大肠杆菌中一种新类型的超广谱β-内酰胺酶

出现于北京协和医院的一耐头孢噻甲羧肟的临床分离菌株大肠杆菌(E.coli 5518),含有一约7.5kb的耐药质粒,编码产生一种新类型的超广谱β-内酰胺酶(Esbla).除了头霉甲氧噻吩和亚胺硫霉素外,产酶菌株对所测定的多种β-内酰胺类药物都耐药.该菌株耐β-内酰胺类药物的特性可接合传递给E.coli JP559菌株,与之一起转移的还有耐氨基糖甙类和磺胺类药物的特性.β-内酰胺酶抑制剂棒酸能抑制此酶的活性.此Esbla基因既不与SHV-1也不与TEM-1的结构基因片段杂交.     

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(ESbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此ESbla的活性.携带此ESbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的ESbla.     

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(ESbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此ESbla的活性.携带此ESbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的ESbla.     

吉戈菲肠杆菌中SHV-2耐药基因的序列分析

近来一个值得注意的现象,即肠杆菌科中某些菌属对头孢噻甲羧肟(ceftazidime,caz)等三代头孢菌素的耐药有不同程度增长,这是由于细菌产生了超广谱β-内酰胺酶(Esbla),或染色体Ⅰ型酶所致.在我们前一步的研究中,发现一耐caz的Ent.gergoviae菌株,含有一约60kb的可接合转移质粒pC3773.其上有一编码SHV类Esbla的基因,为深入了解此Esbla基因的分子特点,以及酶结构与功能的关系,本文用测定核苷酸序列的方法进行了研究.     

大肠杆菌中一种新类型的超广谱β—内酰胺酶

出现于北京协和医院的一耐头孢噻甲羧肟的临床分离菌株大肠杆菌(E.coli 5518),含有一约7.5kb的耐药质粒,编码产生一种新类型的超广谱β-内酰胺酶(ESbla).除了头霉甲氧噻吩和亚胺硫霉素外,产酶菌株对所测定的多种β-内酰胺类药物都耐药.该菌株耐β-内酰胺类药物的特性可接合传递给E.coli JP559菌株,与之一起转移的还有耐氨基糖甙类和磺胺类药物的特性.β-内酰胺酶抑制剂棒酸能抑制此酶的活性.此ESbla基因既不与SHV-1也不与TEM-1的结构基因片段杂交.     

环状芽孢杆菌C-2几丁酶基因的克隆

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)C-2总DNA经PstI部分酶切后分离2～10kb的片段,插入质粒pUC19的PstI位点,转化大肠杆菌(Escherichia coli),利用几丁质平板从约8000个重组子中筛选到一个几丁酶基因阳性克隆(命名为pCHT1)。用12种限制酶对重组质粒进行的酶切分析表明,重组质粒中的插入片段长3.0kb,其中各有一个KpnI,SacI和SspI位点。把该克隆片段反向插入pUC19的PstI位点所得到的重组子同样具有几丁酶基因表达活性,说明此片段含有一个完整的几丁酶基因,其自身的启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。Southern杂交证实了该片段来自于B.circulans C-2基因组,且以单拷贝形式存在,它不能与来自于其它7株几丁酶产生菌的总DNA杂交。     

青霉素G酰化酶操纵子的负调控因子的研究

青霉素G酰化酶(PA)操纵子的调节基因(pacR)存在于青霉素G酰化酶结构基因(pac)内部Dral-Taql一段约500bp的DNA片段内,此片段内含有2个ORF。2个ORF及其突变体分别克隆到pUC18得到一系列重组质粒,用这些重组质粒转化青霉素G酰化酶产生菌E.coliD816,测定克隆片段对PA表达的影响。如果克隆片段含有具功能的pacR,诱导剂苯乙酸(PAA)不能使由高拷贝却pacR表达的阻抑物全部失活,部分阻抑物结合pac操纵基因,阻碍RNA聚合酶对pac的转录,因此PA的表达量降低。结果表明,阻抑物是由pac结构基因内部的ORF2编码的蛋白因子,pacR即ORF2。RNA—DNA杂交实验证实了pacR在转录水平阻抑pac的表达。     

地衣芽孢杆菌的β－内酰胺酶基因的克隆与穿梭质粒的建造

本文简要报道了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)染色体上的β-内酰胺酶基因的克隆化,及以此基因为基础建造了一批能在大肠杆菌(E．Coli)和枯草杆菌(Bacillus sub-tillis)中都起作用的穿梭质粒的实验。该β－内酰胺酶基因在枯草杆菌中产生大量产物并可分泌到细胞外。     

