兔核移植胚胎的克隆研究

本研究改进了兔受体卵母细胞的去核程序及供体卵裂球的处理方法，并对核移植胚的体外克隆、继代克隆及克隆胚的体内发育进行了试验。结果表明：卵龄对受体卵母细胞的去核具有显著的影响，卵龄为１５～１８ｈ的去核率为１００％（４５／４５），显著高于１３～１４ｈ的４６．６％（７／１５），Ｐ＜０．０１。ＤＮＡ合成抑制剂Ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ处理１６－细胞期卵裂球后，重组胚的囊胚发育率５４％（２０／３７）高于未处理组的４５％（１４／３１），Ｐ＜０．０５。从２枚１６－细胞供体胚分别获得来自一个供体胚的９枚和７枚核移植克隆囊胚，囊胚发育率为５１．６（１６／３１）。然而第一次继代核移植胚的囊胚发育率仅为１１．５％（６／５２）。１６－及３２－细胞期卵裂球的重组胚可发育至产仔，共获２窝８只仔兔。其中１只、２只、２只和３只仔兔分别来自４个供体胚。     

核移植前激活受体卵子对牛核移植卵体外发育的影响

本研究探讨了核移植前对受体卵子进行激活、细胞融合开始时间及供体受精卵细胞周期调节对核移植卵体外发育的影响。其结果显示核移植前对受体卵子激活组的细胞融合率与对照组没有差异 ,但重组胚胎的卵裂率、8～ 16细胞期胚胎及囊胚的发育率比对照组明显提高 ;核移植前激活的受体卵子分别在卵子体外成熟开始的第30h和 4 5h与供体细胞进行细胞融合 ,结果 ,30h组的细胞融合率和卵裂率与 4 5h组没有差异 ,但发育到 8～ 16细胞期及囊胚的发育率均比 4 5h的高 ;将供体受精卵用诺考达唑 (Nocodazole)处理后 ,进行核移植的结果 ,处理组的细胞融合率、卵裂率、发育到 8～ 16细胞期和囊胚的发育率与对照组无差异     

供体细胞对绵羊转基因体细胞克隆胚胎体外发育影响的研究

研究比较了转入不同外源基因、转同一基因的不同细胞克隆、供体细胞的培养代数及冷冻对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育的影响,旨在为进一步探寻建立供体细胞个性化准备方案,为提高动物克隆效率提供参考。结果表明,转不同外源基因的供体细胞对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育无影响;转同一基因的不同细胞克隆对转基因体细胞克隆羊重构胚体外发育有一定影响,且转TERT基因的不同克隆间的重构胚的融合率及囊胚率差异显著(P0.05)。随着供体细胞培养代数的增加,重构胚体外发育的桑葚胚率及囊胚率无显著影响,但融合率随着培养代数的增加有上升趋势,且差异显著(P0.05);供体细胞冷冻可促进其融合率、桑葚胚率及囊胚率。研究结果表明,供体细胞的不同克隆、培养代数、冷冻等因素对转基因效率有一定的影响。     

体细胞核移植技术在粤东黑猪遗传资源保护上的应用

实验旨在通过体细胞核移植技术（Somatic Cell Nuclear Transfer,SCNT）探究不同品种、性别、细胞代数对猪耳成纤维供体细胞建系效果与体外克隆胚胎效率的影响,为我国优良地方猪种或濒危猪种的遗传资源保护提供新的有效途径。本研究对比分析了粤东黑猪、小耳花猪2个广东省地方猪种以及不同性别的粤东黑猪供体细胞的细胞建系效果,并统计分析了粤东黑猪不同细胞代数制备克隆胚胎的体外发育效率。结果表明,粤东黑猪体细胞冻存可能受个体差异与供体月龄的影响,而体细胞核供体猪个体差异也会导致部分克隆胚胎的卵裂率存在显著差异,但对囊胚率无显著影响。同时本研究也证实,至少在3代（F1～F3）内,供体细胞的不同代数对粤东黑猪克隆胚胎体外发育效率无显著影响。本研究为优秀地方猪种的品种改良、保种提供了可行手段,为地方特色猪种的遗传资源保护奠定了技术基础。     

动物体细胞核移植中供体细胞的选择

影响体细胞核移植效率的因素很多,供体细胞选择是核移植实验成功的基础和关键。本文参考近年来国内外在动物体细胞核移植技术方面的资料,从供体体细胞类型、细胞年龄、细胞传代及细胞周期对克隆效率的影响进行简要综述。     

