COX-2通过PI3K/Akt通路调节氧诱导视网膜病变模型中视网膜新生血管的形成

目的 探讨环氧化酶-2(COX-2)调节氧诱导视网膜病变(OIR)模型中视网膜新生血管形成的信号转导机制.方法 将乳鼠随机分为正常对照组、OIR模型组以及COX-2选择性抑制剂NS-398组(每组18只乳鼠).正常对照组小鼠生长于正常空气氧浓度(21%),OIR模型组和NS-398组小鼠于出生后第7天放置于高浓度氧环境(75%)生长,第12天调整氧浓度为正常.NS-398组小鼠于出生后第12～17天每日腹腔注射10 mg/kg NS-398.于第17天,获取3组视网膜标本,采用常规病理学检查在光镜下观察视网膜新生血管的变化;应用免疫组织化学法、Real-time PCR以及West-ern blot技术检测视网膜组织中COX-2、VEGF和PI3K/Akt的表达.结果 正常对照组病理切片未见视网膜新生血管形成,OIR模型组和NS-398组均出现与内界膜相连的新生血管,以OIR模型组为甚.COX-2、VEGF和PI3K/Akt在正常对照组均存在一定表达,在OIR模型组呈强表达,在NS-398组的表达明显低于OIR组,但仍高于正常对照组.3组间COX-2、VEGF的吸光度值、mRNA和蛋白相对量及PI3K/Akt的蛋白相对量两两比较,差异均有显著性意义(均P<0.05).结论 COX-2表达受到抑制后通过下调VEGF的表达减少OIR模型中的视网膜新生血管形成,在此过程中涉及到PI3K/Akt信号通路的作用.     

三七总皂苷通过长链非编码RNA对氧诱导视网膜病变小鼠新生血管的抑制作用

目的:在氧诱导的新生小鼠视网膜病变模型(OIR)中,观察三七总皂苷调节长链非编码RNA(lncRNAs)对视网膜新生血管的抑制作用及可能机制。方法:60只7日龄(P7)的C57BL/6J小鼠双盲法分成4组:A组,正常对照组;B组,OIR组;C组,三七总皂苷组;D组,磷酸盐缓冲液(PBS)组。B、C、D三组建立OIR模型,C组玻璃体腔注射三七总皂苷1μL,D组注射PBS 1μL。视网膜铺片观察视网膜新生血管情况。HE染色计数新生血管内皮细胞核数、免疫组织化学检测VEGF的表达。Real-time PCR检测视网膜组织lncRNA表达水平的变化。Western Blot分析VEGF、Fgf2蛋白表达变化。结果:三七总皂苷组可见极少量的视网膜增生血管,新生血管内皮细胞核数明显减少(P<0. 05)。注射三七总皂苷后lncRNA XLOC＿150632、XLOC＿150636表达明显下调(P<0. 05),XLOC＿122045、XLOC＿100454、XLOC＿170009、XLOC＿122042表达明显上调(P<0. 05)。VEGF和Fgf2的蛋白表达明显减少。结论:三七总皂苷可调节lncRNAs抑制OIR新生小鼠视网膜新生血管的形成。     

miR-20a-5p调节VEGF通路在氧诱导视网膜病变小鼠模型中的作用机制

目的探讨微小RNA(miR)-20a-5p调节血管内皮生长因子(VEGF)通路在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠中的作用机制。方法实验分为正常组、模型组、高氧对照组、miR-20a-5p高表达组,每组24只。除正常组外,其余组小鼠在出生后第7天置于氧浓度(75.00±2.00)%氧箱中建立OIR小鼠模型,连续高氧环境5 d后置于常氧中饲养。高氧环境结束前1 d,高氧对照组玻璃体腔内注射1μL磷酸缓冲盐溶液(PBS),miR-20a-5p高表达组玻璃体腔内注射1μL miR-20a-5p激动剂(miR-20a-5p agomir)(1μmol/L),模型组不进行任何处理。正常组一直置于空气中正常饲养。高氧结束后各组小鼠正常空气再饲养5 d进行实验。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测视网膜组织miR-20a-5p、VEGF、血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1、VEGFR-2表达情况;视网膜铺片观察视网膜血管形态;苏木精-伊红(HE)染色计数视网膜新生血管内皮细胞核情况;免疫组化检测视网膜组织中VEGF阳性细胞情况。结果模型组和高氧对照组在出生第17天自视盘向周围发出的放射状大血管迂回、不规则扩张,出现大量新生血管,且新生血管结构及分布紊乱,周边毛细血管网闭塞; miR-20a-5p高表达组相较模型组和高氧对照组在出生第17天自视盘向周围发出的放射状大血管迂回不明显,血管不规则扩张现象减轻,新生血管明显减少。与正常组相比,模型组、高氧对照组视网膜组织中miR-20a-5p水平降低(P0.05),视网膜血管内皮细胞核数量、VEGF蛋白阳性面积百分比、视网膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA表达水平升高(P0.05);分别与模型组、高氧对照组相比,miR-20a-5p高表达组视网膜组织中miR-20a-5p水平升高(P0.05),视网膜血管内皮细胞核数量、VEGF蛋白阳性面积百分比、视网膜组织中VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2mRNA表达水平降低(P 0.05)。结论升高miR-20a-5p可抑制VEGF通路从而减少OIR小鼠视网膜血管新生,实现对OIR小鼠视网膜的保护。     

