表皮干细胞体外培养体系的初步研究

目的探讨以成纤维细胞Ⅰ型胶原网格模型体外培养表皮干细胞的可行性。方法酶消化法获取细胞悬液，Ⅳ型胶原快速贴壁法分选表皮干细胞，将体外培养的表皮干细胞和成纤维细胞接种于0．01％的戊二醛交联的Ⅰ型胶原上，气-液界面培养2周，免疫组化法、流式细胞仪和细胞周期来鉴定贴壁细胞，共聚焦显微镜和扫描电镜观察细胞材料。结果贴壁细胞CK19和P63阳性表达，β1整合（CD29）表达率为98．57％，CD71表达率为9．05％，94．99％细胞处于静息期，以上均表明该细胞是表皮干细胞，并在Ⅰ型胶原上呈鱼鳞状排列。结论表皮干细胞在Ⅰ型胶原上生长良好，可以生成全层组织工程皮肤。     

胎鼠表皮干细胞的体外分离培养及rAAV2/eGFP转染的研究

目的 对表皮干细胞(ESCs)进行分离培养和鉴定,利用携带绿色荧光蛋白(eGFP)基因的重组腺相关病毒(rAAV)转染表皮干细胞,探索不同滴度rAAV2/eGFP的转染效率.方法 1.获取胎鼠表皮单细胞悬液.2.利用层黏连蛋白(laminin)和Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ)筛选ESCs,在体外进行培养和鉴定.3.将ESCs按5×104个/孔接种入24孔培养板中,按照不同的病毒基因数与转染细胞数之比(MOI)加入所需rAAV2/eGFP病毒,计数绿色荧光细胞数目,并计算转染效率. 结果 1.ESCs对Laminin和Collagen Ⅳ的吸附性很好,克隆形成率较高.2.对ESCs进行β1整合素(Integrinβ1)单抗、角蛋白19(Keration 19,K19)单抗的免疫细胞化学染色,均呈阳性表达.3.利用rAAV1eGFP病毒体外转染ESCs,可稳定表达eGFP.结论 用Laminin和Collagen Ⅳ快速黏附法可从胎鼠皮肤分离和富集ESCs.     

大鼠精原干细胞的筛选与培养

目的:建立大鼠精原干细胞的筛选和培养的方法体系。方法:采用改良的二步酶消化法分离大鼠睾丸细胞,用改进的差异贴壁分选法筛选大鼠精原干细胞,用添加了胶质细胞源神经营养因子(GDNF)、可溶性GFRα1和bFGF的DMEM/F12无血清培养基和大鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养高度富集的大鼠精原干细胞,通过形态观察、标志基因的RT-PCR检测和免疫细胞化学分析鉴定培养细胞的干细胞活性。结果:我们的改良二步酶消化法和差异贴壁分选法能有效的分离和筛选大鼠精原干细胞,这些高度富集的精原干细胞能够存活20 d以上,形成较大的干细胞克隆,并表达精原干细胞的标志基因和具有干细胞活性。结论:成功建立了大鼠精原干细胞的分离、筛选和培养体系。     

不同培养体系对鼠表皮干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨不同培养体系对表皮干细胞增殖、分化的影响,建立理想的调控表皮干细胞增殖、分化的培养体系.方法 酶消化和Ⅳ型胶原快速黏附法获取鼠表皮干细胞.分别在普通培养皿培养、与几丁质膜生物支架材料共培养及以几丁质膜生物支架材料作为载体植入裸鼠体内培养等不同培养体系下观察表皮干细胞生长情况.普通培养和与几丁质膜生物支架材料共培养4周后,对比表皮干细胞克隆形成率的差异.免疫组织化学染色观察表皮干细胞以几丁质膜为载体植入裸鼠体内后4周表皮干细胞的增殖、分化情况.结果 表皮干细胞在普通培养皿培养3d左右,细胞开始克隆增殖;12 d左右融合成片;传代培养后增殖能力逐渐减低,融合成片时间逐渐延长,传代培养3～4代后细胞终末分化,失去增殖能力.几丁质膜生物支架材料培养表皮干细胞,2周后呈棋盘式集落生长,几丁质膜生物支架材料上有大量的表皮干细胞小集落,集落上有大量的增殖细胞附着生长,扫描电镜下见几丁质膜生物支架材料纤维直径约10 μm,以纤维为主,上下两层呈纵横排列成十字孔,孔间有大量表皮干细胞集落.几丁质膜生物支架材料培养表皮干细胞4周后,其克隆形成率明显高于普通培养皿培养[(12.6±2.7)％比(5.7±1.1)％,P＜0.05].表皮干细胞几丁质膜生物支架材料植入裸鼠体内培养4周后,细胞大量增殖形成巢状排列,在表皮干细胞巢周围,可见有类似皮肤附件结构.结论 表皮干细胞在体外普通培养皿培养可增殖生长,但维持增殖时间较短;与几丁质膜生物支架材料共培养,可较长时间地维持表皮干细胞的增殖特性;植入体内后表皮干细胞大量增殖.     

