全骨髓接种培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性

[目的]研究全骨髓接种培养大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,及获取的MSCs的生物学特性.[方法]用全骨髓接种和贴壁培养法获取、纯化、扩增Sprague Dawley(SD)大鼠骨髓间充质干细胞.倒置相差显微镜动态观察培养细胞的生长、形态、排列变化.取第3代MSCs,用台盼蓝拒染法检测细胞的活力,Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡,CCK-8法检测细胞增殖能力并绘制生长曲线图,用成骨和成脂诱导分化实验检测MSCs的多向分化能力.[结果]骨髓间充质干细胞具有贴壁生长特性,通过换液、传代的方法可去除悬浮细胞和纯化细胞,传代细胞生长快于原代细胞.MSCs呈长梭形或多角形,胞体上有不规则突起.排列成漩涡状或鱼群状.全骨髓接种培养法获取的MSCs高表达骨髓间充质干细胞表型(CD29、CD44),造血细胞标记(CD45、CD11b)表达率低,细胞活力好、凋亡率低,具有较强的增殖能力及成骨、成脂分化能力.[结论]全骨髓接种加贴壁法培养MSCs方法简便易行,能获取较高纯度的生长增殖状态良好,且具备多向分化能力的骨髓间充质干细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及表型和功能特点

目的 建立体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，探讨其表型和功能特点。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，测定生长曲线，通过形态学观察，细胞化学及免疫细胞化学法分析大鼠骨髓MSCs的表型和功能特点。结果 MSCs属骨髓中单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L-DMEM中，1、3、5代细胞生长曲线基本相同，增殖快，每传代一次细胞约增加2．2倍。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)。加入地塞米松(Dex 10^-8mol／L)、β-甘油磷酸钠(β-GP 10mmol／L)、抗坏血酸(AA50μg／ml)可诱导MSCs分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增高，形成矿化结节。结论 所分离、培养的细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点，建立了体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离冻存及向成骨细胞和软骨细胞诱导分化

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、纯化、增殖、冻存的方法,并观察其体外分化为成骨细胞及软骨细胞的潜能活性.方法 取SD大鼠的股骨及胫骨,冲取骨髓液,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法以及单独用贴壁培养法分离纯化MSC,增殖,并测定其生长曲线.MSC在12.5%DMSO条件下经液氮冻存半年复苏,测其存活率.对第3代大鼠MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨矿化情况.对第3代大鼠MSC进行诱软骨细胞的诱导分化,测定诱导后的细胞表型情况.结果 大鼠MSC为均一的梭形的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强,生长曲线呈S型.MSC于液氮冻存半年后复苏,其存活率为80%.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性显著提高,并出现矿化结节沉积.在成软骨诱导剂作用下,可见细胞由成纤维细胞样的梭形变为椭圆形及肾形,并分泌异染基质,甲苯胺蓝染色呈阳性,表现为软骨细胞分化特点.结论 获得的SD大鼠MSC生长旺盛,增殖能力强.在特定诱导条件下,大鼠MSC体外可定向分化为成骨细胞及软骨细胞,具有成骨及成软骨分化潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与多向分化鉴定

目的:建立体外分离、培养及纯化大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,并对细胞进行形态学观察、表面标志物鉴定及分化潜能检测,为大鼠MSCs进行细胞移植治疗脑损伤的研究奠定基础。方法:用全骨髓贴壁培养法分离、培养、纯化大鼠MSCs,倒置相差显微镜进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物,定向诱导向成脂、成骨方向分化。结果:72小时首次全量换液7天后观察可见呈放射状排列的细胞集落,以梭形细胞为主,细胞规则、生长旺盛,可连续传代10代以上;取3代MSCs流式细胞仪检测,CD90呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达;细胞传代后加入成脂、成骨诱导剂定向诱导分化,油红O染色及茜素红染色均呈阳性。结论:全骨髓贴壁筛选培养法可大量分离、纯化、扩增大鼠MSCs。经诱导鉴定MSCs具有多项分化潜能。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学活性观察

目的建立兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养、扩增的方法，并进行生物学活性观察。方法穿刺抽取新西兰大耳白兔骨髓5ml，通过密度梯度离心法获取MSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第2代细胞用矿化液连续培养后，进行ALP及矿化结节染色。结果体外成功建立兔骨髓间充质干细胞分离扩增传代的方法，能够连续传至8～9代；矿化液培养的细胞ALP及矿化结节染色阳性。结论兔骨髓间充质干细胞能在体外成功培养，具有向成骨细胞诱导分化的特性，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性

目的 观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果,以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞.采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原;经成骨培养液诱导培养后,对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定.结果 分离的骨髓间充质干细胞2 h后贴壁,贴壁细胞平均10 d[]形成克隆,细胞表型稳定.诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,Von.ossa染色可见矿化结节.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞,用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性.     