血管内皮生长因子mRNA在早产儿视网膜病变模型中的表达及其意义

目的:探讨高氧诱导视网膜病变(OIR)动物模型的建立及动物模型血管内皮生长因子(VEGF)基因的调节变化规律,阐明VEGFmRNA在早产儿视网膜病变模型中的表达及其意义。方法:①将10只7日龄C57BL/6J幼鼠暴露在(75±2)%浓度的高氧状态下5 d,随后在正常氧环境下5 d,作为氧诱导模型组;采用同日龄幼鼠10只作为正常对照组,空气中饲养。分别在出生后第17 d处死幼鼠。视网膜切片HE染色,观察并计数细胞核数目。②将24只7日龄幼鼠作为实验组,分为3个小组。采用同日龄的幼鼠24只作为正常对照组,同样的方法饲养,分别在出生后第12、14、17 d处死幼鼠,采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察各组VEGFmRNA的变化。结果:①视网膜切片苏木精-伊红(HE)染色法行血管内皮细胞核计数,可见正常组仅在少数切片中见到突破内界膜的血管内皮细胞核,平均每张切片数(0.390±0.099)个;高氧组可见到较多的新生血管芽及突破内界膜的血管内皮细胞核,每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核个数平均为(33.590±1.462),差异有统计学意义(P<0.05)。②RT-PCR结果显示,吸氧组新生小鼠第12 d OIR模型组视网膜表达VEGmRNA水平(0.295±0.038)较正常组(0.344±0.047)下降,P<0.05;第14 d OIR模型组视网膜表达VEGFmRNA水平(0.762±0.063)较正常组(0.335±0.032)增高,P<0.05;第17 d OIR模型组视网膜表达VEGFmRNA水平(0.678±0.046)较正常组(0.318±0.044)增高,P<0.05。③第14 d OIR模型组视网膜表达VEGFmRNA水平较第12 d明显升高,P<0.05;第17 d OIR模型组视网膜表达VEGFmRNA较第14 d下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。第17 d OIR模型组视网膜表达VEGFmRNA较第12 d升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。④正常组第12 d、第14 d、第17 d视网膜表达VEGFmRNA水平逐渐下降,经检验差异无统计学意义。结论:①新生C57BL/6J小鼠动物模型制作周期比较短,成功率比较高,是研究视网膜病变的较合适模型。②苏木精-伊红染色可明显显示视网膜突破内界膜的血管内皮细胞核数,且造模组和对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。③不同时间点,OIR模型组与正常组以及各OIR模型组之间,VEGFmRNA的表达均有显著性差异(P<0.05),高氧环境抑制VEGFmR-NA的表达,而高氧后的相对低氧可促进VEGFmRNA的表达。④推断在小鼠出高氧箱当天这个时间点,给予抗VEGF治疗,有可能在一定程度上减少早产儿视网膜病变的发生。     

TLR4-/- 抑制小鼠氧诱导视网膜新生血管生成的作用机制

目的通过建立氧诱导视网膜血管病变（OIR）模型,探讨Toll样受体4(TLR4)在视网膜新生血管中的作用及其机制。方法使用7日龄新生TLR4基因敲除（TLR4-/-）C57BL／6J小鼠和7日龄新生C57BL／6J小鼠建立OIR模型。分别于小鼠第12天（P12）、17天（P17）和21天（P21）时通过小鼠视网膜荧光灌注铺片观察新生血管面积,评估新生血管情况。通过免疫荧光染色,观察TLR4在小鼠视网膜中的表达情况。通过Real-Time PCR检测两组OIR小鼠P12和P17视网膜组织中核因子-κB(NF-κB)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和促炎因子白细胞介素-6(IL-6)的mRNA表达水平。结果在OIR模型中,通过视网膜荧光灌注铺片发现P12两组小鼠视网膜出现无血管区,P17均出现无血管区和新生血管簇,而且新生血管面积达到最高峰。P12、P17和P21时,TLR4-/- OIR小鼠中的视网膜新生血管面积均明显比正常OIR小鼠减少,差异有统计学意义（P<0.05)。通过免疫荧光检测发现TLR4在小鼠视网膜上广泛表达,与未建立OIR模型的正常小鼠相比,在P17时正常OIR小鼠视网膜的TLR4表达明显升高。对比正常OIR小鼠,TLR4-/- OIR小鼠视网膜组织的NF-κB、VEGF和促炎因子IL-6的表达水平明显降低,差异均有统计学意义（P<0.05)。结论TLR4在视网膜新生血管形成过程中起到重要作用,TLR4基因缺失通过抑制NF-κB信号通路,减少血管生成因子和炎性因子的释放,抑制OIR小鼠视网膜新生血管的生成。     

