大豆EST-SSR标记开发及与Genomic-SSR的比较研究*

本研究对458220条大豆EST序列进行SSR搜索,共检测出EST-SSR序列39989条, 经拼接得到无冗余EST-SSR序列8190条,包括357种重复基元。其中二、三核苷酸重复基元类型居多,分别占无冗余EST总数的11.13%和16%,统计得到二核苷酸重复类型12种,三核苷酸重复类型60种。以含有简单重复序列的无冗余EST序列设计200对引物,其中148对引物有清晰且单一条带扩增产物,以30份大豆品种资源进行引物筛选,获得多态性引物31对。以21份大豆不同基因型的基因组DNA为模板选取30对显示多态性的大豆EST-SSR引物和30对大豆基因组SSR引物进行扩增,带型统计结果显示：大豆EST-SSR与基因组SSR在供试基因型间多态性指数均值分别为0.55 和0.44,二者揭示的多态性水平差异不大。从而说明利用生物信息学方法基于大豆EST开发SSR标记是切实可行的,大豆EST-SSR可以用于大豆遗传多样性分析,是大豆DNA分子标记体系的一个重要补充。     

基于转录组的剑麻SSR标记开发与筛选

本研究基于剑麻转录组测序获得的70 110条Unigene序列,采用MISA 1.0软件查找SSR位点,利用Primer 3.0设计SSR引物,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其中的100对SSR引物有效性进行验证。总计获得了13 175个SSR位点,SSR的分布频率为15.61%。70 110条Unigene序列总计包括60种重复基元,其中单核苷酸重复为主导重复类型（37.96%）,其次是二核苷酸重复和三核苷酸重复,比例分别为32.92%和27.90%,四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重复所占比例总计为1.21%。A/T、AG/CT和AGG/CCT分别为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复的优势基元。100对SSR引物中有68对引物可扩增出目标产物,其中18对引物在6份剑麻种质中表现出多态性,该结果为利用SSR分子标记技术开展剑麻种质资源鉴定、遗传多样性分析等奠定基础。     

大豆EST序列长度与SSR特性的关系

为了分析大豆EST-SSR的特征和比较其不同长度EST序列中的SSR特性,从NCBI下载了大豆EST序列,应用SSRIT搜索SSR,分析了20 183个无冗余的EST序列,发现了1747个EST序列(8.66%)含有SSR,长度超过400 bp的EST序列含SSR的比例为10.05%,而长度在400 bp以下的EST序列SSR的比例为4.74%.二核苷酸和三核苷酸SSR是大豆EST-SSR的主要类型,分别的60.45%和37.04%,最常见的SSR基元是:AT、AG、AAT、AC、AAG、ACG.在1798个EST-SSR中,51.45%的长度大于12 hp,13.35%长度大于20 hp.推断NCBI大豆EST数据库中含有12 3527个SSR,大豆EST-SSR可用于大豆分子标记,具有重要的开发价值,为有针对性设计EST-SSR引物奠定基础.     

芒果转录组中SSR位点信息分析与引物筛选

利用MicroSAtellite软件分析筛选芒果转录组中的SSR位点。结果表明,在54 207条Unigene中共搜索得到4 103个SSR位点,出现频率为7.57％。其中,三核苷酸重复为主导重复类型,占SSR总数的38.19％,其次是单核苷酸重复（26.91％）。AG/CT和AAG/CTT分别是二核苷酸和三核苷酸重复的优势基元。根据SSR侧翼序列共设计6 915对SSR引物,随机挑选了230对进行PCR检测,获得93对多态性引物。由此可见,芒果转录组数据可以作为大量开发SSR标记的资源,这些SSR标记也将有助于芒果遗传多样性和种质资源鉴定的研究。     