影响体细胞核移植效率的因素

哺乳动物体细胞核移植 (克隆 )是近年来迅速发展起来的一项新技术 ,对濒危动物保护、优良种畜快速扩群以及核质关系的研究、药物试验等诸多领域都具有重大意义。但体细胞核移植是一项程序繁杂的工作 ,每一步操作所采用的试剂、材料和方案等都会影响到核移植效率 ,因而其影响因素十分众多。文章根据目前已有资料 ,论述了卵母细胞来源、卵母细胞与供体细胞的胞质容量、卵母细胞的去核方案、体细胞供体动物的年龄、供体细胞的组织来源与传代次数及供体细胞的冷藏、冷冻和所处的细胞周期阶段对核移植效率的影响。另外 ,对重组胚的融合 -激活方案、核移植方案及重构胚的培养方案对核移植效率的影响也作了简要论述。     

TSA处理供体细胞对组蛋白乙酰化和核重编程效果的影响

克隆胚胎基因组的不完全重编程是克隆动物成功率低的主要原因.试验中以第5代牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行体细胞核移植,用75 nmol·L-1曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)分别处理供体细胞6、12和24 h,通过核移植检测克隆胚胎发育率,并应用激光共聚焦显微镜技术和流式细胞术检测处理细胞和克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平和细胞周期.结果显示:随着TSA处理时间的延长,供体细胞组蛋白H3K18乙酰化水平不断提高;以75 nmot·L-1TSA处理供体细胞12 h的克隆胚的囊胚发育率显著高于未处理组(23.5%vs 15.7 %,P<0.05);供体细胞经TSA处理的克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平与未处理组相比差异不显著(P>0.5);处理组和对照组细胞G0/G1期和S期比例间存在显著差异(P<0.05).结论:TSA对核供体细胞的处理存在时间效应,75 nmol·L-1TSA处理12 h的牛胎儿成纤维细胞更易被卵母细胞重编程,显著提高了克隆胚的体外发育能力,初步证实TSA是通过提高供体细胞组蛋白乙酰化水平来促进供体细胞重编程的.     

供体细胞的不同处理方法对牛核移植重构胚发育能力的影响

为了研究供体细胞不同的处理方法对核移植重构胚的作用，比较了用于保种的冻存和新鲜的成纤维细胞做供体细胞、供体细胞不同的离心转数、供体细胞不同的血清饥饿时间及用本实验室冻存的成纤维细胞，解冻复苏后，不同传代次数对重构胚的影响。结果表明分别用冷冻保存的和新鲜的成纤维细胞作为核供体，所得重构胚卵裂率、囊胚率无显著差（P>0.05）；供体细胞离心800 r/min时所得重构胚效果较好，离心1500 r/min所得重构胚的卵裂率、囊胚率与其他3组相比较低；血清饥饿3～5 d组所得重构胚比其他3组好；用解冻复苏后再传2、5代的细胞进行核移植，所得重构胚的卵裂率、囊胚率无明显差异(P>0.05)，显著高于传8代的细胞所得重构胚。说明供体细胞的不同处理方法对核移植重构胚发育有很重要的影响。     

水牛原生殖细胞核移植的研究

以水牛原生殖细胞（PGCs）为核供体,成熟水牛卵母细胞为受体,采用电融合法和胞质内直接注核法对水牛PGCs的核移植进行了研究。从水牛胎儿的生殖嵴或生殖腺分离得到PGCs,在胎儿成纤维细胞饲养层上传代培养后,进行核移植。结果显示,当采用电融合法时,PGCs核移植的融合率、分裂率、囊胚率和总囊胚率均显著高于胎儿成纤维细胞（P〈0．05）;当采用直接注核法进行核移植时,PGCs的核移植囊胚率显著高于胎儿成纤维细胞（P〈0．05）。但分裂率差异不显著（P〉0．05）。结果表明,水牛PGCs细胞是理想的核移植供体细胞。     

骨髓间充质干细胞为核供体的克隆绵羊的生产与鉴定

本研究旨在采用骨髓间充质干细胞（BMSCs）为核供体进行体细胞核移植,以获得成体干细胞克隆绵羊。选择幼体绵羊BMSCs为核供体,构建重构胚进行克隆胚胎移植,克隆绵羊诞生后,选取IASG上公布的绵羊10个微卫星标记位点,PCR扩增克隆羊、供体细胞及代孕母羊微卫星DNA,利用Quantity One软件进行基因分型,计算供体细胞与克隆羊之间的父子关系相对机会（RCP）值。结果显示,以幼体绵羊BMSCs为核供体,与去核成熟卵母细胞进行核移植,构建重构胚进行电融合,其融合率达80.62%,重构胚发育至桑椹胚阶段,经手术植入20只代孕母羊,获得克隆绵羊5只,成活3只。克隆羊基因型与供体细胞一致,供体细胞与克隆羊之间的RCP≥99.999%,证明克隆羊来自幼体绵羊BMSCs。本试验最终成功获得了首例以BMSCs为核供体的克隆绵羊。     