表皮生长因子干预小鼠非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成及向神经元样细胞的分化

背景:非黏附骨髓间充质干细胞在体外可以不断形成成纤维细胞集落形成单位,并且可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞,表现出一定的多分化潜能。目的:探讨表皮生长因子对非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落的影响,及其在体外向神经细胞分化的能力。方法:分离小鼠双侧股骨、胫骨,全骨髓法分离总骨髓细胞,采用反复转移非黏附的骨髓细胞培养法纯化非黏附骨髓间充质干细胞。取第5代总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞,加入含表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞诱导液培养2周。观察非黏附骨髓细胞产生成纤维细胞集落形成单位的能力,表皮生长因子对成纤维细胞集落形成单位的影响,甲苯胺蓝和免疫细胞化学染色鉴定相关蛋白的表达。结果与结论:总骨髓细胞、反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞均能够不断产生成纤维细胞集落形成单位。给予表皮生长因子处理后,非黏附骨髓间充质干细胞成纤维细胞集落形成单位的效率明显增高。诱导2周后,免疫细胞化学染色显示,总骨髓细胞和非黏附骨髓间充质干细胞均表达神经细胞特异性蛋白NeuN和NF-200;经甲苯胺蓝染色在部分细胞中可见神经元特异性标记尼氏体。证实表皮生长因子可有效促进小鼠非黏附骨髓间充质干细胞形成成纤维细胞集落形成单位的效率,经反复转移的非黏附骨髓间充质干细胞能够诱导分化为神经细胞。     

人胚胎成纤维细胞饲养层的制备

背景：极小胚胎样干细胞是近年来发现的一种具有类似胚胎干细胞生物学特性的非造血干细胞,但对其体外培养扩增的方法报道极少。有研究推测,人胚胎成纤维细胞能为人骨髓极小胚胎样干细胞体外培养扩增提供良好的微环境。 目的：从人胚胎躯干中分离、培养人胚胎成纤维细胞,制备人胚胎成纤维细胞饲养层用于人骨髓极小胚胎样干细胞的培养。 方法：利用胰酶消化法从孕5-9周龄人胚胎躯干中分离培养人胚胎成纤维细胞。制作饲养层,使用不同浓度丝裂霉素C处理后,用于培养分选后的人骨髓极小胚胎样干细胞,以细胞形态、生长曲线作为胚胎成纤维细胞和饲养层的评价指标。 结果与结论：从人胚胎中成功分离培养出人胚胎成纤维细胞,该细胞可传代24代以上,且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变。丝裂酶素C低于12 mg/L时,人胚胎成纤维细胞增殖不能完全抑制;高于14 mg/L,人胚胎成纤维细胞可能死亡。12 mg/L丝裂霉素C作用3 h后能较好地抑制人胚胎成纤维细胞的增殖,并且保持其活力约2周,可以在很长一段时间内用作人骨髓极小胚胎样干细胞的饲养层。     