三七基因组SSR位点分析和多态性引物开发

本研究通过分析三七(Panax notoginseng)基因组中简单重复序列(simple sequence repeats,SSRs)位点信息,对基因组中SSR位点的分布特征进行描述,并开发多态性引物,为评价三七遗传多样性和群体结构提供理论依据。利用MISA软件对重新组装的三七基因组进行SSR位点搜索,primer3设计引物。用随机合成的200对引物,在16个三七单株中进行PCR扩增,来筛选具有多态性的引物。在去除冗余序列后组装得到2.39 Gb大小的三七基因组中总共识别到314 060个SSR位点,SSR分布频率为0.13/kb,其中占主导地位的是二核苷酸重复基序,占所有重复基序类型的68.55%,其次是三核苷酸56 250(17.91%)和单核苷酸22 475(7.16%)。在二核苷酸为主的重复类型中,出现频率最高的是AT/AT重复基序占所有二核苷酸重复的63.66%,最低的是CG/CG重复基序占0.15%。同时,在单核苷酸重复中出现频率最高的也是A/T重复类型(79.01%)。经过多态性筛选最终得到41对多态性较好的引物,PIC值范围为0.11~0.78,平均值为0.46。本研究获得的大量SSR位点信息为三七全基因组SSR标记的开发,三七分子标记辅助育种以及遗传多样性分析提供方便。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、 品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR 搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。 基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主 导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核 苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个 SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物 表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12 个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实用性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及 其相关近缘物种的遗传变异。     

基于转录组测序的油梨 EST-SSR 引物开发

利用转录测序技术,开发油梨表达序列标签-简单重复序列（EST-SSRs）,为 SSR 标记在油梨种质资源鉴定、品种选育及遗传连锁图谱构建奠定基础。采用 Illumina 二代测序的技术,共获得 37 639 条无冗余的序列,对其进行 SSR搜索,共获得 6 419 条简单序列重复（SSR）。利用 Primer 3.0 软件设计 SSR 引物,并以 11 份油梨种质筛选多态性引物。基于转录组序列开发出的 EST-SSR 的分布频率为 17.05%。在油梨 EST-SSR 中,单核苷、二核苷和三核苷的重复占主导,占总数的 99.07%。单、二、三核苷酸重复单元分别占总 SSR 的 37.47%、31.80%和 29.80%;出现频率最高的二核苷酸重复基元是 AG/CT,占总数的 29.15%,出现最高的三核苷酸重复基元为 AAG/CTT,占 12.01%。随机选择 315 个SSR 位点合成引物,经 11 份油梨种质筛选鉴定,227 对引物可扩增获得产物,有效扩增率为 72.06%;其中 34 对引物表现出良好多态性,占有效引物的 12.78%,占总引物的 10.79%。在 34 对多态性引物中,每对引物扩增等位基因数 2~12个。利用高通量测序开发 SSR 引物有较好的实性,开发获得的 34 个具有多态性的油梨 SSR 标记可用于研究油梨及其相关近缘物种的遗传变异。     

大麻SSR标记的开发及指纹图谱的构建

表达序列标签（expressed sequence tags,EST）是开发SSR标记的重要资源.本研究从NCBI中大麻EST数据库中检索到1114个SSR,分布于989条EST序列中,占EST总数的7.66％.其中三、六核苷酸重复基元类型居多,分别占EST-SSR总数的39.84％和34.56％,统计得到三核苷酸重复类型47种,六核苷酸重复类型113种.利用部分EST-SSR序列设计49对SSR引物,其中40对引物有扩增产物,占所设计引物总数的81.63％.进一步用这些引物在24个大麻品种进行多态性检测,29对引物显示多态性,占可扩增引物的72.5％.利用E-7、E-8、E-11、E-18、E-21、E-39及E-48共7对引物构建了24份供试材料的SSR指纹图谱.本研究结果证明了基于大麻EST信息建立SSR标记是一种有效而又可行的方法,并且为这些品种的真伪鉴定和保护提供科学依据.     

剑麻斑马纹病菌EST-SSR标记开发与评价

剑麻斑马纹病是剑麻生产中具有破坏性的一种真菌病害。本研究从Gen Bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest)中随机下载10 525条寄生疫霉EST序列,经过去冗余处理后得到5 519条无冗余EST。利用MISA(MIcro SAtellite identification tool)软件进行SSR发掘,从中共搜索到199个1~6碱基SSR,其中三核苷酸重复基元类型最多,共鉴定到55个,占SSR总数的27.6%;其次是二核苷酸重复基元类型和单核苷酸重复基元类型,分别鉴定到51和47个,各占所鉴定SSR总数的25.6%和23.6%。进一步分析表明,AG/CT二核苷酸重复基元类型为优势重复类型,占二核苷酸SSR总数的76.5%。而AAG/CTT和AGC/CTG 2个基元类型在三核苷酸中出现频率最多,分别为15和11次,分别占三核苷酸SSR总数的27.3%及20.0%。从鉴定的199个SSR中,选取含有SSR的合适区段设计了22对引物,并通过18个剑麻斑马纹病菌菌株的基因组DNA进行了评价,结果只有其中9对引物能从剑麻斑马纹病菌基因组DNA中有效扩增,其扩增移效率为40.9%。由此表明,利用此方法来开发剑麻斑马纹病菌的分子标记具有可行性,只是存在一个转移效率问题。     