异种动物核移植研究进展

异种核移植作为新型发展起来的动物繁殖技术 ,在畜牧生产、医学、生物学领域愈来愈表现出其巨大的价值。人们以前已经进行了一系列的探索 ,如在供体细胞方面 ,人们尝试使用了包括肝脏细胞、乳腺细胞在内的各种类型的细胞 ,并采取各种措施处理供体细胞 ;而对于受体细胞多采用卵泡 -卵丘复合体进行体外培养或通过超排获得 ;比较各种融合方法 ,目前多采用电融合方法 ,也较化学融合、病毒介导融合等方法简单 ;至于重构胚的培养则多采用培养液体外培养的方法 ,此方法操作简单 ,也比较容易观察记录实验过程。同时也指出异种核移植仍存在如克隆的效率很低等一系列急待解决的问题     

Effect of donor cell type on nuclear remodelling in rabbit somatic cell nuclear transfer embryos

Cloned rabbits have been produced for many years by somatic cell nuclear transfer (SCNT). The efficiency of cloning by SCNT, however, has remained extremely low. Most cloned embryos degenerate in utero, and the few that develop to term show a high incidence of post-natal death and abnormalities. The cell type used for donor nuclei is an important factor in nuclear transfer (NT). As reported previously, NT embryos reconstructed with fresh cumulus cells (CC-embryos) have better developmental potential than those reconstructed with foetal fibroblasts (FF-embryos) in vivo and in vitro. The reason for this disparity in developmental capacity is still unknown. In this study, we compared active demethylation levels and morphological changes between the nuclei of CC-embryos and FF-embryos shortly after activation. Anti-5-methylcytosine immunofluorescence of in vivo-fertilized and cloned rabbit embryos revealed that there was no detectable active demethylation in rabbit zygotes or NT-embryos derived from either fibroblasts or CC. In the process of nuclear remodelling, however, the proportion of nuclei with abnormal appearance in FF-embryos was significantly higher than that in CC-embryos during the first cell cycle. Our study demonstrates that the nuclear remodelling abnormality of cloned rabbit embryos may be one important factor for the disparity in developmental success between CC-embryos and FF-embryos.     

Factors Affecting the Development of Somatic Cell Nuclear Transfer Embryos in Cattle

Nuclear transfer is a complex multistep procedure that includes oocyte maturation, cell cycle synchronization of donor cells, enucleation, cell fusion, oocyte activation and embryo culture. Therefore, many factors are believed to contribute to the success of embryo development following nuclear transfer. Numerous attempts to improve cloning efficiency have been conducted since the birth of the first sheep by somatic cell nuclear transfer. However, the efficiency of somatic cell cloning has remained low, and applications have been limited. In this review, we discuss some of the factors that affect the developmental ability of somatic cell nuclear transfer embryos in cattle.     

供体细胞对猪体细胞克隆胚胎早期发育的影响

以中国农业大学实验用小型猪香猪胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞和颗粒细胞3种细胞系为供体细胞进行核移植。比较了血清饥饿法和接触抑制法处理胎儿成纤维细胞诱导进入G0／G1期的效率，发现二者差异不显著（P〉0．05），血清饥饿2d和4d差异不明显，同样接触抑制2d和4d差异也不显著（P〉0．05）。系统研究了影响克隆胚胎发育的供体因素：血清饥饿与否、细胞形态、细胞类型及个体差异等，结果表明：血清饥饿处理对克隆胚的早期发育没有明显的促进作用；圆形光滑细胞有利于细胞融合，对早期发育无显著影响（P〉0．05）；不同个体、不同类型的供体细胞对克隆胚囊胚发育率有一定的影响。     

供体细胞对哺乳动物体细胞核移植的影响

哺乳动物体细胞核移植技术(克隆)在农业、生物技术、医药生产和濒危动物保护等方面具有很大的潜力和应用价值,已成为目前发育生物学研究的重要方法.文章依据近年来国内外在动物克隆技术方面的资料,分析了供体细胞类型、供体细胞动物年龄、供体细胞所处细胞周期、体外传代次数以及供体动物性别等因素对克隆动物效率的影响及可能原因.     