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源集落形成细胞的作用

背景:有研究表明,在卵黄囊造血、胎肝造血和在胚胎干细胞向造血干细胞分化过程中,碱性成纤维细胞生长因子可强烈表达。目的:在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对集落形成细胞产生的调控作用。方法:购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3~5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×104个/cm2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24h之后使用。复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上。在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为2组:对照组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子组)、实验组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+碱性成纤维细胞生长因子组)。各组于培养3,6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法检测Flk-1+细胞表达情况,并用IMAGE-PROPLUS图像分析系统统计阳性细胞数及平均吸光度值。结果与结论:与对照组比较,在拟胚体培养阶段加入碱性成纤维细胞生长因子可显著增加集落形成细胞的数量(P0.01),Flk-1阳性细胞数及平均吸光度值也显著增加(P0.01)。证明碱性成纤维细胞生长因子能够有效地促进胚胎体的扩增以及成血管血液干细胞的产生与增殖。     

猴表皮干细胞的分离和培养

目的： 探索猴表皮干细胞分离纯化和培养方法。 方法: 将猴皮肤标本剪成皮条,加入0.25％胰酶浸泡过夜；然后去除角质层，刮上皮面获取表皮细胞进行培养。取第2-4代的细胞,经消化后，用Ⅳ型胶原黏附法获得为快吸附的表皮细胞。对快吸附的表皮细胞行流式细胞仪、免疫组化和RT-PCR检测。 结果: 快吸附细胞从mRNA转录水平及蛋白表达水平均呈现表皮干细胞的特性：β1整合素、K15和α6整合素阳性，而CD71和K1/K10阴性。 结论: 所采用的分离纯化方法和培养条件适合猴表皮干细胞的分离纯化及生长。     

人表皮细胞分离培养最佳条件的选择

目的 确定表皮细胞分离培养的最佳条件，为进一步将其作为皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法 采用组织块法培养表皮细胞；分别以胰蛋白酶和分散酶分离表皮细胞，有血清培养法和无血清培养法进行表皮细胞的培养，并以克隆形成试验检测细胞存活和生长情况。结果 （1）表皮细胞以分散分离可量在多数基底细胞，且成纤维细胞污染少，而胰蛋白酶得到的表皮细胞少，且混杂有大量的成纤维细胞。（2）组织块法可观察到表皮细胞生长，但成纤维细胞污染严重，且不易得到成片生长的表皮。（3）有血清培养法表皮细胞需在3T3细胞的滋养层上生长，存在3T3细胞污染的可能。（4）无血清培养方法简便易行，更有利于表皮细胞的生长。结论 采用无血清培养法培养表皮细胞条件的最终确定，为进行相关的研究，尤其是皮肤组织工程的研究奠定了基础。     

人胚胎成纤维细胞与小鼠胚胎成纤维细胞生物学特性比较

探讨人胚胎成纤维细胞用于人胚胎干细咆体外长期培养的可行性，以含10％胎牛血清的DMEM(低糖)溶液为培养基，对人胚胎成纤维细胞的生长形态、对胰酶的敏感性、生长曲线及细胞周期进行研究，并与小鼠胚胎成纤维细胞作比较。结果显示，人胚胎成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞在体外均为贴壁生长型细胞，与小鼠胚胎成纤维细胞相比，人胚胎成纤维细胞生长更旺盛，且细胞寿命更长；在室温条件下，对0．25％胰酶更敏感，消化时间不宜超过3min。提示人胚胎成纤维细胞不仅在生长状况上与小鼠胚胎成纤维细胞类似，而且作为人胚胎干细胞体外长期培养的饲养层，在使用期限上优于后者，值得进一步研究。     

大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外分离及培养鉴定

背景：目前椎间盘髓核组织的细胞组成和特性仍未阐明。 目的：旨在建立大鼠椎间盘髓核来源间充质干细胞的体外培养体系,并对其体外多项分化潜能进行鉴定。 方法：体外培养SD大鼠盘髓核来源间充质干细胞,取第3代细胞进行三系诱导分化,将成骨、成脂和成软骨分化作为实验组,基础细胞培养作为对照组。 结果与结论：低密度培养获得的髓核来源细胞早期可形成葵花样细胞集落,克隆样生长。第3代后,细胞形态趋向均一,呈成纤维细胞样生长。成骨诱导28 d,实验组茜素红染色阳性,且RunX2、osteopontin及osteocalcin表达较对照组显著增高(P < 0.05);成脂诱导21 d,实验组油红O染色阳性,C/EBPα及PPARγ2表达较对照组显著增高(P < 0.05);成软骨分化诱导21 d,实验组番红O快绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性,aggrecan和Col2a1表达较对照组显著增高(P < 0.05)。可见成年SD大鼠椎间盘髓核组织中可分离培养出体外呈克隆样生长的细胞群,且有向脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞发生定向分化的潜能。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

