材线虫前后均比较感种源含有较少的组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等９种游离氨基酸。它们与感病指数均呈正相关,这说明游离氨基酸含量低的马尾松种源抗松材线虫病。１１种固态氨基酸的含量与感病指数有负相关性,说明其含量较高的种源具较强抗病性能。     

马尾松没种源氨基酸含量与抗松材线虫病的关系

在选出和验证抗病马尾松种源的基础上，研究了马尾松不同抗病性种源的树全内氨基酸含量的差异。结果表明，抗病种源在接种松材线虫前后均比较感种源含有较少的组氨酸、苏氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等９种游离氨基酸。它们与感病指数均呈正相比，这说明游离氨基酸含量低的马尾松种源抗松材线虫病。１１种固态氨基酸的含量与感病指数有负相关性。说明其含量较高的种源具有较强抗病性能。     

松材线虫病的潜伏侵染及松墨天牛传播新途径

在南京用松材线虫接种 7种松树 ,于第 2a在无任何症状的松树的接种点上方 10cm处取样 ,分离线虫。结果表明松材线虫病的潜伏侵染现象比较普遍。在不同的松树品种上潜伏侵染现象有所差异。感病黑松和赤松很快死亡 ,只有在接种量小的情况下才有潜伏侵染现象发生。抗病性强的火炬松和湿地松感病后潜伏侵染现象比较普遍 ,并且样品中的线虫量也较高。而抗病性中等的马尾松和刚松感病后潜伏侵染现象的普遍性及样品中的线虫量均处于中等。短针松接种松材线虫后既不枯死 ,也无潜伏侵染现象。松墨天牛传播松材线虫的试验结果表明 ,未携带松材线虫的松墨天牛成虫在松材线虫病松枝上取食后 ,再到健康松枝上取食 ,有传播松材线虫的可能。这些结果表明在松材线虫病新病区清理病死木时 ,应采取早期诊断技术 ,把未表现症状的松树一起清除 ,以达到防治目的。     

松材线虫病的潜伏侵染及松墨天牛传播途径

在南京用松材线虫接种7种松树，于第2a在无任何症状的松树的接种点上方10cm处取样，分离线虫，结果表明松材线虫病的潜伏侵染现象比较普遍，在不同的松树品种上潜伏侵染现象有所差异，感病黑松和赤松很快死亡，只有在接种量小的情况下才有潜伏侵染现象发生，抗病性强的火炬松和湿地松感病后潜伏侵染现象比较普遍，并且样品中的线虫量也较高，而抗病性中等的马尾松和刚松感病后潜伏侵染现象的普遍性及样品中的线虫量均处于中等，短针松接种松材线虫后既不枯死，也无潜伏侵染现象，松墨天牛传播松材线虫的试验结果表明，未携带松材线虫的松墨天牛成虫在松材线虫病松枝上取食后，再到健康松枝上取食，有传播松材线虫的可能，这些结果表明在松材线虫病新病区清理病死木时，应采取早期诊断技术，把未表现症状的松树一起清除，以达到防治目的。     

松材线虫侵染下马尾松针叶miRNA和mRNA的关联表达

[目的]微小RNA(microRNA,miRNA)具有靶向沉默信使RNA(mRNA)表达的功能,是基因表达的负调控因子;研究并明确马尾松在遭受松材线虫侵染下是否存类似的调控模式,对于未来探析寄主植物对病原侵染胁迫下的应激机制及获得调控马尾松抗松材线虫病的miRNA及其靶标mRNA都具有重要意义。[方法]以前期高通量测序获得的松材线虫侵染1、2、3 d的马尾松针叶mRNA和miRNA表达谱为研究对象,采用STEM软件分别分析mRNA和miRNA的表达变化模式,并运用斯皮尔曼等级相关法研究松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA与mRNA的表达关联情况。[结果]松材线虫侵染下的马尾松针叶中的miRNA呈2种显著的表达变化模式,mRNA呈8种显著的表达变化模式,且15个miRNA与其12个靶标mRNA的表达变化模式相反,符合miRNA对靶标mRNA的负调控特点,这些靶标mRNA编码具有识别病原作用的ACRE、CC-NBS-LRR基因等。[结论]松材线虫侵染下的马尾松针叶中miRNA及mRNA均呈多种表达变化模式,且部分miRNA与靶标mRNA的表达变化模式相反,推测其中部分miRNA可能是病原识别基因的负调控因子。     