Rabbit oocyte cytoplasm supports development of nuclear transfer embryos derived from the somatic cells of the camel and Tibetan antelope

This study was designed to examine the ability of rabbit metaphase II oocyte cytoplasm to support the development of interspecies nuclear transfer embryos reconstructed using donor nuclei from different species. Skin fibroblast cells from a camel and Tibetan antelope were used as donor nuclei. As a first step, we investigated the efficiency of different activation protocols by comparing the parthenogenetic development of rabbit oocytes. The protocol that yielded the highest blastocyst rate was used to activate the reconstructed embryos in nuclear transfer experiments. In addition, the effect of donor cell serum starvation on the development of the reconstructed embryo was also examined. More than half of the karyoplast-cytoplast couplets could be fused, and about one third of the reconstructed embryos were capable of completing first cleavage, regardless of the species of donor nuclei. Some of the cleaving reconstructed embryos were even capable of progressing further and developing to the blastocyst stage (1.4-8.7% for the Tibetan antelope and 0-7.5% for the camel, respectively). Our results suggest that the mechanisms regulating early embryo development may be conserved among mammalian species and some factors existing in rabbit oocyte cytoplasm for somatic nucleus reprogramming and dedifferentiation may not be species-specific. Rabbit oocyte cytoplasm can reprogram donor nuclei regardless of the origin of the nucleus and support in vitro development to an advanced stage.     

提高哺乳动物克隆效率的研究进展

体细胞核移植技术（somatic cell nuclear transfer,SCNT）又称为体细胞克隆技术,在生物医学、遗传修饰动物研究及大家畜的育种和良种扩繁等领域具有重要的理论意义和现实价值,但目前该项技术依然存在如克隆效率低下、克隆动物表型异常等问题。近年来,研究人员通过在培养基中添加小分子药物、选择优势供体细胞系（包括iPS细胞）、优化传统核移植参数、对发育关键基因（如XIST及H3K9me3去甲基化酶等）的靶向遗传调控等途径,探索提高克隆效率的新思路、新工艺和新方法,作者着重对上述研究进展进行简要综述。     

Nuclear transfer using a bovine mammary epithelial cell line (BMEC)

The developmental potential of nuclei from a bovine mammary epithelial cell line (BMEC) in nuclear transfer was investigated. For nuclear transfer donors, BMEC cells (passage 15) were cultured for 4–5 days after seeding at cell densities of 1.0 × 10⁵ cells/cm² (high‐density group) or 0.8 × 10⁴ cells/cm² (low‐density group). First, the effective electric stimulation for fusion of enucleated oocytes with BMEC cells was examined. Fusion rates reached maximum with two DC pulses of 30 V/150 µm for 20 µs in the high‐density group and with two DC pulses of 25 V/150 µm for 10 µs in the low‐density group. The fusion rate (37.5%) in the high‐density group was significantly (P < 0.005) lower than in the low‐density group (71.4%). Second, the in vitro developmental potential of nuclear transfer embryos derived from BMEC cells was examined. In the high‐density and low‐density groups, 18.8% and 24.1% of fused oocytes, respectively, developed to blastocyst stage. The results of this study indicate that nuclei from BMEC cells support the development of nuclear transfer embryos to the blastocyst stage and that the efficiency of oocyte–cell fusion is affected by the culture conditions of the donor BEMC cells before nuclear transfer.     

转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。     

低氧对牛体细胞体外增殖的影响

本研究通过比较常氧(20%)和低氧(5%)环境下培养牛体细胞的生长效果,进而探讨低氧对牛体细胞体外增殖的影响。选用牛的3种常用核移植供体细胞(胎儿成纤维细胞、胎儿输卵管上皮细胞、卵丘颗粒细胞)分别在常氧和低氧2种培养环境下进行连续传代培养和细胞克隆培养,并对其倍增水平和细胞克隆形成效率作比较分析。结果显示,5%的低氧环境对这3种细胞的体外增殖均有促进效果,而且各细胞的增殖水平(50.61±2.47、16.35±0.43、43.38±0.84)均显著高于常氧组(27.42±0.23、12.14±0.83、32.76±1.53,P<0.01)。以500个·皿-1(直径100mm)的细胞浓度接种培养的情况下,低氧培养的胎儿输卵管上皮细胞的克隆形成效率((53.05±4.62)%)显著高于常氧组((36.68±5.68)%)(P<0.01),而低氧组胎儿成纤维细胞和卵丘颗粒细胞获得的细胞克隆数只是略多于常氧组,差异并不显著(P>0.05)。当以1个.孔-1的细胞浓度接种于96孔板培养时,低氧组各类细胞的单细胞克隆形成效率((21.60±2.37)%、(22.29±5.42)%、(27.92±3.69)%)显著高于常氧组((12.01±1.42)%、(7.92±2.86)%、(10.49±3.07)%)(P<0.01或P<0.05)。将体外培养条件的常氧含量(20%)调减至更接近体内生理状况的低氧含量(5%)可以延长牛体细胞增殖寿命和提高单细胞克隆形成效率,对细胞生长有很好的促进作用。