体外培养表皮干细胞复合高分子支架原位修复深度烧伤创面的研究

目的探讨表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架体内培养,对Ⅲ度烧伤创面的修复和再生作用。方法（1）表皮干细胞的培养和表征：采用快速贴壁法分离和培养表皮干细胞（Epidermal Stem Cell,ESC）。将表皮干细胞分别在经Ⅳ型胶原蛋白修饰的和未经修饰的培养瓶中,或通过悬浮法培养,研究表皮干细胞的生长特性;以β1整合素和细胞角蛋白CK19免疫荧光染色实验考察细胞表型。（2）活性支架的体外构建和对大鼠Ⅲ度创面的修复作用研究：体外构建成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维活性支架;采取同体对照法,在20只Sprague—Dawley大鼠（sD大鼠）背部制作两个Ⅲ度切痂创面。左侧创面采用体外培养的自体表皮干细胞联合成纤维细胞一丝素蛋白纳米纤维活性支架移植入创面,作为组织工程移植物组;右侧创面采用凡士林纱布敷料覆盖,作为凡士林纱布敷料组。考察组织工程移植物对大鼠Ⅲ度创面的愈合作用。结果以快速贴壁法能够有效地分离得到表皮干细胞,细胞在经Ⅳ型胶原蛋白修饰的培养瓶中生长10d后融合,数目达到5．1×10^5／cm^2。免疫荧光实验表明细胞表面抗原呈β1整合素和角蛋白免疫CK19成阳性,证明分离得到的细胞为表皮干细胞。成纤维细胞能够在丝素蛋白纳米纤维中扩增并分泌细胞外基质,14d后与丝素蛋白纳米纤维形成活性支架。对大鼠Ⅲ度烧伤创面的修复实验表明,组织工程移植物组的创面在第14天和第22天的平均愈合效率为66％和93％,高于凡士林纱布敷料组（32％和69％）,P〈0．05。组织工程移植物组的创面平均愈合天数为21d,低于凡士林纱布敷料组（31d）,P〈0．05。结论通过Ⅳ型胶原蛋白黏附法,能够分离得到表皮干细胞,并且其在Ⅳ型胶原蛋白表面修饰的培养瓶中的生长活力较高。大鼠Ⅲ度创面的修复实验表明,组织工程移植物,即表皮干细胞联合成纤维细胞-丝素蛋白纳米纤维支架,能够修复Ⅲ度创面,再生皮肤表真皮结构完整;并且与凡士林纱布敷料相比,能够提高创面的愈合效率,减少创面的愈合时间。     

胶原凝胶人工皮肤的体外构建

目的 探讨以胶原凝胶为支架材料构建组织工程皮肤的方法.方法 体外分离、培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞,利用本研究所自制胶原蛋白,制备胶原凝胶作为组织工程支架材料;在成功构建人工真皮的基础上,种植表皮细胞,构建人工复合皮肤,运用HE染色与免疫组织化学进行组织学检测.结果 HE染色可见构建的人工复合皮肤具有表皮和真皮双层结构,免疫组织化学染色显示Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白阳性,在形态结构上与正常皮肤相似.结论 培养的人表皮细胞和成纤维细胞种植于胶原凝胶支架行气-液界面培养可构建出具有类似正常皮肤结构的组织工程皮肤.     