剑麻茎腐病菌基因组SSR标记开发

下载Aspergillus niger ATCC 1015菌株全基因组序列,利用GRAMENE网站提供的SSR鉴定工具SSRIT(Simple Sequence Repeat Identification Tool),并按含有2~10个碱基重复、碱基数在18 bp以上的SSR基元为标准进行SSR鉴定。结果从A.niger ATCC 1015全基因组中,共发现4 000个2~10碱基SSR,其中含9个碱基重复基元类型最多,共有1 433个,占所鉴定SSR总数的35.8%。其次为6个碱基重复基元类型,共有753个,占SSR总数的18.8%;接着为3个碱基重复类型,共有547个,占13.6%。从鉴定出来的SSR中,选择含有SSR的合适区段,从中设计了36对引物,对剑麻茎腐病菌17个菌株的基因组DNA进行了PCR检测,发现这些引物都能从剑麻茎腐病菌基因组DNA中有效扩增。由此表明,黑曲霉ATCC 1015菌株基因组SSR在剑麻茎腐病菌基因组中具有通用性。这为研究剑麻茎腐病菌群体遗传变异、多样性和进化,定位和克隆功能基因等提供了分子标记。     

转HAL1基因大豆侧翼序列分析及特异性检测方法研究

为方便HAL1转基因大豆的研究和检测,以转HAL1基因大豆T3代基因组DNA为模板,使用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法分离其外源基因插入位点的侧翼序列,获得了插入片段DNA序列(T-DNA)的左翼序列和右翼序列。通过比对大豆基因组序列确定其整合位点,确定了HAL1基因的T-DNA在大豆基因组1号染色体非编码区49468395位点以单拷贝插入,转基因事件不影响大豆基因组功能基因的正常表达,而且在200 mmol·L~(-1)NaCl盐胁迫下转基因植株生长力明显强于对照材料。蛋白定量检测结果表明,在叶片中蛋白含量最高可达0.03 mg·g~(-1),在根茎花中也有表达,但是含量较低。根据整合位点处的左右侧翼序列设计两对特异性PCR检测引物,PCR检测结果显示只有转HAL1基因大豆阳性材料才能扩增出926和816 bp DNA片段。本研究建立的转HAL1基因大豆特异性定性检测方法,对转基因大豆的研究具有重要的意义,也为大豆转基因受体材料的管理与检测提供参考。     

Assessment of PCR-based simple sequence repeats to fingerprint North American potato cultivars

Seven primer pairs flanking di- and tri-nucleotide repeat sequences, identified from previously sequenced regions of the potato genome, were examined for their potential use in DNA-fingerprinting of thirty-nineSolanum tuberosum subsp. tuberosum cultivars (released between 1861 and 1988) and one diploidS. phureja breeding line. Of the simple sequence repeats (SSRs), the primers for six SSRs amplified DNA sequences within the potato genome between cultivars for a total of 14 bands. The polymerase chain reaction (PCR)based amplification products generated from each primer pair consisted of 1 to 2 bands per cultivar but band variation among cultivars demonstrated up to 4 bands per SSR. A similarity matrix generated from five SSRs was able to distinguish 24 of the 40 cultivars. However, when the potato cultivars were grouped by tuber type (round white-skinned, long white-skinned, russetskinned, red-skinned, and yellow flesh) only five pairs of cultivars remained indistinguishable: Atlantic/Katahdin, Belchip/Wauseon, Red LaSoda/Bliss Triumph, Red Pontiac/Norland, and Burbank/Spunta. Although SSRs did not generate unique fingerprints for all of the North American genotypes examined, the potential to discriminate most cultivars should increase as additional SSRs are identified in potato.     

大豆苯丙氨酸代谢途径关键酶基因的挖掘定位及结构分析

利用大豆基因组物理图和遗传图的整合图谱,应用blast软件将基因序列与大豆基因组数据库进行比对,完成了9个大豆天冬氨酸代谢途径中关键酶基因的定位以及结构分析。结果表明:9个基因分别定位在大豆的13个连锁群D1a、B1、N、I、O、C1、C2、F、L、A2、J、D1b以及B2上,并获得了基因所在序列两侧标记。利用大豆的cDNA和gDNA序列信息,获得了9个基因的结构,外显子数目为5～12个,内含子数目为4～11个。     