黑松和马尾松苗受松材线虫侵染后部分化学物质的响应

为研究松材线虫侵染对寄主植物生理生化物质代谢的影响,以黑松和马尾松4 5年生苗为实验材料,测定了接种松材线虫对2种寄主植物的营养物质和次生代谢物质含量的变化及其规律。结果显示:接种松材线虫初期,黑松和马尾松的总糖含量均较高,随接种时间的延长,总糖含量呈不断下降趋势;黑松的可溶性糖含量一直降低并明显低于对照,马尾松的可溶性糖含量在侵染前期与对照相比变化不明显,而15 d后快速降低;黑松和马尾松的可溶性蛋白含量侵染前期均低于对照,后升高,再降低;黑松的单宁含量明显高于对照,马尾松的单宁含量接种第1天略低于对照,第3天后开始升高;黑松和马尾松的总酚含量均在侵染前期高于对照,而后降低。这些物质的变化趋势显示松材线虫侵染不同寄主植物的生理反应。     

无细菌松材线虫对马尾松的致病性

【目的】探讨松材线虫及其伴生细菌在松材线虫病中的作用,为其致病机制研究及病害防治提供理论依据。【方法】以5年生温室健康马尾松盆栽苗为材料,人工接种无菌松材线虫和带菌松材线虫(8 000条·株-1),观察松苗萎蔫情况,并于接种5、10和30天后取茎段横切面观察松脂分泌情况,对接种20天后的茎段组织解剖结构进行显微观察,接种后30天对植株取样进行线虫再分离,统计线虫在树体内种群增殖情况。【结果】无菌松材线虫和带菌松材线虫均能引起5年生马尾松盆栽苗发病,且症状一致,接种35天后致萎蔫率均达到90%,对照植株保持健康状态;茎段横切面观察结果显示,无菌松材线虫接种5天后松脂停止分泌,10天后茎段开始出现少量空洞,30天时空洞化严重;带菌线虫接种5天后尚有少量松脂分泌,10天松脂分泌停止,30天后茎段产生空洞;对照松树松脂分泌正常,茎段横切面完整平滑。石蜡切片结果显示,2组线虫接种致萎蔫松树茎段的组织解剖结构均发生显著变化,皮层及木质部细胞、髓心细胞大多破碎变形,树脂道上皮细胞破碎解体。无菌松材线虫在松苗体内种群增殖速率高于带菌松材线虫,萎蔫松苗体内线虫数量分别为(8 105±5 661)条·g-1和(4 317±1 896)条·g-1,但二者差异不显著(P=0.361 9)。【结论】无菌松材线虫和带菌松材线虫接种均能使5年生马尾松苗发病,无菌化处理未使松材线虫失去对马尾松苗的致病性,松材线虫的致病性与其伴生细菌无关。     

松材线虫侵染对马尾松体内有机酸及酶的影响

以马尾松为实验材料,研究松材线虫侵染对马尾松体内苯甲酸含量、水杨酸含量、苯甲酸羟化酶及水杨酸羟化酶的活性的影响。结果表明：苯甲酸和水杨酸2种有机酸含量与马尾松松材线虫病的病情密切相关,并随着病情的发展,其含量逐渐升高,到病重（第12天）后下降;苯甲酸被松材线虫侵染后的马尾松体内苯甲酸羟化酶的活性持续上升,于病重前（第9天）达到最大,以后持续下降,而水杨酸羟化酶的活性变化不明显。     

松细枝+培养皿法分离镜检松材线虫试验

将松树上的1，2，3龄枯枝或萎枝条切成薄片，置培养皿分离线虫，镜检表明，枯萎松枝条上松材线虫检出率为52．4％，其中马尾松枝条检出率为75.0％，黑松枝条检出率为30．8％；1年生枝条检出率为37．5％，2年生枝条检出率为45．0％；针叶灰色样本检出率为33．3％，针叶枯黄样本检出率为57．1％。检出含有松材线虫的样本共重30．98g，共检出松材线虫39条，平均1．259条／g，其中马尾松样本平均1．093条／g，黑松样本平均1．508条／g。该法可用于松材线虫病的早期诊断和防治。     

松突圆蚧危害对马尾松针叶主要营养物质的影响

通过对被松突圆蚧不同程度危害的马尾松针叶内主要营养物质的测定,表明受害马尾松针叶内总糖和可溶性糖含量随着危害程度的加重先降低后增加;氨基酸含量随着危害程度的加重而下降。研究表明,马尾松针叶内主要营养物质的含量与松突圆蚧的不同危害程度有显著的相关性。     

松材线虫鉴定技术初探

松材线虫病,又称松树枯萎病,是由松材线虫感染松树并导致该树在极短时间内迅速死亡的一种森林生物灾害。此病主要危害松属植物,在河南省主要危害油松、华山松、白皮松、雪松和日本落叶松。松树一旦感病即很难治愈,最快的仅在40多天内即可枯死,因此又被称为松树的“癌症”。目前,世界上已有40多个国家和多个组织都将其列为检疫对象。对松材线虫的鉴定目前除了对感病松树进行外观和生物学判断以外,主要采用对疑似感病松树进行取样,然后对线虫进行分离,在显微镜下进行鉴定的方法进行。