组织工程皮肤的构建及组织形态学观察

背景：应用于临床的组织工程皮肤具有血管化速度慢、力学强度差以及无法永久性保留等局限,因此,需要对相关技术环节进行改进以制备一种合适的永久性皮肤替代物。 目的：建立一种构建有活性的双层组织工程皮肤的方法,并对其组织形态学进行观察。 方法：以Ⅳ型胶原和成纤维细胞联合修饰的同种脱细胞真皮基质为支架,与表皮干细胞复合后依次经浸没式培养和气液分离界面培养构建组织工程皮肤,利用光镜和扫描电镜对其组织学特点进行观察和分析。 结果与结论：以表皮干细胞和同种脱细胞真皮基质制备的组织工程皮肤具有表、真皮双层结构,其中表皮由多层不同分化程度的表皮细胞组成,真皮为天然三维孔隙结构,胶原纤维完整,且表皮层与真皮层紧密连接,形成整体结构,可满足全层皮肤替代物的基本组织学要求。     

小鼠阴道黏膜干细胞的分离、富集和鉴定

目的研究小鼠阴道黏膜干细胞的分离、富集和鉴定方法,为干细胞替代疗法或构建人工阴道黏膜治疗先天性无阴道提供依据。方法取7~8周龄小鼠的阴道黏膜上皮,用酶消化培养法原代培养阴道黏膜干细胞(VMSC)。用Ⅳ型胶原黏附法并连续传代分离和富集VMSC。显微镜下动态观察细胞生长特性;苏木精-伊红(HE)染色;透射电镜观察细胞超微结构;荧光显微镜下观察标记滞留细胞(LRC)。免疫组化SP法检测细胞表面标记物(β1整合素、细胞角蛋白19)进行鉴定。结果用酶消化培养法得到原代VMSC,用Ⅳ型胶原黏附法分离到较纯的VMSC,经连续传代,富集到大量VMSC。动态观察发现细胞呈克隆性生长的干细胞特性。HE染色细胞呈椭圆形或梭形、核质比例大等幼稚细胞特征。透射电镜发现细胞呈未成熟细胞特征。荧光显微镜下LRC的核呈亮黄色,标记滞留时间长。免疫组化SP法检测β1整合素和细胞角蛋白19呈阳性表达。结论用酶消化培养法可原代培养VMSC。用Ⅳ型胶原黏附法并连续传代可分离、富集VMSC。免疫组化SP法检测细胞表面标记物可鉴定VMSC。     

小鼠阴道黏膜干细胞的分离、富集和鉴定

目的 研究小鼠阴道黏膜干细胞的分离、富集和鉴定方法,为干细胞替代疗法或构建人工阴道黏膜治疗先天性无阴道提供依据.方法 取7～8周龄小鼠的阴道黏膜上皮,用酶消化培养法原代培养阴道黏膜千细胞(VMSC).用Ⅳ型胶原黏附法并连续传代分离和富集VMSC.显微镜下动态观察细胞生长特性;苏木精-伊红(HE)染色;透射电镜观察细胞超微结构;荧光显微镜下观察标记滞留细胞(LRc).免疫组化SP法检测细胞表面标记物(β1整合素、细胞角蛋白19)进行鉴定.结果 用酶消化培养法得到原代VMSC,用Ⅳ型胶原黏附法分离到较纯的VMSC,经连续传代,富集到大量VMSC.动态观察发现细胞呈克隆性生长的干细胞特性.HE染色细胞呈椭圆形或梭形、核质比例大等幼稚细胞特征.透射电镜发现细胞呈未成熟细胞特征.荧光显微镜下LRC的核呈亮黄色,标记滞留时间长.免疫组化SP法检测β1整合素和细胞角蛋白19呈阳性表达.结论 用酶消化培养法可原代培养VMSC.用Ⅳ型胶原黏附法并连续传代可分离、富集VMSC.免疫组化SP法检测细胞表面标记物可鉴定VMSC.     

胚胎干细胞向表皮样干细胞分化体外条件的研究

目的　探索体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的最佳条件 ,为研究其分化的调控机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法　将小鼠胚胎干细胞与人羊膜共培养 ,以不同的羊膜铺布方式 ,分 4个实验组 :(1)羊膜上皮面向上铺布全孔底 ,(2 )羊膜基底面向上铺放全孔底 ,(3)羊膜上皮面向上铺布半孔底 ,(4)羊膜基底面向上铺布半孔底 ,以未加羊膜为对照组 ,倒置显微镜下观察细胞的生长和形态分化 ,用抗 β1整合素单克隆抗体免疫组化检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。结果　培养 4～ 5d后 ,实验组 (3)中的ES细胞分化为表皮样干细胞 ,细胞呈多边形 ,体积增大 ,排列紧密 ,形成大面积细胞单层 ,而其他各实验组 ,ES细胞虽可分化为表皮样细胞 ,但呈集落生长 ,不形成细胞单层 ;对照组大量细胞死亡 ,形态各异。各实验组的细胞绝大多数呈现 β1整合素阳性 ,而对照组未见 β1整合素阳性细胞。结论　与羊膜共培养可诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞 ,羊膜上皮面向上铺布半孔底的效果最佳     