SD大鼠皮质骨来源间充质干细胞的培养与鉴定

【目的】研究大鼠皮质骨来源间充质干细胞(MSCs)的分离培养及鉴定的方法。【方法】取SPF级体质量60~80 g的SD大鼠3只,运用骨髓贴壁法及胶原酶消化皮质骨法培养间充质干细胞,进行形态学观察、体外增殖能力考察、细胞周期分析、细胞表面抗原免疫荧光鉴定,并采用茜素红染色和油红O染色鉴定所培养细胞的成骨与成脂分化潜能。【结果】胶原酶消化皮质骨法及骨髓贴壁法均能有效分离纯化大鼠MSCs,经形态学、细胞表面抗原免疫荧光鉴定、成骨及成脂分化能力检测证实为间充质干细胞。【结论】自骨髓及皮质骨均能实现间充质干细胞的分离纯化,但皮质骨间充质干细胞来源广泛,原代不受血细胞干扰,是骨髓来源间充质干细胞的很好补充。     

兔自体骨髓间充质干细胞移植修复关节软骨缺损的研究

目的:研究将体外培养的兔骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法, 探讨其作为组织工程化骨的种子细胞的可行性.方法:采用Percoll分离液,从兔的骨髓组织中分离骨髓间充质干细胞,用低糖型的DMEM( Dulbecco's modified Eagle's medium)培养液中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸进行培养.诱导2周后钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达, 诱导4周后VonKos-sa染色检测钙结节形成.结果:第3代兔MSCs呈典型的成骨细胞形态,诱导2周ALP染色阳性率达80%,诱导4周后VonKossa染色可见钙结节形成.结论:经过分离纯化后的兔骨髓基质细胞在体外培养条件下可以分化为成骨细胞.     

大鼠骨髓间充质干细胞原代培养及成骨成脂分化能力染色鉴定

目的：实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养、诱导分化及染色方法,观测骨髓间充质干细胞生物学特性,及其成骨、成脂分化潜能,为后续进行骨髓间充质干细胞基因修饰实验做好准备。方法本实验通过全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察骨髓间充质干细胞向成骨及成脂肪细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨成脂细胞染色鉴定,以探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法、生长规律及向成骨成脂细胞分化的条件。结果(1)通过全贴壁法成功进行了骨髓间充质干细胞原代及传代培养并绘制出第4代细胞生长曲线;(2)通过茜素红染色验证了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;(3)通过油红O染色验证骨髓间充质干细胞的成脂分化能力。结论全贴壁法提取的大鼠骨髓间充质干细胞经传代4次左右可达到一定纯度,在一定诱导条件下,经特定染色方法鉴定,可分化为成骨细胞,成脂细胞。     

同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养及多向分化潜能鉴定

目的 探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞在体外的共培养,并行多向分化诱导鉴定。方法 分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,各传至第3代后,取等量细胞,混合后共培养,共培养之细胞再次传代后,分别进行成骨细胞、成脂肪细胞诱导,并分别行碱性磷酸酶、Von Cossa及油红染色鉴定。结果 全骨髓直接培养法原代细胞形态不均一,但是增殖能力好;密度梯度法分离得到的细胞较为均一,但增殖力不如全骨髓直接培养法。经过3代传代后,细胞均可获得相对纯化。共培养细胞增殖力较好,细胞形态较为均一,且未出现因免疫排斥导致的细胞死亡。共培养之大鼠骨髓间充质干细胞分别经诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞形态（分别经碱性磷酸酶、Von Cossa染色和油红染色证实）。结论 采用全骨髓直接培养及密度梯度离心法,经3-5代培养后均可获得相对纯化之骨髓间充质干细胞。同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养生长良好,不发生免疫排斥,证实该类细胞的免疫原性极低。在体外,大鼠骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,表明它具有多向分化潜能。