人生长激素释放因子基因的合成和克隆

本文报道人生长激素释放因子(Leu²⁷,Met⁴⁴)hGRF(1-44)基因的合成和克隆。选用大肠杆菌高效表达所偏爱的简并密码子,用计算机辅助设计合成基因的顺序,用固相亚磷酸酰胺法合成了hGRF的6个寡聚核苷酸片段,长度分别为39至51个桉苷酸,总共141个碱基对。通过酶促连接反应构建完整的hGRF基因,并直接克隆到pUC-19质粒中,克隆的宿主菌为E．Coll JM83。通过抗性筛选、阳性标记筛选、限制酶分析和分子杂交确定阳性克隆株。用M13双脱氧末端终止法对克隆基因序列分析,证实台成和克隆的hGRF基因序列完全正确。     

转查耳酮合酶基因矮牵牛共抑制的研究

查耳酮合酶是花色素合成途径的一个关键酶. 将查耳酮合酶基因(chalcone synthase A, chsA)导入矮牵牛(Petunia hybrida)后, 转基因植株的外源与内源chsA基因一起发生共抑制, 导致花色改变. 将β-葡糖苷酸酶基因(uidA)连在chsA基因下游形成融合基因, 通过土壤农杆菌介导的途径转化矮牵牛. 利用GUS组织染色检测到共抑制的发生具有发育特异性, 在花组织发育时期开始发生, 发生的起始需要内源基因与外源基因的相互作用. RNA原位杂交实验表明, 共抑制的发生没有组织特异性, 且初步表明共抑制发生后, RNA可能是在细胞质中发生降解的.     

几种固氮菌nifA基因片段的同源性分析

参照已知数种固氮菌nifA基因的DNA序列,选择其中间区域的两个保守性较强的序列合成引物,利用肺炎克匠杆菌(Klebsiella pneumoniaef)、棕色固氮菌(Azotobacter vinela-ndii)、巴西固氮螺菌(Azospirllum brasilense)、草螺菌(Herbaspirillum seropedicae)和深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)的总DNA进行聚合酶链反应,结果均扩增出约450bp大小的片段,经证实为各种固氮菌的nifA基因部分片段。 核酸印迹分子杂交结果显示出nifA基因在不同固氮菌中的同源性不强。     

青霉素G酰化酶调节基因的定位

为了定位青霉素G酰化酶的调节基因,从质粒Ppa6克隆了一系列青霉索G酰化酶基因(pac)的片段,将这些重组质粒转化E.coli D816,测定克隆片段对pac表达的影响。如果克隆片段含有完整的调节基因(pacR)。诱导剂不能使由高拷贝pacR表达的阻抑物失活,部分阻抑物结合pac操纵基困,阻碍RNA聚合酶对加pac的转录,因此pac的表达量降低。发酵结果表明,阻抑物可能是由pac结构基因内部的ORFⅡ编码的蛋白因子。     

几丁质酶表达质粒pKChiA和pMChiA的构建及表达*

从质粒pLCHIA中切出含粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescens)几丁质酶基因 (chiA)的 1 8kbHinfI片段 ,将其插入到表达载体pKK223-3强启动子Ptac下游的SmaI位点内 ,构建成几丁质酶表达质粒pKChiA。再用内切酶BamHI从pKChiA质粒中切出 2.1kbPtac ChiA片段 ,并将其重组到质粒pMC71A的单一BamHI位点内 ,构建成另一种几丁质酶表达质粒pMChiA。这两种质粒可在大肠杆菌HB101和JM10     

生孢噬纤维粘菌M229内切葡聚糖酶基因的克隆与表达

生孢噬纤维粘菌(Sporocytophaga)M229可产内切葡聚糖酶(CMCase),外切葡聚糖酶(Avicelase)和β-葡萄糖苷酶(pNPGase)。以质粒pUC8为载体,采用CMC-刚果红法从M229中分离到了一个CMCase基因,导入E.coli JM83中后,其表达CMCase的活力为1.2×10^-2mU/mgpr,最适作用pH和温度分别为6—7和40—50℃。限制性图谱及亚克隆分析暗示,该CMCase结构基因内部     

黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5β-葡萄糖苷酶基因的克隆与表达

以黄单胞菌(Xanthomonas campestris)XA5-5为供体菌,广泛寄主质粒pRK404为载体,在大肠杆菌中克隆了一个β-葡萄糖苷酶基因,重组质粒pLZS1外源片段为1.1kb,将pLZS1接合导入黄单胞菌XA5-5,得到了克隆子XA5-5(pLZS1).以水杨苷为底物,XA5-5(pLZS1)的酶活性大大高于E.Coli JM83(pLZS1).并且质粒在XA5-5中能相对稳定地存在.初步结果表明,所克隆的基因编码的产物对于水杨苷底物有较强的亲和力,并可以在一定程度上降低XA5-5中酶与pNPG底物的亲和力,使其酶活减小.     