尼莫地平与生长因子对视网膜新生血管形成的相互作用

目的:研究钙通道拮抗剂尼莫地平与血管内皮生长因子(VEGF)及血小板洐生生长因子(PDGF)在视网膜新生血管形成中的相互作用.方法:将SD幼鼠随机分为5组:正常对照组,模型组,球后注射药物大剂量组、中剂量组及小剂量组.建立高浓度氧气诱导的SD幼鼠增殖性视网膜病变模型(OIR),后3组分别双眼球后注射尼莫地平(0.2mg/ml)各10、5、2μl,隔日1次×3次.取实验幼鼠眼球作普通病理切片及免疫组织化学检测,分别检测视网膜新生血管芽内皮细胞数目及VEGF与PDGF的表达.结果:模型组视网膜新生血管芽内皮细胞数目及VEGF和PDGF的表达较正常对照组明显增加(P<0.01),双眼球后注药大、中剂量组较模型组均明显减少(P<0.01),小剂量组则无明显变化.结论:VEGF和PDGF能够促进视网膜新生血管形成,一定剂量的钙通道拮抗剂尼莫地平则能抑制视网膜新生血管的形成.尼莫地平在某种程度上能抑制VEGF及PDGF的表达.     

血小板反应蛋白-1在氧诱导小鼠视网膜病变模型中的表达及意义

目的: 检测血小板反应蛋白-1 (thrombonspondin-1,TSP-1) 在氧诱导视网膜病变 (oxygen-induced retinopathy,OIR) 模型小鼠视网膜中的表达,探讨其在视网膜新生血管中的作用。方法: 随机选取7日龄C57BL/6J新生小鼠40只,分为模型组(n=20)及正常对照组(n=20)。模型组小鼠通过高氧诱导的方法建立OIR模型。于小鼠出生后第7,9,11天时两组各随机抽取5只小鼠,取视网膜组织采用RT-PCR法检测TSP-1 mRNA的表达水平; 并于小鼠出生后第11天时两组随机取5只小鼠,运用荧光造影视网膜铺片对视网膜新生血管进行形态学观察。结果: 出生后第11天时,正常组小鼠视网膜铺片显示视网膜血管分布呈均匀的网状结构,而模型组小鼠视盘周围可见大片无灌注区,视网膜大血管扩张,仅在周边见少量毛细血管分布,为典型的OIR早期表现。出生后第7天,模型组与对照组小鼠视网膜组织中TSP-1 mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05); 出生后第9天,模型组小鼠视网膜组织中TSP-1 mRNA表达水平下降(P<0.05); 出生后第11天模型组小鼠视网膜组织中TSP-1 mRNA表达水平明显低于正常组(P<0.01),且较第9天模型组亦下降(P<0.05)。结论: 在新生小鼠OIR模型视网膜血管生长发育抑制期,视网膜组织中TSP-1 mRNA的表达逐渐下降,提示TSP-1可能作为负调节因子在早期参与视网膜新生血管的形成过程。     

缺氧诱导因子1α反义寡核苷酸抑制早产鼠视网膜病血管内皮生长因子表达及新生血管形成的实验研究

目的:探讨缺氧诱导因子lα(Hypoxia inducible factor,HIF-lα)反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides,ASODN)对新生鼠仔视网膜病变(Retinopathy of prematurity,ROP)视网膜血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表达及新生血管形成的影响.方法:7 d Wistar新生鼠仔分为两组,实验组(n=40)制作ROP动物模型,另设对照组(n=40).两组分别从日龄12、14、16d开始眼内注射HIF-1αASODN或生理盐水(NS).得到5组标本:分别为正常眼(A)、正常眼+ASODN(A1),ROP眼(B),ROP眼+ASODN(B1),ROP眼+NS(B2).分别于12、14、17 d视网膜铺片观察血管发育及增生情况,17 d切片计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数,免疫组化法观察视网膜VEGF和HlF-1α蛋白水平的表达.结果:视网膜铺片显示B组于12 d出现视网膜血管收缩变窄甚至闭塞,视网膜中央部大片无灌注区,14 d视网膜新生血管开始形成,17 d大量新生血管形成.B1组新生血管较B、B2组明显减少.突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数B2组与A,A1组差异有显著性,而B1组与B,B2组有显著性差异.免疫组化结果显示A,A1组毛细血管内皮细胞胞浆中有少许VEGF表达,无HIF-1α表达.B、B2组较A,A1组VEGF在胞浆和胞核中表达明显增加,HIF-1α在胞核中表达.B1组VEGF、HIF一1α在胞核中表达均较B,B2组明显减少.结论:吸入高氧回到常氧可使视网膜缺氧导致HIF-1α表达增加,从而上调VEGF表达促进新生血管形成.用HlF-1αASODN可通过抑制HIF-1α的表达,下调VEGF表达,抑制新生血管形成,可能成为ROP基因治疗的目的基因之一.     