转基因大豆插入位点分析及特异性PCR检测方法的建立

采用TAIL-PCR方法研究转基因大豆外源基因LEC1插入位点序列特征,并根据此特征建立了LEC1转化事件特异性检测方法。依据正义表达载体上T-DNA区段侧翼序列设计特异性引物和简并引物,获得4个同源序列。对获得的序列进行Blastn分析发现,p69、p148、p225均为载体T-DNA区段一部分,未见大豆基因组序列;P217插入片段的序列分析表明,该序列长863 bp,其中T-DNA左边界序列长143 bp,720 bp为大豆基因组片段,与大豆光系统II类囊体膜蛋白(Thylakoid membrane proteins)的206-926区段同源性为99%,这表明,外源DNA插入了大豆基因组中类囊体膜蛋白编码区的206位。根据分离的序列建立事件特异性定性检测方法,扩增片段大小为277 bp。该事件特异性检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因大豆品种LEC1的身份识别提供了有效的方法。     

大豆乙酰羟基酸异构还原酶基因GmAHRI的克隆与分析

基于电子克隆获得的大豆GmAHRI基因cDNA序列编码区设计特异引物,以高异亮氨酸大豆品种“和龙早熟豆”总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1764 bp的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定.测序结果显示:GmAHRI基因家族有2个成员,分别命名为GmAHRI1( FJ594399.1)和GmAHRI2( JN...     

油菜EST资源的SSR信息分析

从NCBI公共数据库获得63334条油菜EST，通过前处理得到全长为12165.38kb的无冗余EST 17987 条。共在这些序列中搜索出2803个SSR，分布于2443条EST中，出现频率是15.58%。这些EST-SSR的平均长度为18.84bp，平均分布频率是1/4.34kb。二核苷酸重复和三核苷酸重复是主要的类型，二者出现的频率基本相近，占总SSR的近89.05%。AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复类型，分别占二、三核苷酸重复的84.04%和35.71%，同时对这些SSR的可用性进行了评价。     

甘蔗EST-SSR标记的开发和多样性分析

运用生物信息学分析方法对甘蔗(Saccharum spp.)的282 809条表达序列标签(ESTs)进行分析,共获得Unigene 138 590条,发掘出分布于10 086条Unigene的10 505个微卫星(EST-SSR)位点,SSR发生频率为7.26%,平均9.22 kb出现1个SSR。在7个杂交甘蔗品种中,三核苷酸基元的SSR数量最多(74.95个/Mb),其次为二核苷酸基元的SSR(22.95个/Mb),二者占总数的90.27%。以CCG/CGG、AG/CT为重复基元的SSR是最常见的EST-SSR类型,富含G/C的EST-SSR占据极明显的优势。与拟南芥和水稻cDNA序列内SSR的比较表明,富含G/C的SSR可能是禾本科植物SSR的一个共同特点。研究发现,SSR在EST与基因组序列之间以及在不同甘蔗品种之间的分布存在差别,具有丰富的多样性。此外,从EST数据分析获得杂交甘蔗品种的16个保守基因,从中发掘了9个SSR位点。最后,利用Primer3和e-PCR软件设计了一批具有物种特异性和通用性的EST-SSR PCR引物,相关数据可以通过http://59.50.66.49/SSR/sugarcane/sugarcane.EST-SSR.tgz链接从因特网下载。该研究结果可为开展甘蔗遗传多样性分析、种质资源鉴定和分子辅助育种提供参考。     

基于水稻基因组序列SSR的多态性分析

 根据Monsanto公司所发布的6655个序列\[由简单重复序列(SSR)及其两翼各100个碱基组成\]，通过生物信息学的方法，找到了在籼稻(Oryza sativa subsp. indica)品种93 11与粳稻(Oryza sativa subsp. japonica)品种日本晴的基因组序列中匹配最好的1453个同源位点。在这些位点中，93 11和日本晴中分别搜索到了1449个和1451个SSR。通过对SSR的分类比较，发现在93 11和日本晴的相同位点存在1175个具有相同基序的SSR，其中371个具有相同的基序和重复个数，804个具有相同的基序但重复次数有差异。具有相同基序但重复次数有差异的SSR类型中，频率最高的是2个核苷酸的重复子，占62.94%，基序为5个和6个核苷酸的SSR则较少。对水稻这两个品种相应区域SSR的多态性比较分析，揭示了用这些特定类型的SSR可以在这两个品种的特定区域发展新的SSR标记，并为研究这两个品种之间遗传变异、基因组功能之间的差异等提供依据。