GL-7ACA酰化酶表达检测系统的建立

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7ACA)酰化酶能够催化GL-7ACA分解生成 7-ACA ,后者是工业半合成生产头孢类抗菌素所需的重要前体。为了准确地检测GL-7ACA酰化酶及其突变体的表达 ,本研究通过构建一系列质粒载体 ,建立了两个简便有效地测定GL-7ACA酰化酶基因acy表达量的系统 ,从而可对酶的比活力进行定量。我们将两个报告基因 ,即儿茶酚双加氧酶基因 (xylE)和 β-半乳糖苷酶基因 (lacZ)分别置于acy基因的下游 ,使之与acy基因共用一个启动子 ,进行串联表达 ,各自构成一个多顺反子系统。实验证明 ,基因融合后的儿茶酚双加氧酶或 β-半乳糖苷酶的活力可以间接反映acy的表达量。     

浑球红细菌谷氨酸合酶基因(glt)的克隆和图谱分析

利用转座子Tn5随机插入诱变筛选得到12株浑球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)氨同化缺陷突变株(Asm~-)。这些突变株胞内均无GOGAT活性,同时它们均无固氮酶活性(Nif~-),并且具有氮代谢多效性缺失表型(Ntr~-)。将含有Azorhizobium sesbaniae ORS571的完整glt基因的质粒pHB10转入突变株中能互补上述表型。通过筛选携带Tn5的R-prime质粒克隆了glt::Tn5片段。Southern杂交证明所克隆glt::Tn5片段与E. coli的gltBD基因有同源性。用此片段与以pLAFR3为载体所构建的R. sphaeroides 601基因文库进行菌落原位杂交筛选到了携带glt基因的cosmid pLT27。pLT27能互补所有12株R.sphaeroides氨同化缺陷突变株。酶切分析表明在该cosmid中插人的染色体DNA片段大小约为26.5kb。以pRK415为载体亚克隆了4.0kb与10.5kh的pLT27的Hindlll酶切片段,分别命名为pLTRK271与pLTRK272。pLTRK272能互补变种GT6、GT10、GT11,pLTRK…     

琥珀酸弧菌L-天门冬酰胺酶基因的初级克隆和表达

本文以表达型噬菌体λgtll为载体,以及¹²⁵I标记的放射免疫抗体为探针,从EcDR I酶切的琥珀酸弧菌(Vyibrto succinogenes)染色体DNA片段中克隆得到携带天门冬酰胺酶基因的目的片段,在宿主菌E．Coil Y 1090 中得到表达。经酶解和凝胶电泳分析表明该插入DNA片段的分子量为5．8kb．重组DNA感染另一宿主菌E．ColiYl089后所产生的酶蛋白具有L-天门冬酰胺酶活力。用重组DNA(λgt11-AS8)为探针进行southern DNA杂交,琥珀酸弧菌染色体DNA的Ec0R I酶切片段中,出现一条位置在5．8kb处的杂交带,证明我们克隆到的携带L-天门冬酰胺酶基因的目的片段来自琥珀酸弧菌。     

苏云金芽胞杆菌cryⅡ基因的克隆和表达

分离的苏云金芽胞杆菌(Bacillus-thuringiensis)YBT-791对鳞翅目小菜蛾(Plutellaxylostella)有毒力,将其质粒DNA提纯,经HindⅢ酶切后与杀虫晶体蛋白cryⅡ基因探针杂交,显示出分子量分别为5kb和9．4kb两条DNA阳性片段。把5kb的DNA阳性片段克隆到pUCl8的HindⅢ位点上并转化大肠杆菌TGl,经酶切和杂交检测,证明斑点杂交阳性克隆子中含有5kb的cryI片段。把这个含cryⅡ基因的5kbHindⅢ片段进行亚克隆,将4kb的BamHI－Pstl酶切片段插入穿梭载体pXl61中,并用电脉冲法克隆于苏云金杆菌不产伴胞晶体的突变株中,得到产生单一cry Ⅱ基因编码的杀虫晶体蛋白的克隆菌株M一5。经电镜观察,该克隆菌株能形成出发菌YBT－791多种形态伴胞晶体中的一种方形伴胞晶体;经免疫双扩试验,它只能与Cry Ⅱ晶体蛋白抗血清形成沉淀线;经SDS—PAGE电泳,克隆菌的伴胞晶体只含有一种65kDa的晶体蛋白。生物测定结果表明它既对鳞翅目小菜蛾(Piutella xylostella)有毒性,又对双翅目致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)有毒性。