高迁移率族蛋白1和Toll样受体9在氧诱导视网膜病变小鼠视网膜中的表达及作用

目的探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)和Toll样受体9(TLR9)在氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜中的表达及其在OIR发病中的作用。方法将30只7日龄C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为OIR组和对照组,每组15只。对照组小鼠于正常空气中饲养;OIR组小鼠置于含体积分数(75±2)%氧气的高浓度氧箱中饲养5 d,然后再放回正常空气中饲养5 d制备OIR模型。2组小鼠均于出生第17天处死,取眼球,采用视网膜铺片法观察视网膜新生血管形成情况,验证造模是否成功。采用免疫荧光染色和Western blot法检测小鼠视网膜中HMGB1和TLR9蛋白的表达。结果对照组小鼠视网膜完全血管化,自视盘中心向四周放射状均匀分布,血管形态及走形正常。OIR组小鼠视网膜中央处可见血管闭塞区,闭塞区周边可见大量新生血管簇,视网膜血管走形迂曲。免疫荧光染色显示,对照组小鼠视网膜各层间结构整齐,HMGB1蛋白呈红色,主要表达于神经节细胞层,在内核层及外核层可见少量表达;OIR组小鼠视网膜增厚,各层间结构紊乱,组织紧密度降低,HMGB1蛋白在神经节细胞层、内核层、外核层表达。对照组小鼠视网膜中TLR9蛋白(红色)主要表达于神经节细胞层、内核层;OIR组小鼠视网膜中TLR9蛋白在神经节细胞层及内核层的阳性表达增加。免疫荧光染色结果显示,OIR组小鼠视网膜中HMGB1、TLR9蛋白表达显著高于对照组(P<0.05)。Western blot结果显示,HMGB1蛋白印迹条带表达于相对分子质量约25 000区域,OIR组小鼠视网膜中HMGB1蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05);TLR9蛋白印迹条带表达于相对分子质量约125 000区域,OIR组小鼠视网膜中TLR9蛋白相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。结论 HMGB1和TLR9蛋白在OIR小鼠视网膜中表达显著增加,二者可能相互作用共同参与视网膜新生血管形成,促进OIR的发生和发展。     

血管内皮生长因子在早产儿视网膜病变动物模型中的表达

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF)在早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity,ROP)、视网膜新生血管形成中的表达规律.方法:①动物模型制作:将生后7d的健康C57BL/6 J小鼠20只随机分为正常对照组和高氧组,每组10只.正常对照组于正常空气环境中饲养,不做任何处理;高氧组将生后7d小鼠连续放氧箱5d后回到正常空气环境中饲养.两组小鼠均在出生后17 d处死,摘取右眼制作标本,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目来判断ROP模型的制做是否成功.②将生后7d的健康C57BL/6 J小鼠64只随机分为正常对照组和高氧组,每组32只,两组均分别于生后12、14、17、19 d各处死8只,摘取右眼制作标本,免疫组织化学法检测血管内皮生长因子蛋白的表达情况.结果:①HE染色:正常对照组切片中突破视网膜内界膜长入玻璃体的血管内皮细胞核数平均为(1.71±0.472),高氧组突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数为(25.56±2.442),两组比较差异有统计学意义(P＜0.01).②免疫组织化学法见VEGF的表达主要位于视网膜内界膜附近,神经节细胞层,内核层.高氧组视网膜中VEGF的表达12 d最低,14 d已增高,17 d时达到高峰,19 d下降,对照组12～19 d波动不明显.结论:①本实验采用的高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型与早产儿视网膜病变发病原因相似,可重复性高,可进行定量研究,是研究ROP比较理想的动物模型.②VEGF在早产儿视网膜病变模型中的形成过程中,早期高氧使VEGF下调,引起血管退化,而随后的缺氧又使VEGF上调,导致视网膜新生血管形成.因此,VEGF的异常表达,是视网膜新生血管形成的主要原因.