人胚胎干细胞不同传代方法的比较

目的探讨不同传代方法对人胚胎干细胞生长和分化情况的影响。方法用1mg/mlⅣ型胶原酶和机械切割两种不同的方法传代人胚胎干细胞,比较这两种方法传代的人胚胎干细胞克隆生长和分化情况。结果 1.机械切割法传代的人胚胎干细胞克隆较传统酶消化法生长快速且不易分化。2.传代后的人胚胎干细胞仍然维持胚胎干细胞的特有形态：表达胚胎干细胞表面标记,具有正常核型和多潜能分化能力（在体外形成拟胚体在体内形成畸胎瘤）。结论采用机械切割法传代人胚胎干细胞更利于细胞的培养扩增,且传代后细胞在继续培养中仍可保持干细胞的所有特性。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染骨髓干细胞与韧带成纤维细胞共培养效应

背景：碱性成纤维细胞生长因子在韧带损伤愈合中具有重要作用,细胞因子转染的骨髓间充质干细胞可作为种子细胞应用于韧带组织工程。目的：探讨人碱性成纤维细胞生长因子基因修饰的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞三维共培养后的交互生物学效应。方法：原代培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代后分为3组：对照组、Ad-EGFP组及Ad-bFGF组。各组细胞相应处理后分别与韧带成纤维细胞三维共培养,MTS法检测细胞增殖能力,ELISA法检测各组细胞上清液中碱性成纤维细胞生长因子蛋白水平,RT-PCR检测各组两种细胞中Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白等相关基因mRNA表达量的变化。结果与结论：腺病毒介导的碱性成纤维细胞生长因子可高效转染骨髓间充质干细胞;共培养3,6 d后,与对照组及Ad-EGFP组相比,Ad-bFGF组两种细胞增殖活性增强(P < 0.01);上清液中碱性成纤维细胞生长因子表达明显增高(P < 0.01),韧带成纤维细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白多糖、软骨低聚物基质蛋白mRNA表达均降低(P < 0.01),骨髓间充质干细胞中Scleraxis、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达均明显升高(P < 0.01)。以上结果表明碱性成纤维细胞生长因子转染的骨髓间充质干细胞与韧带成纤维细胞三维共培养促进韧带成纤维细胞增殖的同时抑制了其胶原合成能力,促进骨髓间充质干细胞增殖的同时增强了其向韧带成纤维细胞分化的能力。  中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养

背景:小鼠胚胎干细胞系SF1-G是由雌性C57BL/6小鼠与雄性M.spretus小鼠交配后,取桑葚胚期胚胎在STO饲养层细胞上分离培养获得,STO细胞较昂贵,而由小鼠胚胎成纤维细胞制备的饲养层细胞不仅取材容易,而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比STO细胞要好一些,因此,建立一种适宜SF1-G细胞扩增的培养体系,保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提。目的:建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系;以建立有效的小鼠胚胎干细胞(SF1-G细胞)扩增培养体系。方法:从孕12.5～14.5d的ICR小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞;取3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞,以丝裂霉素C抑制其增殖能力制备饲养层细胞;在饲养层细胞上增殖培养SF1-G细胞;染色体G显带分析法检测SF1-G细胞核型,SF1-G细胞碱性磷酸酶染色和RT-PCR检测Oct4、Nanog基因表达。结果与结论:从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞,以3～5代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞SF1-G呈边界清晰的克隆样生长。染色体核型检测SF1-G保持正常核型,碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性。实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系,并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系,能够在实验室对SF1-G细胞保持正常未分化状态培养。